附件13AcuteOralToxicityTestTheFixed-DoseProcedure1范圍本方法規(guī)定了動物急性經口毒性試驗固定劑量法的基本原則、要求和方法。本方法適用于化妝品原料安全性毒理學檢測。2試驗目的急性經口毒性試驗是評估化妝品原料毒性特性的第一步，通過短時間經口染毒可提供對健康危害的信息。試驗結果可作為化妝品原料毒性分級和標簽標識以及確定亞慢性毒性試驗和其他毒理學試驗劑量的依據。3定義3.1急性經口毒性acuteoraltoxicity一次或在24h內多次經口給予實驗動物受試物后，動物在短期內出現(xiàn)的健康損害效應。3.2經口半數致死量（LD50）mediumlethaldose經口一次給予受試物后，引起實驗動物總體中半數死亡的毒物的統(tǒng)計學劑量。以單位體重接受受試物的重量(mg/kg或g/kg)來表示。3.3延遲死亡delayeddeath設定的給藥間隔（通常為48h）內不引起受試動物死亡或出現(xiàn)瀕死狀態(tài)，但在14d的觀察期間內出現(xiàn)死亡。3.4限值劑量limitdose受試動物進行急性經口毒性試驗的上限劑量（2000mg/kg或5000mg/kg）。4試驗基本原則本方法的原則是在使用最少動物數逐步進行試驗，以獲得受試物的急性毒性分級所需的充分結果。受試物按固定的劑量逐一以管飼法經口給予單只同性別動物（一般采用雌性），每個劑量染毒后根據動物毒性反應和死亡的結果來確定是否在更高劑量或更低劑量繼續(xù)試驗。并對染毒后所有動物進行解剖學檢查，存在病理改變的器官考慮進行病理組織學檢查。本方法主要適用于嚙齒類動物的研究。5試驗方法5.1受試物受試物應溶解或懸浮于適宜的介質中，建議首選水，其次考慮使用植物油（如玉米油）或其他介質（如羧甲基纖維素、明膠、淀粉等）制成溶液、混懸液或乳濁液。對非水溶性介質，應了解其毒理特性，否則應在試驗前先確定其毒性。每次經口染毒液體的最大容量取決于實驗動物的大小，對嚙齒類動物所給液體容量一般為1mL/100g，水溶液可至2mL/100g。通過調整受試物溶液濃度使各劑量組經口染毒的容量一致。受試物溶液一般要現(xiàn)用現(xiàn)配。5.2實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境首選健康成年大鼠，也可選用其他嚙齒動物，通常使用未孕和未曾產仔的雌性動物。假如有已知毒理學資料說明雄性動物可能對受試物更敏感，也可選用雄性動物并說明理由。實驗動物開始試驗時應為8-12周齡，體重之間相差不得超過平均體重的20%。試驗前動物要在實驗動物房環(huán)境中適應3～5d時間。實驗動物及實驗動物房應符合國家相應規(guī)定。選用標準配合飼料，飲水不限制。5.3預實驗步驟5.3.1染毒前動物需要禁食（大鼠禁食不禁水過夜，小鼠禁食不禁水3h～4h）。禁食后染毒前需要對動物進行稱重，采用管飼法一次性染毒（如果不能一次染毒，可分次給予，但整體染毒時間不能超過24h）。染毒后仍需繼續(xù)禁食（大鼠3h～4h，小鼠1h～2h）。如果染毒是分多次完成的，根據時間的長短，必要時可給動物提供一定量的水和食物。5.3.2初始劑量和限量實驗根據相關毒理學資料，可以從5mg/kg，50mg/kg，300mg/kg，2000mg/kg中選擇一個作為初始劑量，受試物的毒性資料可以通過其類似化合物或類似混合物（根據性質和所占的比例判斷受試物所占的毒性重要性）的毒性資料獲得。如受試物無毒理學資料，一般從300mg/kg作為初始劑量進行預實驗。如果現(xiàn)有毒理學資料提示受試物可能無毒的情況下（致死量高于限值劑量），可進行限量試驗。如有要求或需要，可采用5000mg/kg劑量進行限量試驗，可按附錄A中的試驗準則進行。如結果為A，則第二只動物在2000mg/kg劑量試驗；如出現(xiàn)B或C（明顯毒性或無毒性）則選擇5000mg/kg作為正式試驗的初始劑量。對于2000mg/kg劑量的試驗結果出現(xiàn)B或C，應將試驗推進至5000mg/kg，如5000mg/kg試驗結果為A，則正式試驗起始劑量為2000mg/kg，如結果為B或C，則正式試驗起始劑量為5000mg/kg。5.3.3觀察及結果解釋每次取1只動物，按照附錄A進行預試驗，觀察記錄染毒后動物的毒性表現(xiàn)，觀察間隔24h后，進行另一只動物染毒，所有試驗動物觀察至少14d。預試驗的結果為正式試驗提供初始劑量。預試驗中，如果在最低劑量（5mg/kg）動物發(fā)生死亡，根據試驗程序，應立即停止試驗，將該物質判定為GHS急性毒性分級1類（見附錄A）。為了獲取更為準確的結果，應選取第二只動物按照5mg/kg染毒，如果第二只動物死亡，結束試驗，將該物質判定為1類；如該動物未死亡，最多再選3只動物按單只順序5mg/kg染毒，觀察間隔為確定上一只動物已存活為準。只要有第二只動物死亡則試驗結束（此時可按附錄B進行分級）。5.4正式試驗步驟5.4.1初始劑量及實驗動物根據預試驗結果選取只產生明顯毒性而不引起死亡的劑量作為正式試驗的初始劑量。每個劑量組動物以5只為限，應包含預試驗中該劑量組使用的一只動物。5.4.2染毒在預試驗結果的基礎上，遵照附錄B進行染毒。應在確定前一劑量組的動物存活后，方可進行下一劑量的試驗。一般兩個劑量組試驗之間要間隔3d～4d，以有助于更好地觀察遲發(fā)的毒性反應。間隔時間可以根據實際情況進行調整。如果進行限量試驗，參照附錄B，選取除預實驗另外4只動物進行試驗。正式試驗開始于5000mg/kg，結果A需選第二組動物在2000mg/kg上進行試驗；結果出現(xiàn)B（明顯毒性和/或小于或等于1只死亡）或C（無毒性）受試物按5級分類。在2000mg/kg劑量上的試驗結果是B或C，應將試驗推進到5000mg/kg，如5000mg/kg試驗結果為A，則該物質毒性較低，分類為5級；如結果為B或C，則受試物不適用GHS分類，可視為實際無毒。5.4.3觀察染毒后，對每只動物都應有單獨全面的記錄，在染毒后的30min內每只動物至少分別觀察一次，第1d內要定時觀察（在前4h內要特別注意）實驗動物的中毒表現(xiàn)和死亡情況，其后至少每天進行一次仔細的檢查。詳細記錄被毛和皮膚、眼睛和粘膜，呼吸、循環(huán)、自主神經和中樞神經系統(tǒng)、肢體活動和行為等改變。特別注意是否出現(xiàn)震顫、抽搐、流涎、腹瀉、嗜睡和昏迷等癥狀。應記錄毒副作用體征出現(xiàn)和消失的時間和死亡時間。發(fā)現(xiàn)處于瀕死狀態(tài)動物以及動物表現(xiàn)出劇烈的疼痛或持續(xù)嚴重痛苦的病癥時給予人道處死。當動物因人道原因處死或被發(fā)現(xiàn)死亡時，應盡可能準確地記錄死亡時間。觀察期限一般不超過14d，但觀察時間并非一成不變，要視動物中毒反應的嚴重程度、癥狀出現(xiàn)快慢和恢復期長短而定。若有延遲死亡跡象，可延長觀察時間。觀察期內存活動物每周稱重，觀察期結束存活動物應稱重，處死后進行尸檢。對全部動物進行大體解剖學檢查，并記錄全部大體病理改變。5.4.4病理學檢查對實驗動物進行大體解剖學檢查（包括在試驗期死亡及因人道處死而移出試驗室的），并記錄全部大體病理改變。對死亡和存活24h和24h以上動物并存在大體病理改變的器官應進行病理組織學檢查。5.5試驗結果評價5.5.1試驗數據應記錄每一只動物的相應數據。按各劑量水平將染毒動物的觀察結果以適當形式（列表）進行總結。描述使用的動物數量，出現(xiàn)中毒體征的動物數，試驗中引起死亡或處于人道主義處死的動物數，每只動物的死亡時間，描述毒性反應恢復的時間及大體解剖的結果。5.5.2結果評價評價試驗結果時，應將固定劑量毒性分類級別與觀察到的毒性效應和尸檢所見相結合考慮，受試物毒性分級是判定受試物經消化道攝入后引起動物死亡可能性大小的依據。在對受試物使用毒性分級時，需要注明所用實驗動物的種屬、性別、染毒途徑、觀察期限等。評價應包括動物接觸受試物與動物異常表現(xiàn)（包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死效應及其他毒性作用)的發(fā)生率和嚴重程度之間的關系。毒性分級見表1。表.1經口毒性分級評價對照表劑量癥狀推測LD50區(qū)間毒性分級5mg/kgA≥2≤5mg/kg1A=1、B≥15mg/kg-50mg/kg250mg/kgA≥25mg/kg-50mg/kg2A=1、B≥150mg/kg-300mg/kg3300mg/kgA≥250mg/kg-300mg/kg3A=1、B≥1300mg/kg-2000mg/kg42000mg/kgA≥2300mg/kg-2000mg/kg4A=1、B≥1>2000mg/kg5C>2000mg/kg5/未劃分注：A-死亡；B-觀察到明顯毒性；C-無毒性體征。正式試驗中5只動物應包含預試驗中該劑量組使用過的一只動物。6試驗結果的解釋通過急性經口毒性試驗固定劑量法以經口毒性分級評價受試物的毒性。其結果外推到人類的有效性很有限。附錄A（規(guī)范性附錄）預試驗流程A.1預試驗流程圖（圖A.1～圖A.4）起始劑量起始劑量5mg/kg2000mg/kg1只動物2000mg/kg1只動物300mg/kg1只動物50mg/kg1只動物5mg/kg1只動物CBACBACBACBACBACBACBACBAGHSGHS分類1級正式實驗正式實驗起始劑量（mg/kg）55505030030020002000圖A.1預試驗流程圖（起始劑量：5mg/kg）注：A-死亡；B-明顯毒性；C-無毒性。如在5mg/kg劑量下出現(xiàn)A，應按照5.3.3方法，對受試物毒性進行分級。起始劑量起始劑量50mg/kg2000mg/kg1只動物2000mg/kg1只動物300mg/kg1只動物50mg/kg1只動物5mg/kg1只動物ACACBBAABBCCACACBBAABBCCGHSGHS分類1級正式實驗正式實驗起始劑量（mg/kg）55505030030020002000圖A.2預試驗流程圖（起始劑量：50mg/kg）注：A-死亡；B-明顯毒性；C-無毒性。如在5mg/kg劑量下出現(xiàn)A，應按照5.3.3方法，對受試物毒性進行分級。起始劑量起始劑量300mg/kg2000mg/kg1只動物2000mg/kg1只動物300mg/kg1只動物50mg/kg1只動物5mg/kg1只動物ABABCCBACACBABABCCBACACBGHSGHS分類1級正式實驗正式實驗起始劑量（mg/kg）55505030030020002000圖A.3預試驗流程圖（起始劑量：300mg/kg）注：A-死亡；B-明顯毒性；C-無毒性。如在5mg/kg劑量下出現(xiàn)A，應按照5.3.3方法，對受試物毒性進行分級。起始劑量起始劑量2000mg/kg2000mg/kg1只動物2000mg/kg1只動物300mg/kg1只動物50mg/kg1只動物5mg/kg1只動物ABABCCBACACBABABCCBACACBGHSGHS分類1級正式實驗正式實驗起始劑量（mg/kg）55505030030020002000圖A.4預試驗流程圖（起始劑量：2000mg/kg）注：A-死亡；B-明顯毒性；C-無毒性。如在5mg/kg劑量下出現(xiàn)A，應按照5.3.3方法，對受試物毒性進行分級。附錄B（規(guī)范性附錄）正式試驗流程B.1正式試驗流程圖（圖B.1～圖B.4）起始劑量起始劑量5mg/kg2000mg/kg1只動物2000mg/kg1只動物300mg/kg1只動物50mg/kg1只動物5mg/kg1只動物CBACBACBACBACBACBACBACBAGHS122334455/未劃分分類級別GHS122334455/未劃分分類級別圖B.1正式試驗流程圖（起始劑量：5mg/kg）注：A-死亡數大于或等于2只；B-觀察到明顯毒性大于或等于1只，或者1只死亡；C-無毒性。正式試驗中5只動物應包含預試驗中該劑量組使用過的一只動物。 起始劑量起始劑量50mg/kg2000mg/kg1只動物2000mg/kg1只動物300mg/kg1只動物50mg/kg1只動物5mg/kg1只動物BCBAABACCBACBCBAABACCBACGHS122334455/未劃分GHS122334455/未劃分分類級別圖B.2正式試驗流程圖（起始劑量：50mg/kg）注：A-死亡數大于或等于2只；B-觀察到明顯毒性大于或等于1只，或者1只死亡；C-無毒性。正式試驗中5只動物應包含預試驗中該劑量組使用過的一只動物。 起始劑量起始劑量300mg/kg300mg/kg1只動物300mg/kg1只動物50mg/kg1只動物5mg/kg1只動物2000mg/kg1只動物BABCCBACACBABABCCBACACBAGHS1223344