PCR技術(shù)應(yīng)用及常見問題解析南京凱基生物科技開展郭強(qiáng)分子平臺負(fù)責(zé)人目錄基因表達(dá)研究的背景傳統(tǒng)PCR技術(shù)〔鏈?zhǔn)骄酆厦阜错憽砅CR反響體系以及反響程序PCR常見問題分析實時定量PCR〔Real-timePCR〕實時定量PCR的原理實時定量PCR采用的方法實時定量PCR常見問題解析——凱基生物技術(shù)開展基因表達(dá)的研究背景DNARNAProtein復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄調(diào)控調(diào)控翻譯RNAribosomalRNA，rRNAtranferRNA，tRNAmessengerRNA，mRNAsmallnuclearRNA，snRNA

——凱基生物技術(shù)開展順式作用元件結(jié)構(gòu)基因-GCGCCAATTATA基因表達(dá)研究策略管家基因：house-keepinggene，是指所有細(xì)胞中均要表達(dá)的一類基因，其產(chǎn)物是對維持細(xì)胞根本生命活動所必需的。如微管蛋白基因等。奢侈基因：Luxurygene，在特別細(xì)胞類型中大量(通常)表達(dá)并編碼特殊功能產(chǎn)物的基因，具有組織特異性。——凱基生物技術(shù)開展3’基因表達(dá)研究策略SPreBCA成熟mRNASPreBCA多肽鏈內(nèi)含子內(nèi)含子

sPreB

C

CA5’hnRNASPreBCA體外反轉(zhuǎn)錄cDNA——凱基生物技術(shù)開展基因表達(dá)研究策略cDNA：complementaryDNA，與RNA鏈互補(bǔ)的單鏈DNA，以其RNA為模板，在適當(dāng)引物的存在下，由依賴RNA的DNA聚合酶〔反轉(zhuǎn)錄酶〕的作用而合成。EST/mRNAGenomic

PCR的指數(shù)擴(kuò)增（2n）引物5’5’3’3’延伸變性、退火延伸變性、退火——凱基生物技術(shù)開展PCR技術(shù)〔聚合酶鏈?zhǔn)椒错憽砅CR反響循環(huán)72℃94℃55℃PCR循環(huán)變性退火延伸——凱基生物技術(shù)開展

PCR反響體系/程序曲線TimeTemp.94℃94℃55-58℃72℃72℃28-35cyclePCRbuffer1dNTP2PrimerI&II3Template4MgCl25DNA聚合酶6——凱基生物技術(shù)開展1〕PCR反響成分〔1〕模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。DNA模板一般100ng/100L。模板濃度過高會導(dǎo)致反響的非特異性增加。PCR反響條件——凱基生物技術(shù)開展〔2〕引物濃度0.1-0.5mol/L濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反響特異性下降。〔3〕TaqDNA聚合酶0.5-2.5U/50l酶量增加使反響特異性下降;酶量過少影響反響產(chǎn)量?！獎P基生物技術(shù)開展〔4〕dNTPdNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低那么降低反響產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性?！獎P基生物技術(shù)開展〔5〕Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。適宜濃度為反響體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反響特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反響體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反響中游離的Mg2+濃度。——凱基生物技術(shù)開展2〕循環(huán)參數(shù)變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈94℃，20-30秒(2)退火溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反響的靈敏性。——凱基生物技術(shù)開展〔3〕延伸70-75℃,一般為72℃延伸時間由擴(kuò)增片段長度決定〔4〕循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低錯誤摻入率增加——凱基生物技術(shù)開展PCR常見問題分析：

少量或者沒有PCR產(chǎn)物RNA降解分離無污染，高質(zhì)量的RNA；防止RNA降解RNA中含逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑70％（v/v）乙醇清洗RNA沉淀，除去抑制劑起始RNA量太低增加RNA的量多糖同RNA共沉淀用氯化鋰沉淀RNA以除去多糖合成cDNA第一鏈合成的引物退火失敗確定退火溫度適合所用的引物RNA模板存在較多二級結(jié)構(gòu)將RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性/退火，提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度反轉(zhuǎn)錄成功，PCR失敗PCR步驟中使用超過1/5的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物MarkerSample1Sample2control有非特異條帶引物和模板的非特異性退火基因特異性引物設(shè)計較差RNA中有基因組DNA的污染形成引物二聚體鎂離子濃度太高提高反響的溫度和特異性提高引物的特異性使用擴(kuò)增級DNaseⅠ處理RNA設(shè)計在3'端沒有互補(bǔ)序列的引物優(yōu)化鎂離子濃度M12——凱基生物技術(shù)開展引物設(shè)計：〔1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列?！?〕引物長度以15-40bp為宜?！?〕堿基盡可能隨機(jī)分布,G+C占40-60%?！?〕引物內(nèi)部防止形成二級結(jié)構(gòu)。〔5〕兩引物間防止有互補(bǔ)序列?！?〕引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴(yán)格限制?！獎P基生物技術(shù)開展產(chǎn)生彌散〔SMEAR〕條帶第一鏈產(chǎn)物的含量過高PCR反響中引物過多循環(huán)數(shù)過多退火溫度過低寡核苷酸片段產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增常規(guī)PCR步驟中減少第一鏈產(chǎn)物的量減少引物的用量減少PCR的循環(huán)次數(shù)

提高退火溫度

提取高質(zhì)量RNA，防止被DNA污染

M123——凱基生物技術(shù)開展RT-PCR反響實例對組織或細(xì)胞的總RNA進(jìn)行抽提把RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA然后設(shè)計目的基因引物進(jìn)行PCR，瓊脂糖電泳并數(shù)碼照分析電泳條帶灰度值，判斷目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相對量的變化RT-PCR反響實例RT-PCR引物的選擇：

1.

隨機(jī)引物

2.OligodT

3.基因特異性引物

RT-PCR實例：一、實驗?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)RNA提取的方法；學(xué)習(xí)PCR分析的原理與技術(shù)；分析用藥處理后人腎小管上皮細(xì)胞CTGF基因表達(dá)情況——凱基生物技術(shù)開展二、實驗材料、儀器和試劑1.材料：人腎小管上皮細(xì)胞等樣本組織2.儀器：微量移液器及吸頭、PCR儀及PCR管瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備、DEPC水等3.試劑：Trizol試劑〔凱基試劑盒〕RT-PCR試劑盒〔凱基試劑盒〕

——凱基生物技術(shù)開展1.RNA的提取

參照RNA提取試劑盒說明書三、操作步驟2.RNA質(zhì)量的測定280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值。OD260/OD280〔Ratio，R〕<1.8蛋白質(zhì)或有機(jī)物的污染>2.2RNA發(fā)生降解——凱基生物技術(shù)開展3.RTReactionRNA2-4ugxulOligodT10uM1.5ulDEPCwaterto10ul70℃水浴10分鐘，冰浴5分鐘，然后依次參加以下成分：RNAinhibitor40U/ul0.5ul10xAMVbuffer2.5uldNTP10mM1.0ulDTT200mM0.5ulAMVenzyme1.0ulDEPCwaterto25ul42℃水浴1小時，70℃保溫10分鐘終止反響?！獎P基生物技術(shù)開展4.PCRReaction10XPCR反響緩沖液2.5μL25mmol/LMgCl22.0μL10mmol/LdNTP1.0μL10μmol/L引物11.0μL10μmol/L引物21.0μLDNA1.0μLTaq0.2μL(5U)水補(bǔ)充至25.0μL——凱基生物技術(shù)開展表達(dá)模式以及結(jié)果分析В-actinCTGF比值C/B1處理1290.157234.1770.807

2處理2297.954563.9861.8933處理3285.415489.2921.7144處理4306.537437.0271.4265處理5318.191318.8981.002——凱基生物技術(shù)開展實時熒光定量PCR實時定量PCR(real-timequantitativePCR)是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強(qiáng)弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行別離。目前實時定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域?！獎P基生物技術(shù)開展RealTimePCRandConventionalPCRVS1.實時在線監(jiān)控：對樣品擴(kuò)增的整個過程進(jìn)行監(jiān)控，能夠?qū)崟r觀察產(chǎn)物的增加，直觀的看到反響的對數(shù)期2.降低反響的非特異性：使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合，提高PCR反響的特異性3.增加定量的特異性：全程監(jiān)控，準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定量；結(jié)果分析快捷方便，無需跑膠——凱基生物技術(shù)開展熒光定量PCR和常規(guī)PCR技術(shù)的區(qū)別常規(guī)PCR是通過電泳對擴(kuò)增反響的最終產(chǎn)物進(jìn)行定性分析〔定量不準(zhǔn)確〕；熒光定量PCR是在PCR反響體系中參加熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，使每一個循環(huán)變得“可見”，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進(jìn)行定量的方法〔準(zhǔn)確定量〕?！獎P基生物技術(shù)開展

RealtimePCRRegularPCR

TemplateDNA(cDNA)

DNA(cDNA)

EnzymeTaqDNAPolymerase

TaqDNAPolymerasePrimersForward&ReversePrimers

Forward&ReversePrimersProbe*50-200nMtargetDNAseq.withfluorescence

DyeSYBRGreenordifferentkindsdye(FAM,TET..)Nodye

Protocol1.Denature95oC1min.

1.Denature95oC1min.

2.Annealing60oC1min.

2.Annealing60oC1min.

3.Extension72oC1-3min.ordon'tneed.3.Extension72oC1-3min.

4.Cycle40.

4.Cycle20-30.

AmplicondsDNA65-150bp

dsDNAvaries--differentsizes.DataFirstAmplificationcycle--StartingQuantities.Gelbands

MeltCurves

Gelbands

RealtimePCR&RegularPCRComparasion

熒光擴(kuò)增曲線分成三個階段：

熒光背景信號階段

熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段

平臺期——凱基生物技術(shù)開展Cycle為了定量和比較的方便，在實時熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個反響管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值。——凱基生物技術(shù)開展

熒光定量分絕對定量和相對定量每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小?！獎P基生物技術(shù)開展絕對定量可以得到某個樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度

利用起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

主要針對樣本間基因表達(dá)的差異，比方說經(jīng)過處理的樣本和未經(jīng)處理的對照。因為不要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，基因表達(dá)的相對變化分析比絕對定量的方法更省時，應(yīng)用更廣泛。需要內(nèi)標(biāo)基因做歸一化處理。標(biāo)準(zhǔn)的看家基因一般都可被用作內(nèi)標(biāo)基因。如GAPDH，β-actin,β2-microglobulin以及rRNA等。在應(yīng)用某一基因作為內(nèi)標(biāo)之前首先確證該基因表達(dá)不會受實驗處理的影響。相對定量——凱基生物技術(shù)開展REALTIMEPCR常用的方法：

SYBRGREEN〔熒光染料摻入法〕和TAQMANPROBE〔探針法〕SYBRgreen

在PCR反響體系中，參加過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

——凱基生物技術(shù)開展ExtensionExtensionContinuedApplyExcitationWavelengthDNAbindingdyes——凱基生物技術(shù)開展Meltcurve非特異性的嵌入熒光染料評價優(yōu)點：與特異性的熒光探針相比價格廉價只需要設(shè)計PCR引物缺點：由于它和模板的結(jié)合是非特異性的，它可以和所有的雙鏈DNA包括引物和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，不能真實反映目的基因的擴(kuò)增情況?！獎P基生物技術(shù)開展Taqman技術(shù)PE公司開發(fā)原理：設(shè)計一個能與PCR產(chǎn)物雜交的熒光標(biāo)記的基因探針，其5’端標(biāo)記報告基團(tuán)〔Reporter,R〕，3’端標(biāo)記熒光抑制基團(tuán)〔Quencher,Q〕,在一定距離范圍內(nèi)，Q基團(tuán)可吸收R基團(tuán)發(fā)出的熒光，因此，只有探針被切斷后，R基團(tuán)的熒光信號才能被檢測到。——凱基生物技術(shù)開展探針定量原理探針設(shè)計的一般原那么：擴(kuò)增片段的長度不應(yīng)太大,一般小于300bp探針不能和任一引物互補(bǔ).探針保證特異性的前提下盡可能的短，長度不超過30bp.探針的Tm值至少比引物的Tm值高5度探針應(yīng)盡可能的靠近引物如用于檢測多態(tài)位點,多態(tài)位點應(yīng)盡可能的靠近探針中部.探針5’端不能是G，G有淬滅作用.——凱基生物技術(shù)開展熒光實時定量PCR技術(shù)最新進(jìn)展多重實時定量PCR技術(shù)的開展熒光實時RT－PCR技術(shù)的開展參考文獻(xiàn)：1.User’sManualofGeneAmp5700.AppliedBiosystemscompany.2.Anoverviewofreal-timequantitativePCR:applicationtoquantifycytokinegeneexpression.AnnapaulaGiuliettietal.Methods2001Dec;25(4):386-401.3.Experimentalmodelofcongenitaltoxoplasmosisinguinea-pigs:useofquantitativeandqualitativePCRforthestudyofmaternofetaltransmission.P.FLORIetal.J.Med.Microbiol.Vol.51(2007),871-8784.Aquantitativereal-timePCRmethodfordetectionofB-LymphocyteMonoclonalitybycomparisonofkappaandlambdaImmunoglobulinLightChainExpression.AndersSt?hlberg,ClinicalChemistry49(1):51-59多重實時熒光定量PCR雙鏈DNA特異染料〔SYBR〕不能在一個反響管中檢測多個目的產(chǎn)物熒光染料LUX〔LightUponExtension〕標(biāo)記的引物可以進(jìn)行多元化的擴(kuò)增。這些熒光基團(tuán)有不同的熒光發(fā)射波長，從而可以區(qū)分不同引物介導(dǎo)的擴(kuò)增產(chǎn)物。發(fā)夾引物單鏈引物延伸引物dsDNA——凱基生物技術(shù)開展DyesUsedforReal-TimePCR

DyeExcitationmaximum(nm)Emissionmaximum(nm)Fluorescein490513FAM494518SYBRGreenI494521JOE520548VIC538552://——凱基生物技術(shù)開展qRT-PCR實例一、實驗?zāi)康膶崟r定量PCR來測定樣品中特定核苷酸的實時擴(kuò)增產(chǎn)物。二、材料實時定量PCR試劑：1.ABItaqmanPCR核心試劑盒2.ABISYBRPCR核心試劑盒——凱基生物技術(shù)開展三、方法步驟1.SYBR綠色試劑盒的實時PCR2.實時定量PCR儀器的設(shè)置——凱基生物技術(shù)開展SYBR綠色PCR主混合液加入引物和模板DNA分配至PCR管Real-timePCR步驟時間溫度備注UNG〔可選〕遺留物預(yù)防2min50℃UNG可以消除任何dUMP在PCR產(chǎn)物中的污染物PCR最初的激活步驟15min95℃激活HotStarTaqDNA聚合酶3〔4〕-步循環(huán)：變性15s94℃退火30s50-60℃引物Tm下大約5℃-8℃延伸