ICSCCS65.020.01美澳型核果褐腐病菌活性檢測(cè)方法ViabilitytestofMoniliniafruticola(G.Winter)Honey國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T40252—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由全國(guó)植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC271)提出并歸口。GB/T40252—2021美澳型核果褐腐病菌活性檢測(cè)方法本文件描述了應(yīng)用普通熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)美澳型核果褐腐病菌[Monilin-iafruticola(G.Winter)Honey]進(jìn)行活性檢測(cè)的方法。本文件適用于美澳型核果褐腐病菌相關(guān)寄主中攜帶美澳型核果褐腐病菌的分生孢子活性檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文SN/T2589植物病原真菌檢測(cè)規(guī)范具有生命力的一種性質(zhì)。分生孢子具有生命力的一種性質(zhì)。分類地位：屬真菌界(Fungi),子囊菌門(Ascomycota)子囊菌綱(Ascomycetes),柔膜菌目(Helotia-les),核盤菌科(Sclerotiniaceae),鏈核盤菌屬(Monilinia)。分別應(yīng)用二乙酸熒光素(FlouresceinDiacetate,FDA)和碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)熒光染料12GB/T40252—2021對(duì)美澳型核果褐腐病菌孢子進(jìn)行染色處理，根據(jù)FDA可通過(guò)細(xì)胞代謝留在活細(xì)胞內(nèi)，使具有活性的孢具有活性的孢子不發(fā)出熒光。根據(jù)上述特點(diǎn)并運(yùn)用普通熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)病菌分6儀器和試劑為10mg·mL-1的母液，置于棕色瓶4℃避光保存。使用前用丙酮稀釋，配置成0.5mg·mL-1的工作液。6.3主要培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):200g去皮馬鈴薯切成小方塊，加入1000mL自來(lái)水，煮沸15min,用四層紗布過(guò)濾得到濾液，濾液中加入18g葡萄糖、18g瓊脂粉，加熱溶解后將溶液定容至1000mL,分裝到三角瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌20min。7活性檢測(cè)方法刮取寄主癥狀病征的分生孢子裝入到有無(wú)菌水的離心管中，配制成終濃度為每微升含10個(gè)~15min,16000g離心1min,棄上清液終止染色，加入滅菌去離子水洗滌一次，重新懸浮?，F(xiàn)配現(xiàn)用，7.2.2PI染色放置。3GB/T40252—20217.3普通熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡活性檢測(cè)7.3.1普通熒光顯微鏡檢測(cè)將制好的破片立即放置于普通熒光顯微鏡載物臺(tái)上，在低倍鏡下找到孢子，然后轉(zhuǎn)至40倍鏡下觀察，微調(diào)至視野內(nèi)圖像清晰下觀察并計(jì)數(shù)。至少檢測(cè)30個(gè)孢子，觀察染色情況。FDA染色檢測(cè)：將熒光光路打開(kāi)，設(shè)置熒光通道的激發(fā)波長(zhǎng)488nm,收集熒光信號(hào)的發(fā)射波長(zhǎng)530nm,收集熒光信號(hào)。微調(diào)至視野內(nèi)圖像清晰。(見(jiàn)附錄B)PI染色檢測(cè)：將熒光光路打開(kāi)，設(shè)置熒光通道的激發(fā)波長(zhǎng)534nm,收集熒光信號(hào)的發(fā)射波長(zhǎng)617nm,收集熒光信號(hào)。微調(diào)至視野內(nèi)圖像清晰。(見(jiàn)附錄B)7.3.2激光掃描共聚焦顯微鏡活性檢測(cè)選擇相應(yīng)的激光管(氬離子激光器)激發(fā)熒光信號(hào)，F(xiàn)DA檢測(cè)設(shè)置熒光通道的激發(fā)波長(zhǎng)(488nm),收集熒光信號(hào)的發(fā)射波長(zhǎng)(530nm),并設(shè)置一個(gè)明場(chǎng)通道作為對(duì)照。PI檢測(cè)設(shè)置熒光通道的激發(fā)波長(zhǎng)(534nm),收集熒光信號(hào)的發(fā)射波長(zhǎng)(617nm),并設(shè)置一個(gè)明場(chǎng)通道作為對(duì)照。選擇低像素掃描模式掃描(xy:512×512),重復(fù)掃描次數(shù)Average為1次，掃描速度Speed為9,根據(jù)成像效果調(diào)整探測(cè)針孔Pinhole、光電倍增管增益Gain和激光掃描強(qiáng)度ScanStr等參數(shù)，將圖像調(diào)整至質(zhì)量較好的效果。再用精確掃描方式(xy:2048×2048)然后根據(jù)信噪比調(diào)整掃描模式，選擇精確像素的平面掃描方式進(jìn)行粗略掃描(xy:2048×2048),重復(fù)掃描次數(shù)Average為2次，掃描速度Speed為6,獲取最終圖像。將制好的破片立即放置于激光掃描共聚焦顯微鏡載物臺(tái)上，低倍鏡下找到孢子，轉(zhuǎn)到40倍鏡下觀察，微調(diào)至視野內(nèi)圖像清晰，掃描至少30個(gè)孢子，觀察染色結(jié)果。(見(jiàn)附錄C)8結(jié)果判斷與表述通過(guò)普通熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡掃描檢測(cè)分別經(jīng)FDA和PI處理至少30個(gè)分生孢子。結(jié)果判斷與表述如下：——如經(jīng)FDA處理檢測(cè)到分生孢子發(fā)綠色熒光，以及經(jīng)PI處理檢測(cè)到分生孢子不發(fā)熒光，則判定該分生孢子具有活性；4GB/T40252—2021 該分生孢子不具有活性。9樣品與原始數(shù)據(jù)集保存9.1樣品保存存查樣品應(yīng)視樣品的狀態(tài)采用相應(yīng)的保存方式，妥善保存6個(gè)月。如發(fā)現(xiàn)具有活性的美澳型核果褐腐病菌孢子的，進(jìn)行斜面保存，如涉及貿(mào)易糾紛則應(yīng)保存到糾紛解決完畢。保存期滿后，需經(jīng)滅菌處理。樣品保存方法應(yīng)符合SN/T2589的規(guī)定。9.2原始數(shù)據(jù)保存5GB/T40252—2021(資料性)A.1主要寄主(Cerasuspseudocerasus)、歐洲山茱萸(Cornusmas)、杏(Prunusarmeniaca)、歐洲甜櫻桃(Prunusca),病菌還可在木瓜屬(Chaenomeles)、山楂屬(Crataegus)、韞槨屬(Cydonia)、枇杷屬(Eriobotrya)、剛竹屬(Phyllostachys)、李屬(Prunus)、梨屬(Pyrus)等寄主上為害。A.2為害癥狀該病害主要為害果實(shí)，病害發(fā)生初期果實(shí)表面上形成灰褐色圓形病斑，隨后病斑迅速蔓延擴(kuò)展至全縮成僵果懸掛枝條上經(jīng)久不落。若在低濕度條件下，整個(gè)果實(shí)皺縮，干癟。受侵染的花和葉變褐，枯萎，形成一個(gè)典型的枯萎狀，在莖上造成褐色的凹陷區(qū)域(潰瘍斑),通常其表面聚集著樹膠。潮濕條件下，在這些受侵染的組織上產(chǎn)生分生孢子梗束。美澳型核果褐腐病菌為害癥狀見(jiàn)圖A.1。a)美澳型核果褐腐病在蘋果上癥狀b)美澳型核果褐腐病在李上癥狀c)美澳型核果褐腐病在桃上癥狀圖A.1美澳型核果褐腐病菌為害癥狀圖A.3菌落特征菌落生長(zhǎng)速度快，在PDA培養(yǎng)基上22℃培養(yǎng)8d左右，菌落可布滿整個(gè)培養(yǎng)皿，呈同心輪紋狀，菌量豐富、菌落表面的分生孢子堆呈同心輪紋圓環(huán)。菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落形態(tài)見(jiàn)圖A.2。6GB/T40252—2021圖A.2菌株在PDA上生長(zhǎng)菌落形態(tài)A.4分生孢子形態(tài)學(xué)特征7GB/T40252—2021(資料性)普通熒光顯微鏡對(duì)美澳型核果褐腐病菌孢子染色觀察結(jié)果圖普通熒光顯微鏡觀察FDA對(duì)美澳型核果褐腐病菌孢子染色效果見(jiàn)圖B.1。圖B.1普通熒光顯微鏡觀察FDA對(duì)美澳型核果褐腐病菌孢子染色效果圖普通熒光顯微鏡觀察PI對(duì)美澳型核果褐腐病菌孢子染色效果見(jiàn)圖B.2。8GB/T40252—2021圖B.2普通熒光顯微鏡觀察PI對(duì)美澳型核果褐腐病菌孢子染色效果圖9GB/T40252—2021(資料性)激光共聚焦顯微鏡對(duì)美澳型核果褐腐病菌孢子染色觀察結(jié)果圖激光共聚焦顯微鏡觀察FDA對(duì)美澳型核果褐腐病菌孢子染色效果見(jiàn)圖C.1。C,D——死孢子染色結(jié)果，C為熒光通道，D為明場(chǎng)。圖C.1激光共聚焦顯微鏡觀察FDA對(duì)美澳型核果褐腐病菌孢子染色效果圖GB/T40252—2021激光共聚焦顯微鏡觀察PI對(duì)美澳型核果褐腐病菌孢子染色效果見(jiàn)圖C.2。圖C.2激光共聚焦顯微鏡觀察PI對(duì)美澳型核果褐腐病菌孢子染色效果圖GB/T40252—2021[1]SN/T1871—2007美澳型核果褐腐病菌檢疫鑒定方法業(yè)科學(xué)，2015,48(14):2757-2766.[3]陳耀文，賴效瑩.激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用[J].激光生物學(xué)[4]諶麗斌，梁文艷，曲久輝，等.FDA-PI雙色熒光法檢測(cè)藍(lán)藻細(xì)胞活性的研究[J].環(huán)境化學(xué)，2005,24(5):554-557.[5]胡曉棣，李熠，任蜀豫，等.冬蟲夏草、蛹蟲草菌絲隔膜和細(xì)胞核熒光染色[J].菌物學(xué)報(bào)，2016,35(9):1099-1105.[6]黃躍才，章桂明，劉作易，等.大豆猝死綜合癥病菌枝2009,28(2):236-243.[7]李葉，黃華平，林培群，等.激光掃描共聚焦顯微鏡[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2015,34(7):262-265.[8]吳品珊，嚴(yán)進(jìn)，國(guó)立耘.美澳型核果褐腐病菌的檢疫鑒定方法[J].植物檢疫，2007,21(4):215-216.[9]FanJY,GuoLY,Jian-PingXU,etal..GeneticDiversityofPoppLationsofMoniliniafructicola(Fungi,Ascomycota,Helotiales)fromChina[J].JournalofEukaryoticMicrobiology,2010,57(2):206-212.[10]HuMJ,ChenY,ChenSN,etal..FirstreportofbrownrotofpeachcausedbyMonilin-ia