第第頁激光掃描共聚焦熒光顯微鏡的成像原理和基本結(jié)構(gòu)顯微鏡操作規(guī)程

（激光掃描共聚焦熒光顯微鏡）是一種利用計算機、激光和圖像處理技術(shù)獲得生物樣品三維數(shù)據(jù)、先進的分子細胞生物學的分析儀器。緊要用于察看活細胞結(jié)構(gòu)及特定分子、離子的生物學變化，定量分析，以及實時定量測定等。

成像原理

接受點光源照射標本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100—200nm；相對于焦平面上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號傳輸至計算機，終在屏幕上聚合成清楚的整個焦平面的共聚焦圖像。

每一幅焦平面圖像實際上是標本的光學橫切面，這個光學橫切面總是有確定厚度的，又稱為光學薄片。由于焦點處的光強宏大于非焦點處的光強，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統(tǒng)的景深貌似為零，沿Z軸方向的掃描可以實現(xiàn)光學斷層掃描，形成待察看樣品聚焦光斑處二維的光學切片。把X—Y平面（焦平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結(jié)合，通過累加連續(xù)層次的二維圖像，經(jīng)過專門的計算機軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。即檢測針孔和光源針孔始終聚焦于同一點，使聚焦平面以外被激發(fā)的熒光不能進入檢測針孔。

激光共聚焦的工作原理簡單表達就是它接受激光為光源，在傳統(tǒng)熒光顯微鏡成像的基礎上，附加了激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，通過計算機掌控來進行數(shù)字化圖像采集和處理的系統(tǒng)。

基本結(jié)構(gòu)

（激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)）緊要包括掃描模塊、激光光源、熒光顯微鏡、數(shù)字信號處理器、計算機以及圖像輸出設備等。

（1）掃描模塊

掃描模塊緊要由針孔光欄（掌控光學切片的厚度）、分光鏡（按波長更改光線傳播方向）、發(fā)射熒光分色器（選擇確定波長范圍的光進行檢測）、檢測器（光電倍增管）構(gòu)成。熒光樣品中的混合熒光進入掃描器，經(jīng)過檢測針孔光欄、分光鏡和分色器選擇后，被分成各單色熒光，分別在不同的熒光通道進行檢測并形成相應的共焦圖象，同時在計算機屏幕上可以顯示幾個并列的單色熒光圖象及其合成圖象。

（2）熒光顯微鏡系統(tǒng)

顯微鏡是LSCM的緊要組件，它關系到系統(tǒng)的成像質(zhì)量。顯微鏡光路以無限遠光學系統(tǒng)可便利地在其中插入光學選件而不影響成像質(zhì)量和測量精度。物鏡應選取大數(shù)值孔徑平場復消色差物鏡，有利于熒光的采集和成像的清楚。物鏡組的轉(zhuǎn)換，濾色片組的選取，載物臺的移動調(diào)整，焦平面的記憶鎖定都應由計算機自動掌控。

激光掃描共聚焦顯微鏡所用的熒光顯微鏡大體與常規(guī)熒光顯微鏡相同，但又有其特點：需與掃描器連接，使激光能進入顯微鏡物鏡照射樣品，并使樣品發(fā)射的熒光到達檢測器；需有光路轉(zhuǎn)換裝置，即汞燈與激光轉(zhuǎn)換，同時汞燈光線強度可調(diào)。

（3）常用激光器

激光掃描共聚焦顯微鏡使用的激光光源有單激光和多激光系統(tǒng)，常用的激光器包括以下三種類型：

半導體激光器：405nm（近紫外譜線）

氬離子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm（藍綠光）

氦氖激光器：543nm（綠光—氦氖綠激光器）633nm（紅光氦氖紅激光器）

UV激光器（紫外激光器）：351nm、364nm（紫外光）

（4）輔佑襄助設備

風冷、水冷冷卻系統(tǒng)及穩(wěn)壓電源。

激光掃描共聚焦顯微鏡的基本工作原理是首先由激光器發(fā)射的確定波長的激發(fā)光，光線經(jīng)放大后通過掃描器內(nèi)的照明針孔光欄形成點光源，由物鏡聚焦于樣品的焦平面上，樣品上相應的被照射點受激發(fā)而發(fā)射出的熒光，通過檢測孔光欄后，到達檢測器，并成像于計算機監(jiān)視屏上。這樣由焦平面上樣品的的每一點的熒光圖像構(gòu)成了一幅完整的共焦圖像，稱為光切片。

倒置熒光顯微鏡的適用倒置熒光顯微鏡是指與一般顯微鏡相比，其物鏡、聚光鏡和光源的位置都顛倒過來，由熒光附件與顯微鏡有機結(jié)合構(gòu)成的顯微鏡。

激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面，被反射到物鏡中并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進入物鏡，經(jīng)雙色束分別器使激發(fā)光和熒光分開而成像。

物鏡和聚光鏡的工作距離很長，能直接對培育皿中的被檢物體進行顯微察看和討論。

適用于土壤微生物培育試驗，具有在培育瓶或培育皿內(nèi)進行顯微察看的特點，可以察看不經(jīng)染色的透亮活體。

特別適用于對活體細胞和細胞離體培育等顯微察看。

高信噪比（S/N），能夠捕獲極弱熒光

光學品質(zhì)——對現(xiàn)代生命科學討論至關緊要

熒光察看的理想情況是接受最低量的激發(fā)光照射捕獲高對比度的圖像，由此將細胞受損及熒光衰減的機會降至最小。

對UIS2系統(tǒng)的物鏡進行精密的設計，使用微弱的激發(fā)光即可捕獲光亮的熒光圖像。光透過率進步的同時也提高了UIS2光學系統(tǒng)的信噪比。

干涉鍍膜熒光激發(fā)塊的性能改進熒光激發(fā)塊的干涉膜接受了新型鍍膜技術(shù)，激發(fā)帶寬（BP）以及熒光帶寬（BA）比傳統(tǒng)譜線縮短了6nm，使信噪比更進一步得到提高。

熒光激發(fā)塊接受硬鍍膜技術(shù)，大大延長了激發(fā)塊的使用壽命，提高了在潮濕環(huán)境中的使用性能。

熒光蛋白專用高質(zhì)量熒光激發(fā)塊

BX2系列HQ型熒光激發(fā)塊較為適合的波長是ECFP/EFP/EYFP/DsRed。高銳化鍍膜以及高透過率（90%—95%）可有效地透過熒光蛋白所發(fā)射的熒光。

這樣，即使接受微弱的激發(fā)光仍可察看到光亮的圖像，同時，防止熒光衰減，并將細胞受損的可能減至最小。

削減雜散光的功能

當在分光鏡對激發(fā)光進行反射時，雜散光的微量透射就可造成噪聲上升。

熒光激發(fā)塊經(jīng)由其獨特的光吸取涂層可吸取99%以上的雜散光，削減信號干擾，獲得高質(zhì)量圖像。

熒光成像用高數(shù)值孔徑物鏡

BX2系列具有新研制的PLAPON60XO物鏡的特點，