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液相色譜技術(shù)

Chromatography1可編輯課件PPT背景色譜法也稱色層法，是1906年俄國植物學(xué)家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”（Chromatography)。后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱色譜分離。英國生物學(xué)家Martin和Synge。他們首先提出了色譜塔板理論，以及其遠見卓識的預(yù)言。1944年出現(xiàn)紙色譜以后，色譜法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)薄層色譜、親和色譜、凝膠色譜、氣相色譜、高壓液相色譜（HPLC）等。2可編輯課件PPT色譜法的基本原理色譜法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。3可編輯課件PPT慢中等快色譜分離Temporalcourse淋洗液4可編輯課件PPT22.1色譜的基本概念固定相：固定相是色譜的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動相：在色譜過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱色譜中一般稱為洗脫劑，薄層色譜時稱為展層劑。5可編輯課件PPT分配系數(shù)可由Langmuir方程得出Kd分配系數(shù)q、c溶質(zhì)在固相和液相中的濃度6可編輯課件PPT保留時間（tR）和保留體積（VR）反應(yīng)樣品在柱子中的保留或阻滯能力，是色譜過程的基本熱力學(xué)參數(shù)之一。

7可編輯課件PPT分離度:又稱分辨率，用來表示兩種洗脫曲線相鄰的溶質(zhì)相互分離的程度。兩個相鄰洗脫峰之間的距離與兩個峰寬的代數(shù)平均值.8可編輯課件PPT阻滯因子Rf阻滯因子是在色譜系統(tǒng)中溶質(zhì)的移動速度和標準物（與固定相沒有親和力的流動相Kd=0）的遷移率之比其意義在于體現(xiàn)某一種溶質(zhì)與固定相之間的親和力大小.9可編輯課件PPT洗脫體積色譜柱中，使溶質(zhì)從柱中流出所需流動相體積，為洗脫體積不同的溶質(zhì)，由于和固定相的親和力的不同，洗脫體積也有所差異。10可編輯課件PPT理論板，理論板當(dāng)量高度（HETP），理論塔板數(shù)（N）、

反應(yīng)不同時刻溶質(zhì)在色譜柱中的分布以及分離度與柱高之間的關(guān)系。理論板：將溶質(zhì)達到一次分配平衡的色譜柱段。理論板當(dāng)量高度：該段色譜柱的高度。11可編輯課件PPT理論板數(shù)的計算方法N理論塔板數(shù)tR保留時間W1/2半峰寬Wb峰底寬度理論塔板高度：L柱長12可編輯課件PPT22.2色譜分離方法的分類色譜分離方法很多，種類有四、五十種但常用于生物大分子分離的色譜方法，按機理分，有以下幾種：13可編輯課件PPT14可編輯課件PPT按操作形式不同分類：柱色譜：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離。紙色譜：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。薄層色譜：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙色譜類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定。

紙色譜和薄層色譜主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測分析和少量分離制備，通常為一次性使用，而柱色譜是常用的色譜形式，適用于樣品分析、分離。生物化學(xué)中常用的凝膠色譜、離子交換色譜、親和色譜、高效液相色譜等都通常采用柱色譜形式。

15可編輯課件PPT按分離的壓力高壓色譜中壓色譜低壓色譜按流動相分氣相色譜液相色譜超臨界流體色譜16可編輯課件PPT22.3各類色譜技術(shù)及應(yīng)用

凝膠過濾色譜離子交換色譜疏水色譜聚焦色譜反相色譜超臨界流體色譜羥基磷灰石色譜灌注色譜應(yīng)用17可編輯課件PPT凝膠過濾技術(shù)1)Gelfiltrationchromatography(GFC)原理操作與原理：含有不同組分的溶液，通過網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠粒子(a)，小分子擴散進入凝膠相，大分子被排阻于凝膠相外，加入洗脫劑后溶液向下推移，大分子及剩余的小分子進入下層新的凝膠相中，重復(fù)上述擴散和排阻。這樣最先流出的為最大的分子，最后流出的為最小分子，分段收集可以獲得按分子量大小分布的各組分。分子篩色譜:從上可見，凝膠過濾具有分子篩的作用。18可編輯課件PPT19可編輯課件PPT分子篩凝膠色譜原理20可編輯課件PPT分離關(guān)系：組分0的M最大，不能進入gel，洗脫體積為空隙體積V0；組分t的M最小，能進入到gel的細孔中，其洗脫體積接近柱體積Vt,組分1-2在V0-Vt之間.顯然，GFC能分離洗脫體積在V0-Vt之間的組分。對于組分1和2，兩峰距離分配系數(shù)m影響因素：分子量,分子形狀,gel孔徑結(jié)構(gòu)；與pH,I,T無關(guān).

21可編輯課件PPT2)凝膠介質(zhì)對介質(zhì)的要求：1st 親水性高；2nd 表面惰性，不發(fā)生化學(xué)和物理變化；3rd 高穩(wěn)定性，有較寬的pH和I適應(yīng)范圍；4th 具有一定的孔徑分布；5th 機械強度高，耐高壓操作，壽命長。 商品化的介質(zhì)均能滿足1-4條的要求。介質(zhì)的類型：1st Sephadex2nd Sephacryl3rd Superose/-dex,Sepharose4th Cellulose5th TSKgel22可編輯課件PPT23可編輯課件PPT凝膠介質(zhì)特征參數(shù)排阻極限(exclusionlimit)：指不能擴散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的M。如，SephadexG50的排阻極限為30kD。分級范圍(fractionationrange)：能阻滯組分并且使組分相互之間得到分離的組分分子量范圍。如，SephadexG50的分級在1.5-30KD內(nèi)。溶脹率/吸水率：

如，SephadexG50的溶脹率=500±30%。

24可編輯課件PPT凝膠粒徑：軟gel粒徑較大，在50-150m之間；硬gel較小，在5-50m之間。粒徑越小，HETP越小，分離效率越高。床體積(bedvolume)：1g干燥gel溶脹后所占有的體積。如，SephadexG50的床體積為9-11cm3/g干膠?？障扼w積(voidvolume)：凝膠之間的空隙體積，即V0。

空隙體積一般用平均分子量在2000KD水溶性藍葡聚糖(bluedextran)測定。25可編輯課件PPT4)影響GFC分離特性的因素線速度：1stHW40F凝膠的排阻極限小，在該凝膠中蛋白質(zhì)的m=0，故HETP=2Dz/u(Dz

udp)=常數(shù)。2ndHW55F凝膠的排阻極限較大，在此，m>0,HETPu;在u=0處，直線交于點2Dz/u。3rd當(dāng)u<0.2cm/min,NaCl的HETP隨流速降低急劇增大。這主要由于分子的擴散影響。26可編輯課件PPT進樣體積：1st在一定相對料液體積范圍內(nèi)，HETP為常數(shù)；2nd但一定時間之后，HETP隨料液相對體積的增加而急劇增大。3rd意義：為得到較高的分離度，料液體積需根據(jù)溶質(zhì)的m差別控制在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，在不影響分離度的前提下取最大值。料液濃度 依據(jù)GFC的原理，tr和HETP與濃度無關(guān)。但實驗表明，當(dāng)濃度較高時，洗脫曲線出現(xiàn)吐舌、拖尾、甚至雙峰；使HETP極度上升。這主要為樣品黏度高造成。經(jīng)驗表明，料液與流動相的黏度比應(yīng)控制在2以內(nèi)。27可編輯課件PPT分子量M和分配系數(shù)m1st在GFC分級范圍內(nèi)m與M關(guān)系

此時，分離度方程為

方程示：b值越大，即凝膠分級范圍越小，Rs越大。2nd因此，一定料液時，根據(jù)組分的M選擇分級范圍較小的介質(zhì)，提高Rs和料液的處理量。28可編輯課件PPT凝膠的粒徑1st

dp,HETP.故dp是N的最佳途徑；2nd

dp10倍,而h和v不變，u10倍，HETP(=hdp)10倍，R10倍29可編輯課件PPT5）應(yīng)用1st分離純化 M：x0-106， d:0.x-x00nm之間； 種類：肽、脂質(zhì)、抗生素、糖、核酸、病毒(50-400nm)。2nd除熱原、過敏原 如青霉噻唑蛋白–SephadexG25凝膠柱。3rd脫鹽/置換buffer30可編輯課件PPT4thM測定 原理： 挑選標準蛋白質(zhì)：cytC(12500),Mb(16900),胰凝乳蛋白(23200),卵白蛋白(45000)和Hb(64500). 條件：在凝膠介質(zhì)分級范圍內(nèi). 作圖：31可編輯課件PPT6）優(yōu)點1st如其他色譜相比，操作簡便，介質(zhì)價廉易得；適合于大規(guī)模生產(chǎn)；2nd溶質(zhì)和介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用，故操作條件溫和，回收率接近100%；3rd分離結(jié)束后，無須對分離介質(zhì)進行清洗和再生，故容易實施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度；4th 作為脫鹽手段，GFC比透析法速度快，精度高；與超濾相比，剪切力小，蛋白質(zhì)的回收率高。5th分離機理簡單，操作參數(shù)少，易于放大。7）缺點1st分離僅限于分子量的差別，選擇性低，處理量少；2nd經(jīng)GFC洗脫后，產(chǎn)品被稀釋。因此需濃縮單元操作。32可編輯課件PPT離子交換色譜以離子交換樹脂作為固定相，選擇合適的溶劑作為流動相，使溶質(zhì)按照其離子交換親合力的不同而得到分離的方法33可編輯課件PPT原理(ionexchangerchromatography,IEC)1st

荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)m

I-離子強度；A和B為常數(shù),均為pH的函數(shù)，在物理意義上，B為溶質(zhì)的靜電荷數(shù)與交換劑的離子價數(shù)之比(對于pro,一般大于10)。m

-離子強度無限大時的溶質(zhì)分配系數(shù),為靜電作用外的非特異性吸附引起的溶質(zhì)在交換劑上分配。2nd意義：對于pro.和aa 調(diào)節(jié)Ivalue 調(diào)節(jié)|pH–pI| value34可編輯課件PPT常用的離子交換樹脂葡聚糖凝膠型DEAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-25，CM-SephadexC-25，SP-SephadexC-25纖維素系列離子交換劑DEAE-SephacelCellex系列瓊脂糖系列離子交換劑Sepharose系列SepharoseCL-6B,SepharoseFastFlowBio-GelA系列交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑35可編輯課件PPTSource系列離子交換劑特點：介質(zhì)均勻、分辨率高、流速快、反壓低陽離子交換樹脂S系列陰離子交換樹脂Q系列MonoBeads系列離子交換劑（Pharmacia）特點：介質(zhì)為親水性聚醚，具有和Source系列相同的優(yōu)點，但動態(tài)載量更大，壽命更長。同樣分為Q系列和P系列36可編輯課件PPTMiniQPC3.2/3:GlutathionesynthetaseSDSStartingmaterialPeak237可編輯課件PPT操作1st恒定洗脫(Sephadex常用)缺點：洗脫體積大,溶質(zhì)洗脫不盡38可編輯課件PPT2nd線性梯度洗脫(lineargradientelution)線性梯度洗脫的優(yōu)缺點優(yōu)點：流動相I/pH連續(xù)變化，不易出現(xiàn)干擾峰，操作范圍廣；缺點：需要特殊的濃度梯度設(shè)備，如梯度混合器。39可編輯課件PPT3rd階梯洗脫法(stepwiseelution)優(yōu)點：無須特殊設(shè)備，操作簡單；缺點：流動相濃度不斷變化，易出現(xiàn)干擾峰，容易出現(xiàn)多組分洗脫峰重疊的現(xiàn)象。40可編輯課件PPT線性洗脫時間定義：GHdI/dV-離子強度梯度(mol/l)，F(xiàn)-流動相流量(l/s).利用GH和Ip關(guān)系圖及上述方程，可算tr41可編輯課件PPT分離度和柱效1st分離度意義：4因素可控制2nd柱效意義：I+dIImi富集效應(yīng)42可編輯課件PPT應(yīng)用：43可編輯課件PPT疏水性吸附色譜(hydrophobicinteractionchromatography,HIC)

原理1)吸附1stpro疏水性2ndpro稀疏水性差異3rd原有吸附介質(zhì)的親水性4th親水性介質(zhì)的改造44可編輯課件PPT45可編輯課件PPT46可編輯課件PPT2)影響pro水化層因素1st水化層(hydrationshell) tighthydrationshell(0.35gwater/1gpro) loosehydrationshell(2gwater/1gpro)2ndionicstrength3rd|pH水–pI|Value |pH水–pI|Value

zeta電勢

水化層

4th

增加親水性物質(zhì) 離子：SCN-，ClO4-，I- 有機物：乙二醇、丙三醇等含羥基物質(zhì)5th

表面活性劑TighthydrationshellProteincoreLoosehydrationshell洗脫方法?47可編輯課件PPT3)、洗脫方法降低離子強度增加|pH–pI|[乙二醇]or[I-][表面活性劑]4)、富集效應(yīng)I+dIImi48可編輯課件PPT分離效率和柱效1st分離效率2nd柱效3rd降低顆粒大小的極端重要性49可編輯課件PPTApplications50可編輯課件PPT特點：1st互補工具：HIC主要用于蛋白質(zhì)類分離純化，雖然HIC不如IEC的應(yīng)用廣泛，但可以作為IEC的互補工具。如方法得當(dāng)，HIC與IEC的分離效率相當(dāng)。2nd與鹽析銜接：由于在高濃度鹽溶液中疏水性較大，因此HIC可直接分離鹽析后的蛋白質(zhì)溶液。3rd可以通過調(diào)節(jié)疏水性配基鏈長和密度來控制吸附性能的大小，因此可根據(jù)目標產(chǎn)物的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)奈絼?th疏水性吸附的種類多，選擇余地大，價格與離子交換劑相當(dāng)。51可編輯課件PPT反相色譜reversedphasechromatography,RPC固定相：非極性的反相介質(zhì)，即為疏水性介質(zhì)(R1,R2多為甲基，R為C4，C8，C18烷基或苯基，其中C18硅烷化制備的試劑最多，統(tǒng)稱為ODS–Octadecylsilica)。烷基化密度：45%，55%的羥基用 三甲基氯硅烷覆蓋，使表面完全 非極性化。溶質(zhì)在介質(zhì)上的分配系數(shù)處決于溶質(zhì)的疏水性，疏水性大，m高。流動相：極性有機溶劑的水溶液(甲醇,乙晴,異丙醇、正丙醇和四氫呋喃等)洗脫：[有機溶劑]增加。52可編輯課件PPT30μm15μm5μmInfluenceofParticleSizeontheSeparationeffect53可編輯課件PPTSourceRPC54可編輯課件PPT應(yīng)用：主要應(yīng)用于5000KD以下，特別是1000以下的非極性小分子物質(zhì)的分離蛋白質(zhì)：可以應(yīng)用，但存在變性的危險。[有機溶劑]55可編輯課件PPT親和色譜（Affinitychromatography）載體活化、配基連接、吸附、洗脫56可編輯課件PPT生物親和作用和親和純化技術(shù)生物分子能夠區(qū)分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常接近的其他分子，選擇性地與其中某一種分子相結(jié)合。生物分子間的這種特異性相互作用稱為親和作用。利用生物分子間的這種特異性結(jié)合作用的原理進行生物物質(zhì)分離純化的技術(shù)稱為親和純化技術(shù)57可編輯課件PPT親和純化技術(shù)的發(fā)展親和層析1951年，Campbell等，半抗原修飾纖維素制備了生物親和介質(zhì)從血情中純化了抗體。1967年，Axen等利用溴化腈活化瓊脂糖凝膠成功制備了親和吸附介質(zhì)，使親和層析技術(shù)從研究走向?qū)嵱谩Ｆ渌滦陀H和技術(shù)：親和過濾，親和分配，親和反膠團萃取，親和沉淀，親和電泳等58可編輯課件PPT生物親和作用-本質(zhì)親和作用機理，特別是蛋白質(zhì)親和作用機理尚不清楚蛋白質(zhì)表面存在一些凹陷或凸起結(jié)構(gòu)，上述結(jié)構(gòu)恰好能使某些小分子進入到其中，形成構(gòu)象上的鑰匙-鎖關(guān)系親和作用不僅依靠結(jié)構(gòu)上相似性，還需要多種力的相互作用59可編輯課件PPT

親和作用中的相互作用力靜電作用氫鍵疏水性相互作用配位鍵弱共價鍵60可編輯課件PPT

影響親和作用的因素離子強度pH抑制氫鍵形成的物質(zhì)溫度螯合劑61可編輯課件PPT親和作用體系特異性親和體系高特異性酶--底物、產(chǎn)物、抑制劑抗原--單克隆抗體荷爾蒙--受體蛋白核酸--互補堿基鏈段群特異性免疫球蛋白--A蛋白、G蛋白酶--輔酶酶、蛋白質(zhì)--過渡金屬離子（Cu2+,Zn2+)凝集素--糖、糖蛋白、細胞表面受體62可編輯課件PPT配基（ligand)：親和作用分子對中被固定在固體粒子上的分子。L+EE·L解離常數(shù)：Kd=[E][L]/[EL]結(jié)合常數(shù)：Ka=1/Kd=[EL]/[E][L]親和體系的結(jié)合常數(shù)為104-108dm3/mol63可編輯課件PPT親和層析原理親和層析是利用偶聯(lián)親和配基的親和吸附介質(zhì)為固定相親和吸附目標產(chǎn)物，使目標產(chǎn)物得到分離純化的液相層析法64可編輯課件PPT親和層析-操作過程65可編輯課件PPT親和配基酶的抑制劑:大豆胰蛋白酶抑制劑抗體：抗體-抗原，Ka=107-1012。單抗免疫親和層析A蛋白：與免疫球蛋白IgG結(jié)合。凝集素：與糖特異性結(jié)合的蛋白。伴刀豆球蛋白。輔酶和磷酸腺苷：輔酶I，與脫氫酶，激酶結(jié)合。三嗪類色素：分子內(nèi)含三嗪環(huán)的合成活性染料。ReactiveBlue2與脫氫酶，激酶結(jié)合。過渡金屬離子:Cu2+,Ni2+,Zn2+組氨酸:咪唑環(huán)，靜電和疏水作用。肝素：哺乳動物的臟器內(nèi)的酸性多糖物質(zhì)。，與脂蛋白，脂肪酶抗凝血酶等結(jié)合。66可編輯課件PPT

親和吸附介質(zhì)將親和配基共價偶聯(lián)在固體粒子表面（孔內(nèi)）即可制備親和吸附介質(zhì)具有親水性多孔結(jié)構(gòu)，無非特異性吸附；物理和化學(xué)穩(wěn)定性高，有較高的機械強度含有可活化的反應(yīng)基團粒徑均一的球形粒子67可編輯課件PPT親和配基固定化親和配基的固定化方法介質(zhì)的活化溴化腈活化法：-NH2，在堿性條件下完成。環(huán)氧基活化法：-NH2,-OH,-SH直接固定法和間接固定法（氧化法，碳二亞胺法，戊二醛活化法）硅膠的活化法:-OH，不宜在堿性條件下進行。68可編輯課件PPT間隔臂的作用當(dāng)配基分子量較小時，為了排除空間位阻作用，需要在配基和載體之間連接一個“間隔臂”間隔臂的長度有一定限制，超過一定長度后，配基與目標分子的親和力會減弱69可編輯課件PPT過程及影響因素過程：進料→清洗→洗脫→柱子再生。應(yīng)保證配基對目標產(chǎn)物有較高的吸附容量。目標產(chǎn)物在親和介質(zhì)上的吸附平衡多用Freundlich或Langmuir型的等溫式表示。進料過程中的雜質(zhì)影響

料液中目標產(chǎn)物濃度很低，雜質(zhì)很多，少量雜質(zhì)的非特異性吸附，會大大降低純化效果。雜質(zhì)的非特異性吸附量與其濃度、性質(zhì)、載體材料、配基固定化方法等眾多因素相關(guān)。進料的料液流速

流速的增大，分離速度加快，但柱效降低。70可編輯課件PPT目標產(chǎn)物洗脫特異性洗脫洗脫劑：含有與親和配基或目標產(chǎn)物具有親和作用的小分子化合物例：精氨酸溶液洗脫賴氨酸為配基親和吸附的t-PA71可編輯課件PPT目標產(chǎn)物洗脫非特異性洗脫：調(diào)節(jié)洗脫液的pH值，離子強度，離子種類或溫度等理化性質(zhì)。柱子：BSA-Sepharose4B洗脫方式：逐次降低洗脫液pH值分離組分：BSA血清不同的抗體組分。72可編輯課件PPT應(yīng)用舉例

組織纖溶酶原激活劑（t-PA）的純化干擾素（IFN）的純化重組人白細胞干擾素，經(jīng)一步單抗免疫親和層析，rhIFN-α比活提高了1150倍，收率達95%。柱子：精氨酸-Sepharose4B親和柱洗脫液：鹽酸胍（GuCl)豬心組織t-PA:活性提高7倍，收率為56%73可編輯課件PPT22.4蛋白質(zhì)分離常用的色譜方法免疫親和色譜 屬于吸附色譜中的一種，利用抗原-抗體作用的高度專一性以及較強的吸附力，實現(xiàn)特殊蛋白質(zhì)的分離免疫親和色譜介質(zhì)的獲得：（1）獲得抗體（2）抗體連接到載體上74可編輯課件PPT疏水色譜 在載體表面連接上疏水的直鏈碳鏈或其他疏水基團，如苯基，可以與蛋白質(zhì)的某些疏水基團相互作用，從而實現(xiàn)多組分的分離。操作要點 蛋白質(zhì)的局部變性 洗脫采用逐步降低鹽濃度的方法進行75可編輯課件PPT離子交換色譜是最常用的蛋白質(zhì)分離手段操作要點：由于蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同的pH值下，其解離程度是不同的，因此既可以采用陽離子交換，也可以用陰離子交換，可視具體情況而定由于蛋白質(zhì)的極性基團很多，為了避免洗脫困難，通常采用弱陽或弱陰離子交換劑適當(dāng)調(diào)節(jié)緩沖溶液的pH值，使蛋白質(zhì)適當(dāng)解離，通常采用的pH值靠近其等電點（不是等電點）76可編輯課件PPT緩沖溶液的離子強度不能過高，通常在10~20mmol。色譜方案的確定，需要視試驗情況作適當(dāng)調(diào)整。洗脫方式：pH梯度離子強度梯度77可編輯課件PPT22.5色譜系統(tǒng)高通量液相色譜系統(tǒng)分析型色譜系統(tǒng)78可編輯課件PPTAKTAexplorer100色譜系統(tǒng)79可編輯課件PPTAKTAexplorer100色譜系統(tǒng)工作流程80可編輯課件PPT81可編輯課件PPTHPLC82可編輯課件PPTHPLC83可編輯課件PPTAIEXTechniqueUltrafiltrationUFSuperdex200p.g.GFPurification

factorQSepharoseFF10timespurification82%yieldPhenylSepharoseHPHICY.-F.Liaoetal.(1996)J.Bi