聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳法分離牛血清蛋白一、原理聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳是根據(jù)被分離物質(zhì)所帶的電荷多少及其分子的大小，形狀的不同，在電場的作用下，產(chǎn)生不同的速度而分離的方法。它具有分子篩效應(yīng)、電荷效應(yīng)、濃縮效應(yīng)三重作用。在這三重效應(yīng)的共同作用下使血清蛋白中不同的蛋白質(zhì)分離開來。二、實(shí)驗(yàn)儀器電泳儀電泳槽注射器長針頭吸管培養(yǎng)皿三、實(shí)驗(yàn)試劑三羥甲基氨基甲烷（簡稱Tris）貯備液的配制：按下表配制A、B、C、D、E、F各貯備液，然后冷藏于4℃條件下，以防變質(zhì)。染色液：0.05%氨基黑10B溶于7%醋酸溶液，或者用靈敏度高5倍考馬斯亮藍(lán)R250溶液染色。脫色液：7%醋酸溶液。電極緩沖液（pH8.3甘氨酸-Tris緩沖液）：甘氨酸28.8g，Tris0.6g加水定容至1000ml.示蹤劑：0.01%溴酚藍(lán)溶液。序號ABCDEF1mol/L鹽酸TrisTEMEDACrBis(NH4)2S2O3蔗糖加水并稀釋至PH48ml36.6g0.23ml100ml8.948ml5.98g0.46ml100ml6.728g0.735g100ml10g2.5g100ml40g100ml0.14g100ml四、實(shí)驗(yàn)步驟1.制膠：取一支長10cm左右的玻璃管，在一端套上乳膠帽。1）7%聚丙烯酰胺凝膠（PH8.9，分離膠）：將試劑按A:C:H2O:F=5ml：10ml：5ml：15ml比例混合于一燒杯中.用滴管將分離膠加入玻璃管至3/4高度，表面再加少量水覆蓋，在烘箱中25~35℃下聚合，當(dāng)有界面出現(xiàn)時(shí)，表明已經(jīng)聚合，吸取分離膠表面的水分。2）2.5%聚丙烯酰胺凝膠（pH6.7，濃縮膠）：將試劑按B:D:E:F=2ml：4ml：2ml：8ml比例混合于燒杯中，迅速將其用滴管加到分離膠上面。加入1厘米高左右，在小心地加入一層薄水。然后膠管于烘箱中25℃~35℃下放置，待第二次出現(xiàn)界面，表示聚合完成，除去表面水分。2.安裝膠管把玻璃管下端得橡皮冒除去（拔時(shí)用力不要過猛，以防使膠條受損），將膠管安裝在電泳儀上。注意垂直，并要緊密，防止緩沖液從上槽漏下。先向各膠管中加滿電極緩沖液，不要有氣泡留存，在向下槽注入緩沖液，然后將膠管下降至下槽緩沖液內(nèi)。3.加樣0.5ml新鮮血清，用5ml20%蔗糖溴酚藍(lán)溶液稀釋（有老師配制）。用微量注射器或移液槍向膠管內(nèi)加20ul樣品液，注意微量注射器或移液槍頭要插入膠管內(nèi)加液。4.電泳上槽連接負(fù)極，下槽連接正極，然后通電，先每管電流3mA電泳，當(dāng)示蹤劑進(jìn)入分離膠時(shí)，電流增至每管5mA。當(dāng)示蹤劑移至膠管下端1cm處時(shí)，關(guān)閉電源，取出膠管。電泳大約2-3小時(shí)。5.剝膠取一只帶長針頭的注射器，灌滿水，將針頭從濃縮膠的一端小心的管壁與凝膠之間，轉(zhuǎn)動(dòng)膠管，并同時(shí)推動(dòng)注射器，在針頭向前推動(dòng)時(shí)，注入蒸餾水，使膠條隨水的壓力及潤滑作用從玻璃管中脫離。6.染色及洗脫A.將取下的膠條放入12.5%三氯醋酸中固定10min，用1%考馬斯亮藍(lán)水溶液染色15min，7%醋酸過夜保存。B.將取下的膠條放入7%三氯醋酸中固定10min，用氨基黑10B染色15min，7%醋酸浸泡過夜。注:染液回收7.觀察繪圖將脫色膠條取出放于濾紙上，觀察分離色帶，將結(jié)果繪于實(shí)驗(yàn)報(bào)告紙上。注意事項(xiàng)所有玻璃管和綠套頭，在剝膠完畢后回收回講臺盒子中。所有乳膠帽，在膠凝固后都回收回講臺的盒子中所有針管和針頭剝膠完成后回收回講臺五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果這是我們組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，失敗了六