CCSB41牛呼吸道合胞體病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法Real-timeRT-PCRmet中國獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布IT/CVMA145—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由湖南冠牧生物科技有限公司提出。本文件由中國獸醫(yī)協(xié)會(huì)歸口。本文件起草單位：湖南冠牧生物科技有限公司、上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、江西省農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護(hù)站、長沙海關(guān)檢驗(yàn)技術(shù)中心、遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、榆林市農(nóng)業(yè)宣傳信息中心。本文件主要起草人：楊忠蘋、王濤、馬麗、肖金年、楊德全、奉佳、陳桂平、禹思宇、劉林青、蘭德松、白艷艷、李鑫。1T/CVMA145—2024牛呼吸道合胞體病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法本文件描述了用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測牛呼吸道合胞體病毒。本文件適用于牛鼻拭子、血樣以及肺臟組織等樣品中牛呼吸道合胞體病毒核酸的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR：實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timefluorescencereversetranscriptpolymerasechainreaction）BRSV：牛呼吸道合胞體病毒（Bovinerespiratorysyncytialvirus）BHQ：無熒光淬滅基團(tuán)（Blackholequencher）Ct值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號量達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Cyclethreshold）DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）FAM：羧基熒光素（Carboxyfluorescein）HEX：六氯-6-甲基熒光素（Hexachlorofluorescein）PBS：磷酸鹽緩沖液（Phosphatebufferedsaline）RNA：核糖核酸（Ribonucleicacid）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApoiymerase）TEBuffer：Tris-EDTA緩沖液（Tris-EDTAbuffersolution）2T/CVMA145—20245原理本文件采用了TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)原理。反應(yīng)體系中包括一對用于擴(kuò)增的引物和一條能與PCR產(chǎn)物特異雜交的熒光標(biāo)記探針。探針的5′端標(biāo)記了熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端標(biāo)記了淬滅基團(tuán)。在進(jìn)行RT-PCR延伸反應(yīng)時(shí)，首先將一條RNA鏈逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板經(jīng)過PCR進(jìn)行DNA復(fù)制，Taq酶的5′外切酶活性將5′端熒光基團(tuán)從探針上切割下來，使其與淬滅基團(tuán)分離，從而儀器能檢測到5′端熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號，一分子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的生成伴隨一分子熒光信號的產(chǎn)生。隨著擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)的增加，儀器檢測到的熒光信號的累積反映了擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。本文件以BRSV的M基因序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成了一對特異性引物及探針達(dá)到檢測BRSV病原核酸的目的，同時(shí)在體系中引入人工合成的外源DNA片段作為外源內(nèi)標(biāo)，有效監(jiān)控因試劑失效、操作錯(cuò)誤、樣本中存在PCR抑制物等原因帶來的假陰性結(jié)果，建立了牛呼吸道合胞體病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系。6試劑和材料6.1試劑6.1.1除非另有說明，所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水符合GB/T6682的要求，所有試劑均用無RNA酶的容器分裝。6.1.2FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光試劑盒（探針法），含RT-PCR擴(kuò)增所需的逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、buffer、Mg2+、dNTPs等組分。6.1.3TEBuffer(pH8.0)：配制方法按照附錄A中A.1配制。6.1.4陽性對照、陰性對照、外源內(nèi)標(biāo)按照A.2、A.3和A.4配制，陽性對照質(zhì)粒和外源內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒序列見附錄B中B.1和B.2。6.2引物和探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增BRSV病原M基因及外源內(nèi)標(biāo)基因用上、下游引物和探針序列按附錄C中C.1設(shè)計(jì)合成。7儀器設(shè)備7.1熒光PCR儀。7.2組織勻漿器。7.3冷凍離心機(jī)。7.4振蕩器。7.5微量移液器（量程：0.5μL～10μL、2μL～20μL、20μL～200μL和200μL～1000μL）。7.6冰箱（2℃~8℃、?20℃以下及?70℃以下）。7.7高壓滅菌鍋。7.8全自動(dòng)核酸提取設(shè)備（選用）。3T/CVMA145—20248樣品的采集與處理8.1通則實(shí)驗(yàn)室生物安全要求應(yīng)符合GB19489。8.2采樣器材采樣拭子、剪刀、鑷子、5mL采樣管、一次性采樣袋、一次性采血器或注射器，采樣杯，PBS。拭子、采樣袋外，上述采樣工具應(yīng)經(jīng)121℃±2℃,15min高壓滅菌并烘干或經(jīng)160℃干烤2h。8.3樣品采集8.3.1鼻拭子用無菌棉拭子采集牛鼻道分泌物，采集時(shí)，將拭子反復(fù)刮擦牛鼻道分泌物，蘸取分泌物后，立即將棉拭子浸入1mL～2mL滅菌0.01mol/LpH7.2的PBS中，溶液配制方法按A.5進(jìn)行。4℃儲存，盡快送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。8.3.2血樣牛常用頸靜脈采血，采血時(shí)先用鑷子夾取碘伏棉球?qū)Σ裳课挥衫锵蛲庾鳇c(diǎn)狀螺旋式消毒，待干燥后采血。用一次性采血器或注射器，用針頭（一般用三棱針）穿刺靜脈后，將血液滴到直徑為3mm～4mm抗凝管（EDTA抗凝劑）內(nèi)（長度為4cm-6cm），并立即連續(xù)搖動(dòng)后將口封好，豎立存放。8.3.3肺臟組織采集牛肺臟組織時(shí)，如已死亡的動(dòng)物盡快采集，夏天不超過2h，冬天不超過6h（還要視具體溫度）。采集的動(dòng)物病料應(yīng)新鮮，盡可能減少污染，并盡快送實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。8.3.4其他樣品按照NY/T541-2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范的規(guī)定執(zhí)行。8.4樣品保存與運(yùn)輸上述采集的樣品需盡快用于檢測；如不能立即檢測的樣品，在2℃~8℃下保存應(yīng)不超過24h，?20℃±5℃下應(yīng)不超過3個(gè)月，?70℃下應(yīng)不超過1年。樣品運(yùn)送采用低溫保存進(jìn)行運(yùn)輸，并在規(guī)定溫度下的保存期內(nèi)送達(dá)。8.5樣品處理8.5.1鼻拭子取樣進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，振蕩器振蕩混勻30s，4℃4000r/min離心1min，取上清用于后續(xù)核酸提取。8.5.2血樣無需處理直接用于后續(xù)核酸提取。4T/CVMA145—20248.5.3肺臟組織取樣進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，用無菌剪、鑷取適量樣品按1：5的比例加入滅菌0.01mol/LpH7.2的PBS或生理鹽水（例如：1g組織樣品加5mLPBS或生理鹽水）。使用組織勻漿器研磨，后分裝到離心管中，凍融2次～3次4000r/min離心5min，取上清用于后續(xù)核酸提取。9操作方法9.1擴(kuò)增試劑的準(zhǔn)備與配制9.1.1在試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。9.1.2每個(gè)反應(yīng)的體系按照C.2配制，根據(jù)所需反應(yīng)數(shù)n，按n＋1配制反應(yīng)液，充分混勻后分裝，每個(gè)反應(yīng)管20μL。轉(zhuǎn)移反應(yīng)管至樣本制備區(qū)。9.2樣品核酸提取9.2.1在樣本制備區(qū)進(jìn)行。使用商品化病毒基因組RNA提取試劑盒提取病毒基因組RNA，也可采用其他等效的RNA提取方法。9.2.2實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備（使用當(dāng)天準(zhǔn)備，可選）：取出吸附柱（已套好收集管），加入250μL平衡液（Na和純化水），12000r/min離心1min，棄收集管中廢液，將吸附柱重新放回收集管中備用。9.2.3取1.5mL離心管，依次加入500μL裂解液和250μL待測樣本和10μL蛋白酶K，漩渦混勻，瞬時(shí)離心，室溫靜置5min。9.2.4將步驟9.1.3中的混合液全部轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000r/min離心1min，棄收集管中廢液，將吸附柱重新放回收集管中。9.2.5向吸附柱中加入800μL洗滌液A（純化水，Tris,氯化鈉，無水乙醇等），12000r/min離心1min，棄收集管中廢液，將吸附柱放入收集管中。9.2.6向吸附柱中加入800μL洗滌液B（純化水，Tris,氯化鉀，無水乙醇等），12000r/min離心1min，棄收集管中廢液，將吸附柱放入收集管中。9.2.7重新將吸附柱安置于收集管上，12000r/min離心1min，除盡殘留洗液，否則洗滌液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。9.2.8丟棄收集管，將吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5mL離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50μL~80μL洗脫液（對于雜質(zhì)、抑制物較多的復(fù)雜樣本，宜將洗脫液預(yù)熱至65℃后使用），室溫放置2min，12000r/min離心1min，丟棄吸附柱，1.5mL離心管中液體即為提取的核酸產(chǎn)物?？芍苯佑糜跈z測或保存于?20℃?zhèn)溆谩?.3加樣9.3.1在樣本制備區(qū)進(jìn)行。9.3.2在9.2.2的反應(yīng)管中分別加入9.1.8中提取的RNA溶液，以及陰性對照和陽性對照各5μL，使每管總體積達(dá)到25μL，記錄反應(yīng)管對應(yīng)的樣品編號。蓋好管蓋，振蕩或搖晃混勻后，3000r/min離心30s。轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)。9.4實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)9.4.1在擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行。應(yīng)使用能采集并區(qū)分FAM和HEX這兩種不同熒光信號的多通道熒光PCR儀。5T/CVMA145—20249.4.2將9.3.2中加樣后的反應(yīng)管放入熒光PCR檢測儀中，編輯樣品表后選定FAM檢測通道讀取BRSV檢測結(jié)果；選定HEX檢測通道讀取外源內(nèi)標(biāo)檢測結(jié)果，淬滅基團(tuán)均選擇無（None）熒光。之后如下設(shè)置反應(yīng)參數(shù)：——第一階段，反轉(zhuǎn)錄50℃15min；——第二階段，預(yù)變性95℃2min；——第三階段，95℃15s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)，在第三階段每個(gè)循環(huán)的退火延伸收集熒光信號，試驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判斷結(jié)果。10結(jié)果判定10.1結(jié)果分析條件設(shè)定閾值設(shè)定原則：閾值線設(shè)定于剛好超過陰性對照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。不同儀器可根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整。10.2試驗(yàn)成立的條件10.2.1陰性對照：HEX通道Ct≤35，呈典型擴(kuò)增曲線，且FAM通道無Ct值，無典型擴(kuò)增曲線。10.2.2陽性對照：HEX通道Ct≤35，呈典型擴(kuò)增曲線，且FAM通道Ct值≤35，呈典型擴(kuò)增曲線。10.2.310.2.1和10.2.2要求需在同一次試驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次試驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行。10.3結(jié)果描述及判定10.3.1被檢樣品HEX通道Ct≤35，呈典型擴(kuò)增曲線，且FAM通道無Ct值，無典型擴(kuò)增曲線，判定樣品中BRSV核酸陰性。10.3.2被檢樣品HEX通道Ct≤35，呈典型擴(kuò)增曲線，且FAM通道Ct≤35，呈典型擴(kuò)增曲線，判定樣品中BRSV核酸陽性。10.3.3被檢樣品HEX通道Ct≤35，呈典型擴(kuò)增曲線，且FAM通道35<Ct≤40，判定結(jié)果可疑，應(yīng)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。如果重復(fù)試驗(yàn)FAM通道Ct≤40，且典型擴(kuò)增曲線，判定樣品中BRSV核酸陽性，Ct值>40或無Ct值判定為陰性。10.3.4被檢樣品HEX通道Ct＞35，說明此次樣本檢測結(jié)果無效，需重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)。6T/CVMA145—2024溶液配制A.1TEBuffer(pH8.0)量取下列溶液于500mL燒杯中，1MTris-HClBuffer(pH8.0)5mL，0.5MEDTA(pH8.0)1mL，向燒杯中加入約400mLddH2O均勻混合；將溶液定容到500mL后；進(jìn)行無菌過濾，室溫保存。A.2陽性對照用500μLTEBuffer(pH8.0)將含BRSV檢測目標(biāo)片段的質(zhì)粒進(jìn)行溶解和10倍梯度稀釋，用本文件方法測定FAM通道Ct值，選擇值在20～25之間的稀釋倍數(shù)作為陽性對照。A.3陰性對照為滅菌生理鹽水：稱取0.9g氯化鈉，溶解在少量蒸餾水后，定容到100mL，高壓滅菌后作為陰性對照。A.4外源內(nèi)標(biāo)用500μLTEBuffer(pH8.0)將含人工合成的DNA外源內(nèi)標(biāo)片段的質(zhì)粒進(jìn)行溶解和10倍梯度稀釋，用本文件方法測定HEX通道Ct值，選擇值在20～25之間的稀釋倍數(shù)作為外源內(nèi)標(biāo)。A.50.01mol/LpH7.2的PBSA液：0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液：磷酸二氫鈉(NaH2PO4·H2O)27.6g，溶于蒸餾水中，最后稀釋至1000mL。B液：0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液：磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)71.6g，加蒸餾水溶解，最后稀釋至1000mL。0.2mol/LA液14mL，0.2mol/LB液36mL，加氯化鈉(NaCl)8.5g，用蒸餾水稀釋至1000mL。7T/CVMA145—2024陽性對照質(zhì)粒序列B.1陽性對照質(zhì)粒序列TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCtgcatatctagagaaagagagcatatattatgtaactacaaattggaaacacacggccactaaattctccattaagcctatagaggactgattctcacacaacttatcttaacacaacagaAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGC8T/CVMA145—2024GTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCB.2外源內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒序列TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCctggtacatggcggcgaataacagcatccagggccattcagatgtcggagacatcagcttctcgccgagAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTG