1/1miR-130b-3p有望作為人膀胱癌的標(biāo)志物miR-130b-3p有望作為人膀胱癌的標(biāo)志物miR-130b-3p有望作為人膀胱癌的標(biāo)志物呂夢(mèng)欣池虹陳俊霞重慶醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室摘要：

目的進(jìn)一步了解miRNA在膀胱癌中的潛在機(jī)制。

方法芯片分析4對(duì)人膀胱癌組織和相鄰正常組織中的miRNA的表達(dá)。

并用RT-qPCR來驗(yàn)證兩個(gè)最上調(diào)的miRNA及其靶基因的表達(dá)是否符合miRNA/mRNA芯片結(jié)果。

通過相關(guān)性分析和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)推斷并驗(yàn)證miR-130b-3p可以靶向PTEN。

應(yīng)用CCK8、EDU、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕、Transwell和細(xì)胞骨架等實(shí)驗(yàn)證明miR-130b可以影響膀胱癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲。

用Westernblot檢測(cè)PI3K/AKT和整合素1/FAK信號(hào)通路的關(guān)鍵靶蛋白。

結(jié)果人膀胱癌中miR-130b-3p表達(dá)高于癌旁且與PTEN表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

miR-130b-3p可下調(diào)PTEN表達(dá),導(dǎo)致PI3K/AKT和整合素1/FAK信號(hào)通路的激活,且與膀胱癌EJ細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲相關(guān)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-130b-3p抑制劑時(shí),可以重排細(xì)胞骨架。

結(jié)論本結(jié)果揭示miR-130b/PTEN有望用于人膀胱癌診斷和治療的標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞：

芯片;miR-130b-3p;PTEN;膀胱癌;作者簡(jiǎn)介：

陳俊霞:chjunxia@126.com收稿日期：

2016-11-21基金：

國家自然科學(xué)基金(81672536,81372203)miR-130b-3pmayserveasamarkerforhumanbladdercancermiR-130b-3pmayserveasamarkerforhumanbladdercancerLYUMeng-xinCHIHongCHENJun-xiaDept.ofCellBiologyandGenetics,ChongqingMedicalUniversity;Abstract：

ObjectiveTofurtherunderstandpotentialmechanismofmiRNAsinbladdercancer.MethodsHumanmicroarraywasusedtoanalyzetheexpressionofmiRNAsinfourpairhumanBCcancertissuesandadjacentnormaltissues.ThenRT-qPCRwasusedtoverifiedthattheexpressionoftwomostup-regulatedmiRNAsandtargetgenesforresultsofmiRNA/mRNAmicroarray.Subsequently,itwasdeducedthatmiR-130b-3pcouldtargetatPTENthroughabioinformaticsapproachanddual-luciferasereporterassay.CCK8,EDU,flowcytometry,woundhealing,TranswellandcytoskeletonassaywereappliedtoprovethatmiR-130bcouldaffectproliferation,apoptosis,migrationandinvasionofBCcells.TheeffectsofPTENregulatedbymiR-130b-3ponthekeytargetproteinexpressionofPI3K/AKTandintegrin1/FAKsignalingpathwayweredeterminedbyWesternblot.ResultsmiR-130b-3pwassignificantlyup-regulatedandnegativelycorrelatedwithPTENexpressioninclinicalbladdercancerspecimensascomparedwithnormalurothelialtissue.miR-130b-3pmimicscoulddown-regulatePTENexpression,whichleadstotheactivationofPI3K/AKTandintegrin1/FAKsignalingpathwayrelatedtocellproliferation,migrationandinvasioninbladdercancerEJcells.WhenthecellsweretransfectedwithmiR-130b-3pinhibitors,theycouldbesur-veyedwithrearrangingcytoskeleton.ConclusionsmiR-130b/PTENmaybeusedasamarkerforbladdercancer.Keyword：

microarray;miR-130b-3p;PTEN;bladdercancer;Received：

2016-11-21每年約44萬例新增膀胱腫瘤患者,其中約15萬人死亡。

高復(fù)發(fā)率是膀胱癌的一個(gè)代表性特征。

目前,尚無任何目標(biāo)分子被用于治療膀胱癌。

急需尋找具有改善臨床結(jié)果的新型治療靶標(biāo)[1-2]。

microRNAs在膀胱癌的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展中具有重要作用[3],其在腫瘤中明顯異常,并且可能參與膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展[4-5]。

膀胱癌有效的生物標(biāo)志物仍可被探索;miRNA似乎保持高度穩(wěn)定,提示應(yīng)用特定的miRNA可用于癌癥的診斷和治療[6]。

有報(bào)道表明miR-130家族在癌癥進(jìn)展中的作用[7],但是miRNA/mRNA表達(dá)譜的聯(lián)合分析揭示miR-130-3p對(duì)腫瘤進(jìn)展和發(fā)展,包括膀胱癌的作用迄今尚未見報(bào)道。

本研究揭示miR-130b-3p有望作為膀胱癌的診斷和治療的臨床標(biāo)志物。

1材料與方法1.1材料1.1.1主要試劑:1.1材料1.1.1主要試劑:miR-130b-3p的模擬物及抑制劑(吉瑪公司);EDU試劑盒、pmiR-RB-REPORTTM雙熒光素酶報(bào)告載體(廣州銳博公司);雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒及鬼筆環(huán)肽(Progema公司)。

培養(yǎng)基RPMI1640/DMEM1640(Gibico公司),轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000(Invitrogen公司)。

山羊抗兔抗體(Bioworld公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司);CCK8試劑(鼎國公司);蛋白酶抑制劑(Sigma公司)。

1.1.2標(biāo)本:接受放射治療或化療的患者(重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)。

從這些患者獲得知情同意書。

1.2方法1.2.1標(biāo)本處理:1.2方法1.2.1標(biāo)本處理:膀胱癌病理組織在手術(shù)后迅速置于液氮中,待芯片分析。

研究方案由重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)授權(quán)和監(jiān)督。

提取RNA進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2芯片檢測(cè):根據(jù)指導(dǎo)進(jìn)行微陣列雜交,包括純化RNA,轉(zhuǎn)錄成熒光cDNA,然后雜交到人類lncRNA/mRNA陣列v3.0(Arraystar)和人類miRNA陣列v2.0(Arraystar)上。

通過分層聚類鑒定膀胱癌和配對(duì)的非腫瘤組織之間的mRNA和miRNA的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異表達(dá)。

通過篩選倍數(shù)變化2.0和1.5以及P值0.05,分別保留mRNA和miRNA的顯著差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物。

1.2.3RT-qPCR檢測(cè):RT-qPCR確認(rèn)來自30個(gè)膀胱癌患者的微陣列數(shù)據(jù)。

根據(jù)制造商的方案,使用PrimeScriptReverseTranscriptase將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

通過使用SYBRGreen熒光染料進(jìn)行RT-qPCR。

具體引物如下:hsa-miR-106b-3p:F:5’-CCGCACTGTGGGTACT-3’,R:5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’hsa-miR-130b-3p:F:5’-GGGCAGTGCAATGATGAAA-3’,R:5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’。

PCR在10L反應(yīng)體積中進(jìn)行,并由95℃3min的初始變性步驟組成,隨后在95℃5s和60℃30s的擴(kuò)增40個(gè)循環(huán),然后在65℃至95℃進(jìn)行熔解曲線步驟,并且在0.5℃下增量5s。

用比較閾值循環(huán)(2)方法計(jì)算基因表達(dá)。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染:將細(xì)胞在含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中增殖,在37℃和5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

按照說明書,用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

轉(zhuǎn)染后48h收獲細(xì)胞。

1.2.5雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn):將1.510個(gè)細(xì)胞/孔的HEK293T細(xì)胞種入96孔板。

根據(jù)說明書進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染。

使用雙熒光素酶報(bào)告測(cè)定系統(tǒng)測(cè)試熒光素酶活性。

1.2.6細(xì)胞增殖及凋亡實(shí)驗(yàn):細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):細(xì)胞接種在96孔板中。

通過CCK-8每24或12h測(cè)量細(xì)胞吸光度值。

將含有10LCCK-8的新鮮培養(yǎng)基加入板中,細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)2h。

在490nm處測(cè)吸光度,重復(fù)3次。

根據(jù)說明書,使用Cell-LightEduDNA試劑盒進(jìn)行Edu分析。

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn):細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后收集細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,n=3。

1.2.7劃痕和細(xì)胞侵襲:將210個(gè)細(xì)胞/孔接種到6孔板中至80%匯合。

傷口用200L槍頭操作,更換無血清的RPMI1640培養(yǎng)基。

在0和24h用倒置相差顯微鏡拍攝照片,n=5。

用BD基質(zhì)膠侵襲小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲。

根據(jù)說明書進(jìn)行操作,n=3。

1.2.8細(xì)胞骨架的檢測(cè):細(xì)胞接種在24孔板中的蓋玻片上48h,用4%多聚甲醛固定30min,用0.3%TritonX-100處理5min,37℃下用3%BSA封閉30min。

將細(xì)胞與抗樁蛋白(1∶200稀釋)的抗體在4℃溫育過夜。

然后用二抗孵育1h,用1%鬼筆環(huán)肽-FITC在37℃處理40min并使用PBS漂洗35min。

然后,細(xì)胞用DAPI孵育10min,封片。

將細(xì)胞共聚焦顯微鏡下拍照。

1.2.9Westernblot檢測(cè)蛋白:將總細(xì)胞蛋白裂解物與含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液處理。

通過10%SDS來分離30g蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。

封閉后,將膜在4℃下與一抗(1∶500稀釋)溫育過夜。

將膜與山羊抗兔二級(jí)IgG(1∶2000稀釋)在37℃下孵育2h,發(fā)光顯色。

使用單克隆GAPDH(1∶2000)抗體作為內(nèi)參。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析SPSS18.0和GraphPadPrism5.0統(tǒng)計(jì)軟件分析t檢驗(yàn)的結(jié)果。

結(jié)果以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差((s)表示。

2結(jié)果2.1異常表達(dá)的miRNA和mRNA異常表達(dá)的miRNA聚類圖(圖1A)。

mRNA芯片顯示了兩個(gè)最上調(diào)miRNA(hsa-miR-130b-3phsa-miR-106b-3p)的靶基因聚類圖(圖1B)。

2.2miR-130b-3p和miR-106b-3p表達(dá)上調(diào),PTEN和STC1表達(dá)下調(diào)miR-130b-3p和miR-106b-3p的表達(dá)上調(diào)(圖2A),其與芯片數(shù)據(jù)一致。

腫瘤抑制基因PTEN和STC1可能是miR-130b的潛在靶標(biāo)(圖2B)。

與鄰近的非腫瘤組織相比,2種靶mRNA(PTEN和STC1)的表達(dá)均一致地下調(diào)(圖2C)。

PTEN比STC1與膀胱癌的相關(guān)性更高(圖3)。

用miR-130b模擬物轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的熒光素酶活性與對(duì)照組相比降低約64%(圖4)。

2.3miR-130b-3p影響膀胱癌細(xì)胞的增殖和凋亡增殖曲線與對(duì)照組相比,miR-130b模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞活力增加(圖5A)。

通過Edu實(shí)驗(yàn)獲得相似的結(jié)果(圖5B,E)。

約12.02%和15.3%的細(xì)胞在miR-130b-3p抑制劑組中出現(xiàn)凋亡。

而在對(duì)照細(xì)胞中約只有4.44%和6.79%的細(xì)胞顯示凋亡(圖5C)。

miR-130b-3p抑制劑細(xì)胞組出現(xiàn)代表性的形態(tài)凋亡特征,如核片段,凋亡體和染色質(zhì)濃縮,而對(duì)照細(xì)胞不出現(xiàn)凋亡性狀(圖5D)。

圖1通過芯片顯示異常表達(dá)的miRNA和mRNAFig1DifferentiallyexpressedmiRNAandmRNAprofilesarescreenedbymicroarray下載原圖EachcolumnrepresentsasampleandeachrowrepresentsamiRNAsormRNA;redstriprepresentshighrelativeexpressionandgreenstriprepresentslowrelativeexpression;Trepresentsbladdercancergroup,andNrepresentsnormalcontrolgroup;eachgroupcontainsfourdifferentsamples;A.heatmapofdifferentiallyexpressedmiRNAs(foldchange1.5andPvalue0.05);B.heatmapofco-expressedtargetmRNAsfromtwothemostupregulatedmiRNAs圖2異常表達(dá)的miRNA及其靶基因Fig2DifferentlyexpressedmiRNAandtargetgenes(xs,n=30)下載原圖A:therelativeexpressionlevelsofthe2miRNAsareshowninthirtypairsoftumortissues(T)andnormaltissues(N),*P0.05comparedwithN,n=30;B:theputativebindingsitesbetweenmiR-130b-3pandPTEN3’UTRorSTC13’UTR;C:therelativeexpressionlevelsofPTENandSTC1inthirtypairsoftumortissues(T)andnormaltissues(N),*P0.05comparedwithnormaltissuesgroup圖3利用Starbase功能預(yù)測(cè)軟件分析miR-130b的靶基因PTEN及STC1與膀胱癌的相關(guān)性分析Fig3miR-130btargetPTEN/STC1-cancerspearsoncorrelationanalysisaccordingtoStarbasefunctionprediction下載原圖圖4通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-130b-3p的靶基因PTENFig4TargetgenePTENofmiR-130b-3pisverifiedbydual-luciferasereporterassay((s,n=3)下載原圖Luciferaseactivityin293Tcellsco-transfectedmiR-130b-3pwithluciferasereporterscontainingPTEN3’UTRormutant,dataarepresentedastherelativeratioofhRluctohlucactivity,*P0.05comparedwithNCgroup圖5miR-130b-3p影響膀胱癌細(xì)胞的增殖與凋亡Fig5ThemiR-130b-3paffectsproliferationandapoptosisofbladdercancercells((s,n=3)下載原圖A:CCK8analysisofEJcellstransfectedwithmiR-130b-3pmimicsorscramblecontrol;B:representativeimagesofEduassayofEJcellstransfectedwithmiR-130b-3pmimicsorscramblecontrol,hoechststainsthenucleus(200);C:flowcytometryanalysiswithannexinV-PIstaining,thepercentageofapoptoticcellsinEJgroupstransfectedwithanti-130boranticon,respectively;D:representativenucleiimagesofHoechststaining(400);E:quantitativeEduassaydatain5fields,*P0.01comparedwithNCgroup2.4miR-130b-3p促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的侵襲、遷移和重排細(xì)胞骨架上調(diào)miR-130b-3p顯著促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲(圖6A~D)。

miR-130抑制劑能抑制應(yīng)激纖維形成和細(xì)胞中樁蛋白的表達(dá)。

相反,miR-130b-3p導(dǎo)致更豐富的肌動(dòng)蛋白絲束和更亮的熒光信號(hào)(圖6E,F)。

2.5miR-130b-3p調(diào)節(jié)靶向PTEN的PI3K/AKT和整聯(lián)蛋白1/FAK信號(hào)通路上調(diào)miR-130b增加p-PI3K,p-Akt,p-FAK和整合素1的表達(dá)。

相反,當(dāng)細(xì)胞用miR-130b-3p抑制劑轉(zhuǎn)染時(shí),這些蛋白水平降低(圖7)。

3討論目前,尚無治療膀胱尿路上皮癌的分子靶標(biāo)[8]。

但miRNAs提供了一種新的可用于癌癥的方法。

miRNA通過降解或抑制其靶基因的翻譯以實(shí)現(xiàn)其調(diào)節(jié)功能。

確定miRNA靶基因?qū)τ诹私鈓iRNA的作用非常重要[9]。

目前,全基因組篩選的miRNA通過聯(lián)合miRNA和mRNA表達(dá)譜在膀胱癌中闡明特定miRNA的功能尚未見報(bào)道。

通過整合mRNA/miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的芯片來找到miRNA和mRNA之間的新的調(diào)節(jié)關(guān)系。

近來,多個(gè)報(bào)告已經(jīng)顯示miR-130家族在癌癥進(jìn)展中的影響,miR-130b在多種腫瘤中顯著失調(diào)[10-12]。

但miR-130b-3p分子對(duì)腫瘤進(jìn)展的綜合作用,包括膀胱癌尚未被揭示。

芯片數(shù)據(jù)和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)在膀胱癌組織中miR-130b-3p上調(diào)且PTEN下調(diào)。

Silico分析,PTEN被預(yù)測(cè)為miR-130b的重要靶標(biāo)。

通過一系列實(shí)驗(yàn)來證明miR-130b可以直接結(jié)合到PTEN的3’-UTR序列并抑制其表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示miR-130b-3p促進(jìn)了細(xì)胞增殖,遷移和侵襲以及骨架重排。

聯(lián)合mRNA和miRNA表達(dá)譜的研究為膀胱癌中miR-130b直接靶向PTEN而增加擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移提供了堅(jiān)實(shí)的證據(jù)。

圖6miR-130b-3p促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的侵襲、遷移及骨架重塑Fig6ThemiR-130b-3ppromotesinvasion,migrationandrearrangescytoskeletonofbladdercancercells((s,n=3)下載原圖圖7miR-130b-3p通過靶PTEN調(diào)節(jié)PI3K/AKT和整合素1/FAK信號(hào)途徑Fig7miR-130b-3pregulatesPI3K/AKTandintegrin1/FAKsignalingpathwaystargetingPTEN((s,n=3)下載原圖miR-130b-3p可能通過靶向PTEN激活PI3K/AKT和整合素1/FAK信號(hào)通路。

PTEN是PI3K/Akt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)劑,PI3K/Akt通路的調(diào)節(jié)元件已經(jīng)作為潛在的治療靶點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[13]。

miRNA和靶向mRNA的全基因組篩選揭示了miR-130b-3p在膀胱癌中對(duì)PTEN的負(fù)調(diào)節(jié)作用及對(duì)PI3K/AKT和整合素1/FAK信號(hào)通路。

本結(jié)果提示miR-130b有望作為膀胱癌診斷和治療的新型臨床標(biāo)志物。

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