ICS07.080GB/T33526—2017轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品數(shù)字PCR檢測方法中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局IGB/T33526—2017本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由全國生化檢測標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC387)提出并歸口。1GB/T33526—2017轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品數(shù)字PCR檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了轉(zhuǎn)基因成分檢測的數(shù)字PCR方法。PCR檢測。本標(biāo)準(zhǔn)所能達(dá)到的檢測低限為0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19495.1轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測通用要求和定義GB/T19495.3轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸提取純化方法GB/T19495.7轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測抽樣和制樣方法3.1轉(zhuǎn)錄自18srDNA,是細(xì)胞核糖體的組分之一。3.2CaMV35s啟動子基因CaMV35spro來自花椰菜花葉病毒(Cauliflowermosaicvirus,CaMV)的35s啟動子。3.3來自胭脂堿合成酶基因NOS的終止子。4原理數(shù)字PCR其技術(shù)原理是通過將原始PCR反應(yīng)體系進(jìn)行分割，進(jìn)而對所有小的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增現(xiàn)階段數(shù)字PCR的實(shí)現(xiàn)形式包括芯片式數(shù)字PCR與微滴式數(shù)字PCR兩種。其中芯片式數(shù)字這種分割方式的實(shí)驗(yàn)成本相對較高；微滴式數(shù)字PCR平臺通過產(chǎn)生微小油包水體系實(shí)現(xiàn)反應(yīng)體系的分2GB/T33526—2017本標(biāo)準(zhǔn)針對通用篩選元件CaMV35s啟動子和NOS終止子設(shè)計(jì)選取特異性引物和探針進(jìn)行數(shù)字18s-F:5'-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3'18s-R:5'-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3′18s-P:5'-VIC-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-BHQ1-3′p35s-F:5'-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3′p35s-R:5'-CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3'p35s-P:5'-VIC-CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-BHQ1-3′TNOS-F:5'-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3'TNOS-R:5'-ATTGCGGGACTCTAATCATA-3'TNOS-P:5'-VIC-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-BHQ1-3'6.3數(shù)字PCR擴(kuò)增儀。3GB/T33526—20176.9不同量程移液器以及配套吸頭如下：按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的規(guī)定執(zhí)行。按照GB/T19495.1和GB/T19495.3的規(guī)定執(zhí)行。7.4DNA模板制備按照GB/T19495.1和GB/T19495.3的規(guī)定執(zhí)行。7.5.1試樣數(shù)字PCR反應(yīng)每個試樣內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因數(shù)字PCR反應(yīng)設(shè)置3個平行。并按照表1的組分和終濃度配置數(shù)字PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)體系配置完成后，進(jìn)行反應(yīng)體系的分割，其中芯片法數(shù)字PCR通過微流控芯片實(shí)現(xiàn)本步驟，微滴法數(shù)字PCR通過形成油包水結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)體系的分割。該步驟按照不同數(shù)字PCR平臺的說明書進(jìn)行操作。數(shù)字PCR反應(yīng)的有效分割體系數(shù)不得低于理論分割體系數(shù)的60%。試劑終濃度體系2×反應(yīng)Mix"20μmol/LzSSIIb-F/p35s-F/TNOS-F20μmol/LzSSIIb-R/p35s-R/TNOS-R20μmol/LzSSIIb-P/p35s-P/TNOS-P50ng/μLDNA模板12.5ng/μL水總體系推薦市面上現(xiàn)售的數(shù)字PCR平臺進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并針對市面上現(xiàn)售的不同數(shù)字PCR平臺，依據(jù)說明書調(diào)整反應(yīng)體系的組分和最終體積，并保證表中所列組分的終濃度不變。4GB/T33526—2017體系分割完成后，進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng)。熒光分析步驟采用VIC單熒光通道，反應(yīng)程序如表2表2數(shù)字PCR反應(yīng)程序步驟溫度持續(xù)時間循環(huán)數(shù)熱激活50℃1變性退火延伸60℃注：不同PCR反應(yīng)平臺可以根據(jù)說明書對熱啟動步驟程序進(jìn)行修改，但是不能對擴(kuò)增程序進(jìn)行修改。每個試樣外源基因數(shù)字PCR反應(yīng)設(shè)置3個平行。外源基因擴(kuò)增所用反應(yīng)體系與反應(yīng)程序與7.5.1.1相同，擴(kuò)增所使用的引物探針為5.4與5.5所述引物探針。7.5.2對照數(shù)字PCR反應(yīng)根據(jù)數(shù)字PCR結(jié)果中擴(kuò)增曲線的基線或者體系中陰性分割體系的終點(diǎn)熒光值設(shè)定熒光的閾值限。閾值限需要對陰性和陽性擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行明顯的區(qū)分。陰性對照組只有內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的擴(kuò)增，空白對照組沒有任何擴(kuò)增現(xiàn)象，這表明數(shù)字PCR反應(yīng)體系正8.3.1內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因得到了明顯的擴(kuò)增，并且外源p-35s或NOS基因的任何一個出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增現(xiàn)象，陽性擴(kuò)增體系內(nèi)擴(kuò)增曲線形狀良好或者其終點(diǎn)熒光信號值超過熒光閾值，這表明試樣中檢測出了p-35s8.3.2內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因得到了明顯的擴(kuò)增，且其擴(kuò)增曲線形狀良好并超過閾值限，而p-35s或T-NO