基因修飾的三種方法基因修飾的三種方法第1頁基因修飾

基因修飾主要是指利用生物化學(xué)方法修改DNA序列，將目標(biāo)基因片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，或者將特定基因片段從基因組中刪除，從而改變宿主細(xì)胞基因型或者使得原有基因型得到加強作用。

基因修飾方法需要利用到同源重組技術(shù)，然而利用天然同源重組效率比較低。ZFNs、TALEN與CRISPR-Cas9是三種主要基因修飾新方法。吳健雄學(xué)院.5.14基因修飾的三種方法第2頁ZFNs

ZFNs（Zincfingernucleases）方法利用了一個每個分子能夠特異性識別三個堿基鋅指蛋白來識別DNA，兩段鋅指蛋白與DNA結(jié)合后連接于鋅指蛋白DNA剪切酶（比如FokI）二聚，使DNA斷裂。鋅指結(jié)構(gòu)吳健雄學(xué)院.5.14基因修飾的三種方法第3頁ZFNs

ZFNs方法優(yōu)點在于理論上只要找到正確鋅指蛋白分子就能夠任意調(diào)控DNA。不過實際上找到完全匹配三連子鋅指非常困難，而且這種方法脫靶率較高，所以并沒有得到廣泛使用。ZFNs法切斷DNA過程吳健雄學(xué)院.5.14基因修飾的三種方法第4頁TALENTALEN（TranscriptionActivator-LikeEffectorsnucleases）方法利用了TALE蛋白，這種蛋白核酸結(jié)合域氨基酸序列能夠和堿基特異性結(jié)合。只需要四種TALE蛋白即可實現(xiàn)與任意DNA片段結(jié)合，相比于ZFNs方法成功率高、適用范圍廣、效率也更高。TALE蛋白與FokI連接體與DNA結(jié)合吳健雄學(xué)院.5.14基因修飾的三種方法第5頁TALEN然而TALEN方法也存在著一定問題，因為制備一個蛋白分子非常麻煩，TALEN方法工作量極大，時間花費長，同時產(chǎn)生蛋白分子活性也無法得到確保。TALEN蛋白分子結(jié)構(gòu)吳健雄學(xué)院.5.14基因修飾的三種方法第6頁CRISPR-Cas9CRISPR-Cas是很多細(xì)菌和大個別古生菌天然免疫系統(tǒng)，能夠特異性識別入侵DNA并利用Cas蛋白進(jìn)行切割。在此方法中實現(xiàn)識別DNA序列是crRNA；與Cas蛋白連接是高度保守tracrRNA，crRNA與tracrRNA共同組成了向?qū)NA。向?qū)NA結(jié)構(gòu)吳健雄學(xué)院.5.14基因修飾的三種方法第7頁CRISPR-Cas9與TALEN方法相比，CRISPR-Cas9不需要制備蛋白分子，只需制備RNA，工作量較小。而且因為tracrRNA高度保守，每次制取時只需要制備crRNA。不過此方法缺點是靶序列后必須有NGG才能被向?qū)NA識別，不過因為人類平均每八個堿基就會出現(xiàn)一個NGG，這個缺點較輕易克服。吳健雄學(xué)院.5.14基因修飾的三種方法第8頁總結(jié)

不論是ZFNs、TALEN還是CRISPR-Cas9，這些方法根本目標(biāo)都是尋找一個更簡便、效率更高方法來識別出目標(biāo)DNA序列并在指定位置切斷DNA，從而使得同源重組更輕易進(jìn)行。方便人類在希望位置插入、替換或敲出DNA序列，得到大家希望基因型。

伴隨技術(shù)進(jìn)步，基因修飾方法會越來越多，實現(xiàn)DNA調(diào)控也將會越來越便捷。相信當(dāng)人類能夠隨心所欲操控DNA時候，許多疾病都將看到治愈希望，這項技術(shù)也將極大造福人類。吳健雄學(xué)院.5.14基因修飾的三種方法第9頁感激觀看歡迎提出寶貴意見參考文件[1]鐘強趙書紅鋅指蛋白核酸酶作用原理及其應(yīng)用

HEREDITAS年2月33(2):123-130[2]李鐵民杜波CRISPR-Cas系統(tǒng)與細(xì)菌和噬菌體共進(jìn)化《遺傳》年03期[3]