關于酶的改造方法進展為什么要進行酶改造？溫和的自然體系：常溫、常壓、中性pH、水環(huán)境極端的工業(yè)體系：高溫、高壓、酸、堿、有機溶劑酶不適應第2頁,共64頁，星期六，2024年，5月酶的改造方法

酶的化學修飾-分子修飾酶的物理修飾-固定化酶的生物改造-定向進化

酶的人工模擬-抗體酶第3頁,共64頁，星期六，2024年，5月一、酶的化學修飾B通過制備酶單分子納米凝膠，大大提高了酶的穩(wěn)定性第4頁,共64頁，星期六，2024年，5月酶分子修飾主要方法

金屬離子置換修飾大分子結合修飾側(cè)鏈基團修飾肽鏈有限水解修飾氨基酸置換修飾

第5頁,共64頁，星期六，2024年，5月1）金屬離子置換修飾實例

SOD的金屬離子置換：

天然SOD中的鐵原子被錳原子取代后，重組酶對H2O2的穩(wěn)定性顯著增強，對NaH3的抑制作用的敏感型顯著降低。

氨基酸?；傅慕饘匐x子置換：氨基?；傅匿\被鈷取代后，底物專一性和最適pH都有改變，鋅酶對N-乙酰丙氨酸的最適pH是8.5,而鈷酶是7.0.第6頁,共64頁，星期六，2024年，5月2）酶大分子修飾的實例每分子核糖核酸酶和6.5分子的右旋糖酐結合，酶的催化效率提高2.25倍；用琥珀酸酐法活化的聚乙二醇對菠蘿蛋白酶進行修飾，在55℃的穩(wěn)定性比未修飾的提高38%；尿激酶采用聚乙二醇5000修飾，在兔體內(nèi)的半衰期延長9~13倍；超氧化歧化酶采用聚乙二醇修飾后半衰期延長70~350倍；L-天冬酰胺酶經(jīng)聚乙二醇修飾后，抗原性顯著降低，1994年經(jīng)美國FDA批準成為治療急性白血病的藥物使用第7頁,共64頁，星期六，2024年，5月3）側(cè)鏈基團修飾的實例用亞硝酸修飾天冬酰胺酶，使氨基末端的Leu和肽鏈中的Lys殘基上的-NH2脫氨變成-OH，酶的半衰期延長2倍；葡萄糖異構酶經(jīng)琥珀?；揎椃踊?，最適pH下降0.5，穩(wěn)定性增加，更有利于果葡糖漿生產(chǎn)；用O-甲基異脲修飾溶菌酶，使酶分子中的Lys殘基上的

-氨基結合屏蔽，穩(wěn)定性顯著增強；枯草桿菌蛋白酶的第104位Tyr上的酚羥基經(jīng)四硝基甲烷修飾后，生成3-硝基酪氨酸殘基，使酶對帶正電荷的底物結合能力顯著增強；第8頁,共64頁，星期六，2024年，5月

胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活

4）肽鏈有限水解修飾實例第9頁,共64頁，星期六，2024年，5月5）氨基酸置換修飾實例Bender等成功地利用化學修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。評價：化學修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對酶分子逐個修飾，操作復雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)；發(fā)展趨勢：定點突變通過定點突變技術把農(nóng)桿菌

-葡萄糖苷酶催化中心的第358位L-GluL-Ala，使親核的羧基

甲基，結果使該酶失去了水解活性，而可以催化糖苷合成第10頁,共64頁，星期六，2024年，5月酶分子修飾的發(fā)展趨勢大分子修飾研究最為成功，尤其是聚乙二醇修飾；酶的側(cè)鏈基團修飾已經(jīng)成為酶結構研究的重要手段；更為精細的酶側(cè)鏈修飾往往和結構生物學緊密相關；第11頁,共64頁，星期六，2024年，5月二、酶的物理改造-固定化

載體固定化：納米材料、樹脂、水凝膠、殼聚糖等無載體固定化：細胞表面自固定化、酶聚集體等第12頁,共64頁，星期六，2024年，5月10mL淀粉葡萄糖苷酶(350μg/mL)與30mg殼聚糖混合，在室溫放置1h，不時攪拌，在4℃過夜，過濾，用600mL蒸餾水洗滌,過濾即得殼聚糖固定化淀粉葡萄糖苷酶；第13頁,共64頁，星期六，2024年，5月海藻酸鈉先加熱配成溶液，取一定量堿性蛋白酶溶液和海藻酸鈉溶液混合，攪拌均勻后用蠕動泵將混合液滴入2%的CaCl2

中形成凝膠珠，放入4℃冰箱硬化4h，得到海藻酸鈉微球。卡拉膠加熱配成一定的濃度,50℃水浴保溫,加入乳糖酶溶液，均勻攪拌后冷卻，4℃冰箱中硬化，得到塊狀固定化酶；第14頁,共64頁，星期六，2024年，5月酶與1.5%的海藻酸鈉溶液充分混和，通過針頭滴入1.1%氯化鈣溶液中，形成珠狀的海藻酸膠顆粒。凝膠珠用0.5%的聚賴氨酸處理，再經(jīng)0.1%的2-N-環(huán)已胺乙基磺酸處理，用生理鹽水洗滌，再以0.05mol/L的檸檬酸鈉水溶液液化微囊內(nèi)海藻酸鈣，得到近乎透明的微囊化的固定化酶。第15頁,共64頁，星期六，2024年，5月DEAE-纖維素固定蟲漆酶

CM-纖維素酶固定蟲漆酶

第16頁,共64頁，星期六，2024年，5月吸附交聯(lián)法：先將酶吸附在硅膠或樹脂等載體上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)，所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。交聯(lián)包埋法：把酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝結成顆粒很細的集合體，然后用高分子或多糖一類物質(zhì)進行包埋成顆粒。制得的固定化酶穩(wěn)定性好；第17頁,共64頁，星期六，2024年，5月泵儲罐反應產(chǎn)物離心機消旋反應器固定化酶柱子晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala固定化氨基?；钢苽銵-丙氨酸世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶第18頁,共64頁，星期六，2024年，5月酶固定化的發(fā)展趨勢載體新材料層出不窮

介孔材料、納米材料，磁性材料，大孔材料等；固定化方法日新月異

定向固定，微囊化固定，酶聚集體，靜電紡絲等；酶的結構與性能研究是熱點

結構模擬與計算等；第19頁,共64頁，星期六，2024年，5月三、酶的生物改造-定向進化

自然界酶的進化是極其緩慢的，無法適應工業(yè)過程的需要。隨著分子生物學技術快速發(fā)展，人們可以在試管內(nèi)利用幾周時間完成自然界幾萬年的進化過程自然進化誘變育種定向進化上萬年幾年到十多年幾個月第20頁,共64頁，星期六，2024年，5月酶的定向進化技術發(fā)展歷程生物催化劑進化方法發(fā)展歷程隨機和定點突變定向進化計算機輔助設計基于序列-功能關系與統(tǒng)計模型的理性進化第21頁,共64頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)穩(wěn)定性活性有機溶液中的活性不同的底物的利用酸堿度蛋白質(zhì)的表達親和性專一性1234……性能代數(shù)達到目的隨機突變隨機雜交篩選目標蛋白酶定向進化的過程和應用范圍第22頁,共64頁，星期六，2024年，5月酶定向進化的典型例子枯草桿菌蛋白酶E熱穩(wěn)定性的分子進化第23頁,共64頁，星期六，2024年，5月進化后的枯草桿菌蛋白酶E在60%的DMF中酶催化效率提高157倍，最適溫度提高17℃正面反面第24頁,共64頁，星期六，2024年，5月對硝基苯酯酶的分子進化(LoriGiver等，1998）（在30%的DMF中酶催化活性提高100倍）第25頁,共64頁，星期六，2024年，5月β-葡糖苷酶耐熱性的提高(Mary′aJesu′sArrizubieta等，2000）第26頁,共64頁，星期六，2024年，5月酶定向進化的基本過程隨機突變不同的定向進化方法構建突變基因文庫載體的選擇，基因重組，組建基因文庫突變基因的篩選

平板篩選法，熒光篩選法，表面展示法

第27頁,共64頁，星期六，2024年，5月隨機突變方法：定向進化的核心無性進化方法：易錯PCR法，盒式誘變有性進化方法

1）DNA改組法（DNAShuffling)2）體外隨機重組法（RPR)3）交錯延伸法(StEP)基因家族的同源重組外顯子的改組雜合進化第28頁,共64頁，星期六，2024年，5月易錯PCR方法第29頁,共64頁，星期六，2024年，5月有性進化：DNA改組方法（1994，Stemmer)第30頁,共64頁，星期六，2024年，5月有性進化：體外隨機重組法（1998，Arnold)第31頁,共64頁，星期六，2024年，5月有性進化:交錯延伸法（1997，Arnold)第32頁,共64頁，星期六，2024年，5月基因家族的同源重組無性進化方法：易錯PCR法，盒式誘變有性進化方法

1）DNA改組法（DNAShuffling)2）體外隨機重組法（RPR)3）交錯延伸法(StEP)基因家族的同源重組外顯子的改組雜合進化第33頁,共64頁，星期六，2024年，5月基因突變庫的篩選方法目標根據(jù)定向進化要求，在一定的環(huán)境要求下進行篩選，從突變基因文庫中得到所需的突變基因。難點突變庫容量大，一般達到106，工作量巨大關鍵高通量篩選：通量大，效率高方法平板篩選法，熒光篩選法，噬菌體表面展示法，細胞表面展示法第34頁,共64頁，星期六，2024年，5月平板篩選方法依據(jù)細胞生長情況篩選熱穩(wěn)定性：溫度梯度和高溫環(huán)境抗生素耐受性：抗生素濃度梯度pH穩(wěn)定性：pH梯度極端環(huán)境：高鹽、低溫、高濃毒物質(zhì)第35頁,共64頁，星期六，2024年，5月平板篩選方法依據(jù)顏色變化篩選大腸桿菌?-半乳糖苷酶基因顯色：噬菌體DNA載體（藍色）反應產(chǎn)物顯色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黃色硝基酚脂肪酶篩選海因酶篩選第36頁,共64頁，星期六，2024年，5月平板篩選方法依據(jù)透明圈大小篩選淀粉酶的進化：淀粉平板培養(yǎng)基豆鼓纖溶酶的進化：血纖維蛋白培養(yǎng)基第37頁,共64頁，星期六，2024年，5月熒光篩選方法利用自身熒光激發(fā)特性

生成產(chǎn)物本身是具有熒光激發(fā)特性的物質(zhì)利用熒光報告基因辣根過氧化合物酶和單加氧酶的融合基因：原理：萘→萘酚→醌類化合物（能激發(fā)熒光）綠色熒光蛋白基因：獲2008年諾貝爾化學獎

第38頁,共64頁，星期六，2024年，5月綠色熒光蛋白的應用分子標記：FISH分析菌株（a）未加探針；（b）DAPI染色（c）α-探針雜交（d）Msint-1268探針雜交菌株Y1；（e）Msint-1268探針雜交M.trichosporiumOB3b第39頁,共64頁，星期六，2024年，5月噬菌體顯示篩選模式第40頁,共64頁，星期六，2024年，5月噬菌體顯示的幾種類型第41頁,共64頁，星期六，2024年，5月核糖體顯示技術第42頁,共64頁，星期六，2024年，5月RNA-蛋白質(zhì)融合技術第43頁,共64頁，星期六，2024年，5月RNA-蛋白質(zhì)的融合第44頁,共64頁，星期六，2024年，5月酶定向進化的發(fā)展趨勢定向進化方法發(fā)展迅猛

方法均有知識產(chǎn)權；方法更有針對性和特征性；高通量篩選方法是關鍵

新方法（熒光顯示/表面展示）在涌現(xiàn)，技術交叉是趨勢；定向進化是近20年中最成功的酶改造方法

新的實例越來越多；第45頁,共64頁，星期六，2024年，5月

酶對熱，酸，堿以及有機溶劑的不穩(wěn)定性，限制了其在工業(yè)中的應用。四、酶的人工模擬模擬酶-----模擬酶的生物催化功能，用化學半合成法或化學全合成法合成的酶。固定化酶

-----結合到特定的支持物上并能發(fā)揮作用的一類酶。第46頁,共64頁，星期六，2024年，5月根據(jù)酶的作用原理來模擬酶的活性中心和催化機制，用化學方法制成的高效、高選擇性、結構較簡單、穩(wěn)定性較高的新型催化劑。模擬酶利用現(xiàn)有的酶或蛋白質(zhì)做母體，引入相應的催化機團，形成酶的化學修飾物。以合成的高分子聚合物為母體，根據(jù)酶的活性部位結構，連接上所需的功能機團或金屬配合物。第47頁,共64頁，星期六，2024年，5月主客體酶模型：環(huán)糊精、冠醚等；膠束酶模型;肽酶；抗體酶：分子印跡酶；半合成酶；雜化酶;模擬酶的分類第48頁,共64頁，星期六，2024年，5月環(huán)糊精模擬酶側(cè)鏈上接上羥基、咪唑基和羧基，模擬胰凝乳蛋白酶結果：催化對叔丁基苯乙酸酯的水解速度比天然酶一倍第49頁,共64頁，星期六，2024年，5月分子印跡模擬酶實例模擬結果：以R-1-苯乙醇與月桂酸的酯化反應為模型反應，獲得了高效的非水相脂肪酶，印跡酶在有機相中對新構象的記憶時間達幾周，極大提高了脂肪酶的對映體選擇性。第50頁,共64頁，星期六，2024年，5月抗體酶抗體的特性1）蛋白質(zhì)特性2）能高選擇配體，專一性與抗原結合3）種類達千萬種酶的特性1）大部分為蛋白質(zhì)2）能高選擇性結合底物，催化反應高效進行

1.抗體酶的理論基礎第51頁,共64頁，星期六，2024年，5月第52頁,共64頁，星期六，2024年，5月12第53頁,共64頁，星期六，2024年，5月抗體酶催化的應用實例重排反應模擬結果：以椅式構象的氧雜雙環(huán)化合物為反應的過渡態(tài)類似物，制備了催化分支酸為預苯酸的抗體酶，比原反應速度快102-104倍，而且僅催化（—）分支酸。第54頁,共64頁，星期六，2024年，5月縮合反應第55頁,共64頁，星期六，2024年，5月轉(zhuǎn)酯基反應第56頁,共64頁，星期六，2024年，5月酰胺鍵的形成第57頁,共64頁，星期六，2024年，5月