ICS07.080A21中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)植物次生代謝物生物堿的檢測液相色譜-L-國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會ⅠGB／T38571—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國測試技術(shù)研究院生物研究所、河北省食品檢驗研究院、中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院、河北醫(yī)科大學(xué)、中國計量大學(xué)。GB／T38571—2020植物次生代謝物生物堿的檢測液相色譜-質(zhì)譜法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測植物次生代謝產(chǎn)物生物堿的方法。樹堿、毛果蕓香堿、鬼臼毒素的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法樣品經(jīng)提取液超聲提取、離心后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，外標(biāo)法定量。4試劑或材料除非另有規(guī)定，所用試劑均為分析純。水為GB/T6682規(guī)定的一級水。10mL乙腈+90mL去離子水，混勻。色譜純。準(zhǔn)確移取甲酸1.0mL置于1L容量瓶中，用水定容，混勻。4.41%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸-乙腈溶液1mL甲酸+99mL乙腈，混勻。L乙酸銨溶液稱取乙酸銨3.854g,用去離子水溶解，定容至500mL。乙酸銨溶液用氨水調(diào)12GB／T38571—2020純度均不小于98%。生物堿儲備液準(zhǔn)確稱取0.100g相應(yīng)的生物堿分別置于100mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成濃度為1mg/mL的儲備液，于4℃避光保存，有效期2個月?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)儲備液樹堿、毛果蕓香堿、鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用甲醇定容，混勻，配制成-東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿、鬼臼毒素濃度為10mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4℃避光保存，可使用一周。有機相。5儀器設(shè)備5.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)：配有電噴霧離子源(ESI)和四級桿質(zhì)量分析器。電子天平感量為5.3離心機：最高轉(zhuǎn)速不低于95005.4超聲波清洗儀。5.6渦旋混合器。離心管6試樣制備植物組織、動物組織等固體樣品，絞碎并使其均質(zhì)。血液、尿液等液體樣品，將取得的全部原始樣品充分混勻后，待測。7試驗步驟乙腈渦旋混合超聲輔助提取加入無水硫酸鎂迅速振搖3GB／T38571—2020離心5min。取上清液5.0mL在45℃水浴中氮吹濃縮至干，用1.0mL10%乙腈溶液復(fù)溶，過微孔濾取血液試樣0.5mL于10mL離心管中，加入1mL乙酸銨-氨水緩沖溶液，渦旋混合1min,加入甲醇超聲輔助提取離心取上清液殘渣加入2.0mL甲醇重復(fù)提取一次，合并上清液，45℃水浴中氮吹濃縮至干，用1.0mL10%乙腈溶液復(fù)溶，過微孔濾膜，待測定。取尿液試樣1.0mL于10mL離心管中，準(zhǔn)確加入4.0mL含1%甲酸-乙腈溶液，渦旋混合1min45℃水浴中氮吹濃縮至干，用1.0mL10%乙腈溶液復(fù)溶，過微孔濾膜，待測定。7.2儀器參考條件7.2.1液相色譜參考條件如下：色譜柱內(nèi)徑或相當(dāng)者。b)流動相：流動相A—甲酸水溶液；流動相B—乙腈。梯度洗脫，梯度洗脫程序參見附錄A。流速e)進樣量：2μL。7.2.2質(zhì)譜參考條件如下：a)電離方式：電噴霧電離，正離子模式；翹氣輔助氣吹掃氣h)掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，11種生物堿質(zhì)譜參數(shù)參見附錄B。7.3混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備取相應(yīng)的空白樣品，按照6.2步驟進行處理，用得到的空白樣品提取液將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液逐級稀-東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、士的寧、喜樹堿、毛果由低到高進行檢測，以定量離子峰面積對質(zhì)量濃度作圖，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，得到11種生物堿的質(zhì)譜響應(yīng)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中11種生物堿的濃度。樣品溶液中各組分的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)4GB／T38571—2020稀釋后再進樣測定。7.5定性判定在相同條件測定樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，如果樣品溶液中檢出的色譜峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的某種組分峰的保留時間一致（變化范圍在±2.5%),并且所選擇的兩對子離子的質(zhì)荷比一致，樣品溶液中定性離子相對豐度與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中定性離子的相對豐度進行比較時，相對偏差不超過表1規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在該組分。11種生物堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總離子流圖參見附錄C。表1定性確定時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度>50%>20%~50%>10%~20%≤10%允許的相對偏差±20%±25%±30%±50%除不加試樣外，均按7.1~7.5測定條件和步驟進行。7.7方法的檢出限、定量限本標(biāo)準(zhǔn)的方法檢出限、定量限見附錄D。8試驗數(shù)據(jù)處理植物組織、動物組織組分含量按式(1)計算：式中：xi—試樣中待測組分含量，單位為微克每千克(μg/kg);i—由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的測試液中某種組分的質(zhì)量濃度，單位為微克每升(μg/L);V—定容體積，單位為毫升(mL);K—稀釋倍數(shù)；m—試樣質(zhì)量，單位為克(g)。計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。體液組分含量按式(2)計算：式中：xi—試樣中待測組分含量，單位為微克每升(μg/L);i—由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的測試液中某種組分的質(zhì)量濃度，單位為微克每升(μg/L);V定容—定容體積，單位為毫升(mL);K—稀釋倍數(shù)；GB／T38571—2020V試樣—試樣體積，單位為毫升(mL)。計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。9精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。56GB／T38571—2020附錄A（資料性附錄）梯度洗脫程序梯度洗脫程序見表A.1。表A.1梯度洗脫程序表時間/min流動相A/%流動相B/%002060007GB／T38571—2020附錄B（資料性附錄）11種生物堿質(zhì)譜參數(shù)11種生物堿質(zhì)譜參數(shù)見表B.1。序號物質(zhì)名稱母離子m/≈透鏡電壓V子離子m/≈碰撞能V1-東莨菪堿212番木鱉堿203烏頭堿434次烏頭堿435新烏頭堿416秋水仙堿217阿托品228士的寧219喜樹堿32毛果蕓香堿11鬼臼毒素01GB／T38571—2020附錄C（資料性附錄）11種生物堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的提取離子質(zhì)譜圖11種生物堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的提取離子質(zhì)譜圖見圖C.1。圖C.111種生物堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的提取離子質(zhì)譜圖89GB／T38571—2020附錄D（規(guī)范性附錄）方法檢出限、定量限方法檢出限、定量限見表D.1。分析物血液尿液動物組織中藥材其他植物組織檢