組織化學(xué)基本概念：

組織化學(xué)：組織水平，對組織內(nèi)存在各種物質(zhì)進(jìn)行定性、定量以及其局部和移動部位分析方法

免疫組織化學(xué)：基于抗原抗體反應(yīng)酶組織化學(xué)免疫組化技術(shù)講義專家講座第1頁疾病病理學(xué)研究概括起來主要在基因和蛋白水平上進(jìn)行研究。

免疫組織化學(xué)方法主要用于基因蛋白質(zhì)水平表示研究。蛋白表示=>分布，定位，定量；蛋白表示與與腫瘤生物學(xué)行為及預(yù)后關(guān)系等免疫組化技術(shù)講義專家講座第2頁材料：抗體：多克隆抗體：為針對多個抗原決定簇抗體，為產(chǎn)生抗體動物血清或免疫球蛋白。單克隆抗體：為一個B淋巴細(xì)胞分化增殖產(chǎn)生抗體，可識別有限抗原決定簇，特異性強(qiáng)。免疫組化技術(shù)講義專家講座第3頁顯示物：酶標(biāo)反應(yīng)：①堿性磷酸酶（Alkatinephasphotase,AP）AP與不一樣底物（萘酚As-Mx、快藍(lán)、快紅）作用，可形成不一樣顏色終產(chǎn)物。用新品紅（Newfuchsine）顯色，可形成不溶于有機(jī)溶劑紅色沉淀，不褪色。②辣根過氧化酶(Horseradiseperoaidase,)HRP：底物為DAB－四鹽酸二氨基聯(lián)苯胺，產(chǎn)生棕色沉淀，不溶于有機(jī)溶劑，不褪色。免疫組化技術(shù)講義專家講座第4頁熒光標(biāo)識：熒光素標(biāo)識抗體異硫氰酸熒光素（Fluorescienisothioyarale,FITC）520－530nm四甲基異硫氰酸羅達(dá)明（Teramethylerhodamineisothiecyanata,TRITC）620nm四乙基羅達(dá)明（TeraethylerhodamineB200,RB200）590－600nm免疫組化技術(shù)講義專家講座第5頁膠體金：指金水溶膠（以微小粒子分散在水溶液中，免疫電鏡觀察免疫組化技術(shù)講義專家講座第6頁主要方法：直接法：間接法：經(jīng)過了第二抗體放大效應(yīng)免疫組化技術(shù)講義專家講座第7頁P(yáng)AP法：以過氧化物酶和抗過氧化酶抗體形成復(fù)合物，經(jīng)過第二抗體橋接與第一抗體結(jié)合，然后以酶底物反應(yīng)檢出。免疫組化技術(shù)講義專家講座第8頁ABC法：生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）為含有高度親合性物質(zhì)，一個卵白素分子可結(jié)合4個生物素。當(dāng)生物素標(biāo)上特定標(biāo)識物質(zhì)后or與抗體結(jié)合后仍能與卵白素結(jié)合，所以，將抗體結(jié)合上生物素，然后與卵白素和帶有特殊標(biāo)識物生物素結(jié)合反應(yīng)，而以適當(dāng)方式顯示。免疫組化技術(shù)講義專家講座第9頁S-P法（LSAB）：采取生物素標(biāo)識第二抗體與鏈霉素生物素蛋白連接過氧化物酶及基質(zhì)素（底物）混合液來測定細(xì)胞和組織中抗原。免疫組化技術(shù)講義專家講座第10頁Envision：原理：第二抗體上標(biāo)識有多聚物酶（HRPorAP）復(fù)合物與第一抗體結(jié)合。二抗上多聚物可結(jié)合許多HRP分子，使信號有顯著提升，敏感性較PAP法，ABC法高出幾十倍，背景因多聚物葡聚糖是人體內(nèi)不存在，無非特異性干擾，尤其是多聚物酶分子結(jié)合第二抗體孵育時間短，該方法更省時，簡便。免疫組化技術(shù)講義專家講座第11頁以LSAB法為例簡單介紹染色步驟：①石蠟切片脫蠟－水；②3%H202抑制內(nèi)源性過氧化物酶15min；③每張切片加10-20ul非免疫性動物血清，室溫孵育5min；④加特異性一抗，370C孵育30－60min，or40C過夜；⑤加20ul生物素標(biāo)識第二抗體，370C

，30min；免疫組化技術(shù)講義專家講座第12頁⑥加過氧化物酶標(biāo)定鏈菌素親生物素，370C，30min；⑦以上每步后均用PBS液洗3×3min；⑧用過氧化物酶基質(zhì)液（DAB基質(zhì)液）顯色5－15min。在光鏡下觀察。⑨自來水沖洗，蘇木素淺染，自來水沖洗還藍(lán)，梯度酒精脫水，干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。免疫組化技術(shù)講義專家講座第13頁免疫組化常見問題處理：組織材料處理：固定液為：10%中性福爾馬林液；4%多聚甲醛磷酸緩沖液（PH7.4）；固定時間：8-24hr組織大?。?*1.5*0.3cm免疫組化技術(shù)講義專家講座第14頁防脫片處理：多聚-L-賴氨酸；硫酸鉻鉀明膠液。免疫組化技術(shù)講義專家講座第15頁增強(qiáng)特異性染色辦法和方法：

1）蛋白酶消化：a、胰蛋白酶消化（0.05-0.1%）；b、胃蛋白酶消化（0.4%）。2）熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)：方法：微波960C,10min；直接加溫方法1000C,10min；高壓鍋1200C,10min；熱處理液：0.01mol/LPH6.0檸檬酸緩沖液免疫組化技術(shù)講義專家講座第16頁適當(dāng)抗體稀釋度：

過高，過低均會造成陰性結(jié)果。即用型抗體；濃縮型。免疫組化技術(shù)講義專家講座第17頁降低或消除非特異性染色方法：非特異性染色：原因：方法：免疫組化技術(shù)講義專家講座第18頁對照：

陽性對照：用一直抗原陽性切片與待測標(biāo)本同時進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，陽性對照應(yīng)呈陽性結(jié)果，即為陽性對照。陰性對照：用不含一直抗原標(biāo)本作對照，試驗結(jié)果為陰性，即為陰性對照。陰性對照中還包含空白對照、替換對照、吸收和抑制對照等，用以排除假陽性結(jié)果。免疫組化技術(shù)講義專家講座第19頁染色特異性染色非特異性染色顯色部位特定細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)均勻染色或更強(qiáng)顯色定位特定，含有結(jié)構(gòu)性無特定部位，無結(jié)構(gòu)性顯色程度同一部位呈不一樣程度顯色無分布規(guī)律，某一片均勻著色

免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷應(yīng)非常嚴(yán)謹(jǐn)，陽性細(xì)胞染色分布有三種類型：胞漿型、細(xì)胞核型和細(xì)胞膜表面型。陽性細(xì)胞顯色深淺可反應(yīng)出抗原濃度，并以此作為定性、定量和定位依據(jù)。陽性細(xì)胞染色常定位于細(xì)胞，并于陰性細(xì)胞間有顯著間隔，而非特異性染色常不限于單個細(xì)胞，而是累及一片細(xì)胞，二者可顯著區(qū)分。免疫組化技術(shù)講義專家講座第20頁陽性細(xì)胞染色特征：

①陽性細(xì)胞染色分布有三種：

胞漿；細(xì)胞核；細(xì)胞膜表面②陽性細(xì)胞分布：灶性；彌漫性③染色強(qiáng)度不一④切片邊緣，刀痕or組織折疊，壞死，擠壓區(qū)，膠原結(jié)締組織等常表現(xiàn)為相同陽性染色強(qiáng)度。對于陽性結(jié)果定量判斷：-，+，++，+++等分級和計數(shù)統(tǒng)計

免疫組化技術(shù)講義專家講座第21頁淋巴細(xì)胞標(biāo)識物：白細(xì)胞共同抗原（LCA,CD45）：主要分布于T,B細(xì)胞，單核細(xì)胞，粒細(xì)胞表面。CD20：B細(xì)胞標(biāo)識物。CD45RO、CD3：T細(xì)胞標(biāo)識物。CD57：為自然殺傷細(xì)胞標(biāo)識物。CD38：為漿細(xì)胞標(biāo)識物。CD68：主要標(biāo)識各種組織中巨噬細(xì)胞。免疫組化技術(shù)講義專家講座第22頁神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)識物：嗜鉻素A（Chromogranin,CgA）：存在于神經(jīng)元，神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞及其腫瘤中。突觸素（Synaptophysin,Sy）：存在于神經(jīng)元突觸前囊泡膜上，腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中。髓磷脂鹼性蛋白（Myelinbasicprotein,MBP）：

免疫組化技術(shù)講義專家講座第23頁激素及激素受體類標(biāo)識：雄激素受體（Androgenreceptor,AR）：雌激素受體（Estrogenreceptor,ER）孕激素受體（Progesteronereceptor,PR）：垂體激素：ACTH,GH,PRL,LH,TSH主要用于垂體腺瘤功效分類。降鈣素（Calcitotin,CT）：甲狀腺旁細(xì)胞（C細(xì)胞）分泌。

免疫組化技術(shù)講義專家講座第24頁以上抗體及標(biāo)識物主要用于疾病病理診療和判別診療其聯(lián)合應(yīng)用作用和意義：Keratin＋Vimentin－上皮性腫瘤Keratin＋滑膜腫瘤Vimentin＋間皮腫瘤上皮樣肉瘤癌肉瘤免疫組化技術(shù)講義專家講座第25頁Des＋orActin＋肌源性腫瘤CD34＋orFⅧ＋血管性腫瘤Keratin－S-100＋orMBP＋神經(jīng)鞘膜瘤Vimentin＋LCA＋淋巴細(xì)胞

AACT＋骨腫瘤、纖維組織細(xì)胞腫瘤GFAP＋膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤

Keratin－NSE＋orSy＋Vimentin－NF－／＋節(jié)細(xì)胞神經(jīng)母細(xì)胞瘤免疫組化技術(shù)講義專家講座第26頁免疫組化用于病理診療及判別診療標(biāo)準(zhǔn)：①免疫組化用于病理診療及判別診療，必須以HE染色形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，免疫組化只能作為輔助伎倆。不能把免疫組化染色作為診療“金標(biāo)準(zhǔn)”。②免疫組化對良、惡性判斷僅供參考。③免疫組化用于判斷組織起源，分型，預(yù)后預(yù)計。④免疫組化染色不好或出現(xiàn)相互矛盾結(jié)果時，以形態(tài)學(xué)為準(zhǔn)。免疫組化技術(shù)講義專家講座第27頁電子顯微鏡技術(shù)：透射電鏡免疫組化技術(shù)講義專家講座第28頁透射電鏡掃描電鏡電子顯微鏡技術(shù)免疫組化技術(shù)講義專家講座第29頁透射電鏡掃描電鏡免疫組化技術(shù)講義專家講座第30頁固定：