第第頁脫氫酶（dehydrogenase,DHA）試劑盒說明書脫氫酶（dehydrogenase,DHA）試劑盒說明書微量法100管/96樣注意：正式測定之前選擇23個預期差別大的樣本做猜測定。測定意義：脫氫酶（dehydrogenase,DHA）是一類催化物質氧化還原反應的酶，催化底物通過細胞色素系統(tǒng)被氧化，釋放的能量供機體使用，是生物體取得能量的一種方式。測定原理：在細胞呼吸過程中，氫受體2,3,5氯化三苯基四氮唑（2,3,5TriphenylTetrazoliumChloride,TTC）在脫氫酶作用下接受氫以后，被還原為三苯基甲鐟（TriphenylFormazone,TF），TF呈現(xiàn)紅色，于485nm測定其吸光值，即得脫氫酶活性。自備試驗儀器及用品：篩子、天平、恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、冰、蒸餾水、甲醇（不允許快遞，請用戶自備）。試劑的構成和配制：提取液：液體100mL×1瓶，4℃保管試劑一：粉劑×1瓶，使用前加10mL試劑二溶解，4℃避光保管（盡量現(xiàn)配現(xiàn)用）。試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保管。試劑三：甲醇，自備。樣品處理：1.細菌、真菌：依照細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波碎裂細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。2.組織：依照組織質量（g）：提取液體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心20min。3.液體：直接檢測。測定步驟和操作表：空白管測定管樣品（μL）100蒸餾水（μL）100試劑一（μL）100試劑二（μL）100充分混勻，37℃培養(yǎng)24h試劑三（μL）900900振蕩1h，8000g，25℃，離心5min，取200μL上清于微量石英比色皿/96孔板，測定A485，△A=A測定A空白管?？瞻坠苤灰鲆还?。脫氫酶活力計算：a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下標準曲線：y=0.0422x0.0312；R2=0.9988；x為標準品濃度（μg/mL），y為吸光值。1.依照蛋白濃度計算酶活單位定義：在37℃時，每mg蛋白樣品每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。DHA（μg/min/mgprot）=（△A+0.0312）÷0.0422×V反總÷（Cpr×V樣）÷T=0.181×（△A+0.0312）÷Cpr2．依照樣本質量計算酶活單位定義：在37℃時，每克樣品每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。DHA（μg/min/g鮮重）=（△A+0.0312）÷0.0422×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T=0.181×（△A+0.0312）÷W3.按液體體積計算酶活單位定義：在37℃時，每mL樣本每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。DHA（μg/min/mL）=（△A+0.0312）÷0.0422×V反總÷V樣÷T=0.181×（△A+0.0312）V反總：反應總體積，1.1mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.1mL；T：培養(yǎng)時間，1d=1440min；W：樣品質量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL。b.用96孔板測定的計算公式如下標準曲線：y=0.0211x0.0312；R2=0.9988；x為標準品濃度（μg/mL），y為吸光值。1.依照蛋白濃度計算酶活單位定義：在37℃時，每mg蛋白樣品每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。DHA（μg/min/mgprot）=（△A+0.0312）÷0.0211×V反總÷（Cpr×V樣）÷T=0.362×（△A+0.0312）÷Cpr2．依照樣本質量計算酶活單位定義：在37℃時，每克樣品每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。DHA（μg/min/g鮮重）=（△A+0.0312）÷0.0211×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T=0.362×（△A+0.0312）÷W3.按液體體積計算酶活單位定義：在37℃時，每mL樣本每min催化產生1μgTF為一個酶活性單位。DHA（μg/min/mL）=（△A+0.0312）÷0.0211×V反總÷V樣÷T=0.362×（△A+0.0312）V反總：反應總體積，1.1mL；V樣：加入