動物和動物產品沙門氏菌檢測方法PAGEPAGE10動物和動物產品沙門氏菌檢測方法范圍本文件規(guī)定了動物和動物產品中沙門氏菌（Salmonella）的檢驗程序、樣品采集、樣品處理、細菌分離、細菌PCR檢測以及實時熒光定量PCR檢測方法。本文件適用于動物和動物產品中沙門氏菌的檢測。（GB4789.4NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范NY/T1948本文件沒有需要界定的術語和定義?？s略語下列縮略語適用于本文件。BPW（BufferedPeptoneWater）CFU（Colony-FormingUnit）DNA（DeoxyribonucleicAcid）EDTA（EthyleneDiamineTetraaceticAci）MSRVRV（ModifiedSemi-SolidRappaport-VassiliadisMediumBase）PCR（PolymeraseChainReaction）RT-qPCRPCR（realtimequantitativePCR）r/min：轉/（RevolutionsPerMinute）RVR10（Rappaport-VassiliadisR10Broth）TAE乙酸（Tris-AceticAcid-EthylenediaminetetraaceticAcid）XLT4：賴氨酸（XyloseLysineTergitol4AgarBase）除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級水。BPWA.1。RVR10A.2。MSRVA.3。XLT4A.4。5.51.2%瓊脂糖凝膠：見附錄A.5。PCRMasterMix。PCRMasterMix(PremixExTaqTM)。2℃～8℃）。6.2（37℃±1℃、42℃±1℃）。6.3（121℃103kPa）。6.4（180r/min、37℃±1℃）。6.5（120mm×180mm、450mm×550mm）。（90mm）。（1μL）。（10cm）。（0.1g）。（0.22μm）。（200、1000μL）。12000r/min）。（1.5mL，10mL）。普通PCRPCRPCR（100μL）。細菌DNA采樣、樣品處理及檢測過程所涉及的實驗操作，應遵守NY/T1948-2010的有關規(guī)定。沙門氏菌檢測程序見圖1。圖1沙門氏菌檢測程序用一次性無菌取樣勺子采集新鮮糞便約25g，置于無菌采樣袋內密封保存并做好標記。每采集1份樣品需更換手套。對各種類別的飼料分別進行采集。使用一次性無菌取樣勺子隨機分散采集飼料，每份約25g，置于無菌采樣袋內密封保存并做好標記。分別采集不同欄、圈中的墊料。使用一次性無菌取樣勺子隨機分散采集墊料，每份約25g，置于無菌采樣袋內密封并做好標記。佩戴一次性手套，將每份墊紙折疊好后分別置于無菌采樣袋內密封保存并做好標記。每采集1份樣品需更換手套。分別使用3～4個無菌BPW浸泡過的棉球擦拭圍欄、水槽、料槽等舍內器具，其中圍欄反復擦拭不少于4次，水槽和料槽等根據現場實際擦拭槽體外立面和槽內四周等。將不同養(yǎng)殖器具的擦拭樣分類置于無菌采樣袋內密封保存并做好標記。依照屠宰環(huán)節(jié)/生產流程，用無菌BPW浸潤的棉球在動物體表盡可能多的不同部位擦拭50cm2～100cm2（視動物體型而定），然后將棉球置于無菌采樣袋內密封保存并做好標記。用無菌棉簽收集約5g小腸內容物，折斷手柄后將棉簽頭部置于無菌采樣袋內密封保存并做好標記。3cm～5cm33～450cm2～100cm2（用無菌BPM浸泡過的棉簽小心擦拭整個禽蛋表面，折斷手柄后將棉簽頭部置于無菌采樣袋內密封保存并做好標記。將禽蛋置于75%酒精浸泡1min對蛋殼外表面進行消毒，靜置待干后使用無菌鑷子等敲破蛋殼，將蛋清和蛋黃內容物轉移至無菌采樣袋中，反復拍打均勻，加入約200mLBPW后密封保存并做好標記。隨機采集生肉塊樣品，每份約100g，放入無菌采樣袋密封并做好標記。用無菌棉簽轉動擦拭生肉樣品的表面（面積不少于100cm2），折斷手柄后將棉簽頭部置于無菌采樣袋內密封保存并做好標記。水樣使用500250mL～500mL使用50mL無菌離心管接取牛奶樣品，一般每個樣品采集50mL，密封保存并做好標記。3～4BPW13～4使用3～4個無菌BPW浸泡過的棉球分別反復擦拭工作人員雙手的手心和指縫以及鞋靴底部等部位3～4次，置于無菌采樣袋內密封保存并做好標記。使用3～4個無菌BPW浸泡過的棉球分別反復擦拭動物/動物產品運輸車輛車廂內側和底部3～4次，擦拭面積約1m2，置于無菌采樣袋內密封保存并做好標記。4℃h24h4℃2℃24h（48h）向無菌采樣袋中加入無菌BPW40mL371℃，180r/min18h～24。3～4BPW9.1.440mL無菌BPWr/min18h～24h。25g（加入無菌8000r/min～10000r/min5mm1：9BPW1minr/min18h～24h。0.22μm0mL無菌P3℃±℃80n18h～24h。1：9質量體積比的量加入無菌BPW，BPW37℃±1℃，18018h～24h。BPW300μLMSRV含10mg/L），42℃±1℃24hXLT437℃±1℃24h。吸取1mL增菌液，加入9mLRVR10肉湯中，42℃±1℃條件下培養(yǎng)24h。培養(yǎng)后用接種環(huán)蘸取培養(yǎng)液，分區(qū)劃線接種至XLT4瓊脂培養(yǎng)基，37℃±1℃培養(yǎng)24h。在XLT4平板上，雞白痢沙門氏菌/雞傷寒沙門氏菌形成針尖般細小透明、光滑濕潤、邊緣整齊的菌落，其他沙門氏菌多呈黑色透明暈環(huán)的細小菌落，如圖A.1所示。沙門氏菌的生化鑒定按GB4789.4-2024中5.4項的實驗方法進行操作。PCR鑒定PCRBPWr/min5盡1mL1200XLT43）200μL（10r/min5提取其基因組DNAPCRDNAPCRPCRstn，按照B.2PCRPCR5111個循環(huán)；72℃10min4℃DNADNAPCR按照附錄A.5和A.61.2%10μLPCR45min左右，在凝膠成像儀中觀察結果并拍照。PCR在陽性對照、陰性對照和空白對照結果正確的情況下，如樣品出現260bp擴增產物條帶，則判定樣品為陽性；如樣品未出現相應大小的擴增條帶，則樣品判定為陰性，如圖B.1所示。沙門氏菌血清學鑒定和血清型分型分別按GB4789.4-2024中5.5和5.6項的實驗方法進行操作。PCRRT-qPCR本方法為基于TaqMan探針的熒光PCR方法，可使用未增菌處理的樣品模板結合標準曲線進行定量C.4），用DNAPCRRT-qPCR以stn基因作為目的基因片段，引物和探針序列見附錄表C.1，按照C.5按附錄C配制RT-qPCR反應體系，然后在熒光定量PCR儀中按設置的反應程序進行擴增：95℃預變性10s；95℃10s，60℃34s，40個循環(huán)。反應結束后，對獲得的信號數據進行處理。（）A1ACqRC以沙門氏菌的基因組DNA作為陽性對照樣品的模板，以其他細菌（建議使用大腸桿菌）的基因組DNA作為陰性對照樣品的模板，以滅菌去離子水作為空白對照樣品的模板。以下條件有一條不滿足時，實驗視為無效，需重新進行實驗：值＞40.0Ct值＞40.0CtCt30.0；定性檢測：在陽性對照、陰性對照和空白對照結果正確的情況下，如樣品Ct≤36判定為陽性，36＜Ct≤40判定為可疑，需重復檢測或結合其他檢測方法判定結果。定量檢測：通過標準品的擴增獲得標準曲線（具體見附錄C.6），將待測樣品的Ct值代入該標準曲線即可獲得樣品中細菌的數量。綜合以上血清學和分子生物學等鑒定結果，報告樣品中檢出或未檢出沙門氏菌，或沙門菌的含量。附錄A（）（BPW）成分蛋白胨 10.0g氯化鈉 5.0g磷酸二鈉 9.0g磷酸氫鉀 1.5g硫酸鐵 0.25g制法將A.1.1成分溶于1000mL蒸餾水中，調節(jié)pH為7.2±0.2，121℃高壓滅菌15min，備用。A.2RVR10肉湯A.2.1成分胰酪蛋白胨氯化鈉4.54g7.3g1.45g13.4g0.036gA.2.2制法A.2.11000mL蒸餾水中，調節(jié)pH5.1±0.2115高壓15minMSRV成分胰蛋白胨酸水解酪蛋白4.6g4.6g氯化鈉瓊脂7.3g1.5g10.9g0.04g2.7gA.3.2制法A.3.11000mLpH5.2±50℃10mgA.4XLT4瓊脂培養(yǎng)基A.4.1成分木糖蛋白胨L-賴氨酸乳糖蔗糖氯化鈉酚紅瓊脂3.75g1.6g5.0g7.5g7.5g5.0g3.0g0.08g6.8g0.8g18.0gA.4.2制法A.4.11000mLpH7.4±0.245℃4.61LT4（7乙基2甲基4A.50.5×TAE電泳緩沖液50TAE242.0g18.612g冰乙酸 57.1mL將A.5.1.1成分中的Tris和EDTA溶于800mL的去離子水中，充分攪拌均勻，加入冰乙酸，充分溶解，用5mol/L的NaOH將pH調節(jié)至8.3，加去離子水定容至1000mL后，室溫保存。0.5TAE50

10mL將A.5.2.1成分溶于990mL去離子水中，混勻備用。A.61.2%瓊脂糖凝膠成分瓊脂糖 1.2g100mL0.5×TAE電泳緩沖液制法1.2g100mL0.5×A.7沙門氏菌在XLT4平板的可疑菌落圖A.1沙門氏菌PCR擴增結果左圖為雞白痢沙門氏菌/雞傷寒沙門氏菌的可疑菌落；右圖為其他血清型沙門菌的可疑菌落附錄B（規(guī)范性）沙門氏菌的PCR鑒定B.1PCR引物序列及擴增片段長度沙門氏菌PCR反應體系的引物序列及擴增片段長度見表B.1。表B.1鑒定沙門氏菌的PCR引物序列及擴增片段長度基因 引物 引物序列 擴增片段長度stn stn1 5′-CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3′ 260bpstn2 5′-TGCCCAAAGCAGAGAGATTC-3′PCR平板疑似沙門氏菌菌落的基因組DNAPCRDNAPCR（25μL）stnPCR2×PCRMasterMix

12.5μL上游物stn1（2.5μmol/L） 1.0μL下游物stn2（2.5μmol/L） 1.0μL模板DNA 2.0μL去離水 8.5μLPCRR圖B1。圖B.1沙門氏菌PCR擴增結果M：DNA分子量標準DL1000；1：陽性對照；2～4：不同陽性樣品；5：陰性對照；6：空白對照附錄C（規(guī)范性）沙門氏菌實時熒光定量PCR檢測stn長度見表C.1stnPCR表C.1沙門氏菌RT-qPCR反應體系的引物序列、探針序列及擴增片段長度基因引物名稱引物序列擴增片段長度熒光探針5′-FAM-CCTTTCCCGCTATCGGTAAC-BHQ1-3′stnstn1stn25′-CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3′5′-TGCCCAAAGCAGAGAGATTC-3′260bp取培養(yǎng)過夜的沙門氏菌菌液用無菌PBS稀釋后CFU1×1061×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL1mL1.5mL離心管中，12000r/min5min，用1mL10min12000r/minDNA模板。1mL1.5mLC.2DNA模板。（1L11000rin離心5i（200；10r/min5，取上清即為待測樣品DNA劑盒提取其基因組DNAC.5RT-qPCR擴增體系DNA（25μL）stn2×PCRMasterMix(