文獻(xiàn)題目：IdentificationofNUB1asasuppressorofmutantHuntingtintoxicityviaenhancedproteinclearanceNUB1是加強(qiáng)蛋白降解的變異亨廷頓蛋白毒性抑制劑的確認(rèn)BoxunLu1,2,IsmaelAl-Ramahi3,4,AntonioValencia5,6,QiongWang2,FradaBerenshteyn2,HaidiYang2,TatianaGallego-Flores3,4,SalahIchcho2,ArnaudLacoste2,MarcHild2,MarianDiFiglia5,6,JuanBotas3,4&JamesPalacino2亨廷頓舞蹈癥是由HTT基因中的CAG重復(fù)序列異常延長引起的，導(dǎo)致變異HTT蛋白（mHTT）功能增強(qiáng)，產(chǎn)生毒性。減少mHTT蛋白的量被認(rèn)為是介入治療的一種策略。我們進(jìn)行了全基因組RNA干擾篩選以尋找調(diào)控mHTT數(shù)量的基因，并識別出13個基因。我們在一個亨廷頓舞蹈癥果蠅模型中對其中10個進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，其中6個顯示出與體外篩選結(jié)果一致的活性。在這6個基因中，泛素樣蛋白1陰性調(diào)節(jié)酶（NUB1）過表達(dá)降低了神經(jīng)元模型中的mHTT含量，挽救了mHTT導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。NUB1減少mHTT含量是通過加強(qiáng)多泛素化，以及蛋白酶體對mHTT蛋白的降解完成的。這一過程需要CUL3和泛素樣蛋白NEDD8（該蛋白為激活CUL3所必須）的參與。作為一種調(diào)節(jié)NUB1用于治療的可能的途徑，β-干擾素通過誘導(dǎo)NUB1降低了mHTT含量并挽救了神經(jīng)元毒性。因此，通過高通量篩選我們已經(jīng)識別出調(diào)節(jié)內(nèi)源性mHTT的基因，并證明了NUB1是干預(yù)性治療亨廷頓舞蹈癥的示范性切入點(diǎn)。亨廷頓舞蹈癥是一種常染色體顯性遺傳的不可治愈疾病，是一種神經(jīng)退行性疾病。該疾病病因是HTT基因外顯子1的CAG重復(fù)序列異常擴(kuò)增，導(dǎo)致表達(dá)出含有超過最多36個谷氨酰胺多肽鏈的變異HTT蛋白（mHTT）。盡管野生型HTT蛋白具有神經(jīng)保護(hù)作用，毒性mHTT功能的增加，而不是野生型HTT蛋白活性的喪失，才是該疾病的主要病因。mHTT蛋白的表達(dá)導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，機(jī)理是破壞諸如轉(zhuǎn)錄、軸突運(yùn)輸、胞吞胞吐和鈣平衡等細(xì)胞活動。盡管這些活動的平衡對于細(xì)胞存活極為重要，病因背后的真相依然不甚明朗。HTT會發(fā)生翻譯后修飾，包括一些酶促反應(yīng)，例如蛋白酶解、磷酸化或有泛素或泛素樣蛋白參與的修飾。盡管這些翻譯后修飾可能調(diào)控HTT的正常和病理性功能，究竟什么反應(yīng)對涉及神經(jīng)毒性的通路有影響依然不得而知。考慮到HTT蛋白生物學(xué)性質(zhì)的復(fù)雜性，根據(jù)已報(bào)道的證據(jù)我們猜測在諸多病理表型的上游某一點(diǎn)靶向定位HTT蛋白能夠減少下游環(huán)節(jié)的任何毒性。在一只可誘導(dǎo)mHTT老鼠中，關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)扭轉(zhuǎn)了神經(jīng)毒性和運(yùn)動缺陷，而在哺乳動物模型中針對mHTT導(dǎo)入小發(fā)卡RNA（shRNA）或小干擾RNA（siRNA）緩解了神經(jīng)毒性和疾病相關(guān)的表型。因此，降低mHTT量來緩解任何下游毒性，從而可能提供一種有效的治療亨廷頓舞蹈癥的途徑，并且識別調(diào)控mHTT的通路是研究非常感興趣的。之前的篩選已經(jīng)研究了mHTT生物活性的不同方面，例如與之相互作用的蛋白、蛋白聚合調(diào)節(jié)物和負(fù)責(zé)降解蛋白的各種蛋白酶。雖然這些研究展現(xiàn)了mHTT生物活性的重要方面，但據(jù)我們所知尚沒有無偏篩選mHTT蛋白水平本身的基因調(diào)控物的報(bào)道。HTT復(fù)雜的生物活性對這樣的努力是一種阻礙。首先，因?yàn)榇嬖诘鞍捉到夂途酆纤詫HTT進(jìn)行定量很復(fù)雜。其次，HTT的清除受到多種通路的調(diào)控，例如自吞噬和蛋白酶體。這樣的復(fù)雜因素使得在多種模型中確定HTT含量的變化成為必須要做的事。此外，RNAi篩選存在脫靶活性的風(fēng)險。為了說明以上這些，我們設(shè)計(jì)了流程圖以最小化假陽性結(jié)果。我們首先使用了能檢測所有含有多聚谷氨酰胺重復(fù)序列的mHTTN-端片段的抗體，運(yùn)用均相時間分辨熒光（HTRF）技術(shù)確認(rèn)了靶點(diǎn)（補(bǔ)充圖1a）。我們確認(rèn)了在不同物種模型體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以識別進(jìn)化上保守的位點(diǎn)。對于那些我們感興趣的特殊位點(diǎn)，我們在多種模型中用多種抗體進(jìn)一步研究了不同種類的mHTT，確保mHTT含量的減少是顯著的。我們的篩選研究識別出13種mHTT含量的調(diào)控物，其中大多數(shù)顯示出與一個果蠅模型種的表型反應(yīng)一致的結(jié)果。其中，我們的數(shù)據(jù)顯示NUB1（一種與HTT相互作用的蛋白）調(diào)控著mHTT的水平和毒性。并且我們進(jìn)一步找到了一種由NUB1調(diào)控的mHTT含量的變化機(jī)制，這也證明了定位NUB1治療亨廷頓舞蹈癥的方法。據(jù)我們所知，本研究首次報(bào)道了尋找mHTT含量調(diào)控基因的全基因組篩選。NUB1和其他調(diào)控HTT含量的位點(diǎn)得到證實(shí)，為治療亨廷頓俄舞蹈癥提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和入手點(diǎn)。結(jié)果全基因組篩選可溶性mHTT清除我們使用果蠅S2R細(xì)胞系進(jìn)行全基因組篩選。該實(shí)驗(yàn)體系成熟，可用于各種RNAi篩選，包括一種尋找mHTT聚合物的篩選。我們建立了一條S2R細(xì)胞系，該細(xì)胞系表達(dá)了metallothioneinpromoter-driven含573個氨基酸殘基（其中谷氨酰胺重復(fù)序列數(shù)達(dá)到73，并帶有C端β1表位）的HTT蛋白片段。我們選擇這一片段是因?yàn)楦痰钠蝺A向于形成聚合物，而更長的片段會發(fā)生多重蛋白酶解反應(yīng)。這兩種情況都會大幅增加檢測可溶性HTT的復(fù)雜性。表達(dá)的mHTT片段由westernblot和HTRF檢測（配合胞外銅離子誘導(dǎo)）（補(bǔ)充圖1b、c）。為了盡可能減小來自可誘導(dǎo)promoter的定位于轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)數(shù)，我們在一個蛋白降解模型中進(jìn)行篩選（其中誘導(dǎo)與應(yīng)用于RNA干擾的dsRNA同時結(jié)束）。mHTT的含量在沒有從頭測序的情況下進(jìn)行，使我們能同時檢測mHTT降解的促進(jìn)物和抑制物（圖1a）。初步的篩選使用了兩個全基因組dsRNA庫（AmbionandBKNHeidelberg2，覆蓋了超過97%的果蠅基因組）。我們通過Z分（見實(shí)驗(yàn)方法）（圖1b、c）和復(fù)篩選擇初步篩選的位點(diǎn)（圖1b）。如此，我們得到了554個基因作為mHTT降解的調(diào)控基因。在患者成纖維細(xì)胞中第二次確認(rèn)基于序列對比算法可知，在這554個基因中，363個基因有人類同源基因。這363個基因匯編成總共352個候選人類基因（補(bǔ)充表1）。我們在第二次篩選中評估了兩種表達(dá)內(nèi)源性全長mHTT蛋白的細(xì)胞作為模型的合適程度，分別為敲入基因STHdh的老鼠細(xì)胞和人類細(xì)胞（經(jīng)永生化處理的亨廷頓舞蹈癥患者成纖維細(xì)胞）。兩者轉(zhuǎn)染siRNA的情況均為良好，并在westernblot中顯示出高效的HTT蛋白敲除結(jié)果（補(bǔ)充圖2a、c）。然而對于HTRF檢測結(jié)果，老鼠細(xì)胞顯示與westernblot結(jié)果不一致（補(bǔ)充圖2a、b），這使得該模型不適合高通量確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。同樣的不一致也出現(xiàn)在我們檢測老鼠HTT蛋白或其他老鼠細(xì)胞模型（例如老鼠胚胎干細(xì)胞發(fā)育出的細(xì)胞或來自基因敲入老鼠的初級神經(jīng)元）的敲入雜合等位基因的時候（數(shù)據(jù)未提供）。相反，患者的成纖維細(xì)胞在測試HTT敲除時westernblot與HTRF結(jié)果顯示出關(guān)聯(lián)性。多聚谷氨酰胺選擇性抗體（MW1，在線實(shí)驗(yàn)方法）讓我們能在一高通量模式中有傾向地檢測mHTT（補(bǔ)充圖2c）。因此，我們使用來自兩位患者的永生化處理過的成纖維細(xì)胞用于確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。兩種細(xì)胞分別帶有編碼含45和68個谷氨酰胺重復(fù)序列蛋白的mHTT等位基因（圖2a、b）。我們測試了之前第一輪篩選得到的352個位點(diǎn)，兩個患者成纖維細(xì)胞系中的mHTT信號是相互關(guān)聯(lián)的（R2=0.68，圖2b），表明大多數(shù)基因?qū)HTT的影響并非由于遺傳背景的緣故。我們之后對那些在兩種細(xì)胞系中重復(fù)地、持續(xù)地改變mHTT含量地位點(diǎn)進(jìn)行了幾次反篩選（例如細(xì)胞通透性和對照蛋白（中心粒運(yùn)動神經(jīng)元－2存活，SMN2）含量）（圖2a、c、d）。在這之中，14個位點(diǎn)顯示出對mHTT含量持續(xù)性、選擇性和定位靶向的影響（補(bǔ)充圖3a）。我們還在永生化處理的野生型成纖維細(xì)胞中用HTRF技術(shù)及2B7-Tb/2166-D2抗體對（在線實(shí)驗(yàn)方法）檢測了野生型HTT含量。只有一個位點(diǎn)（KLHL22）顯著調(diào)控了野生型HTT含量（補(bǔ)充圖3a）。在果蠅亨廷頓舞蹈癥模型中進(jìn)行體內(nèi)確認(rèn)為了在體內(nèi)評估這13個位點(diǎn)的病理生理聯(lián)系，我們使用了一個設(shè)計(jì)良好的果蠅模型。這些果蠅攜帶一個可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因，編碼N端的由1～336個氨基酸殘基組成的一段mHTT序列，包含128個谷氨酰胺重復(fù)序列（代號為NT-HTT128Q），用GAL4-UAS系統(tǒng)表達(dá)。NT-HTT128Q在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)（使用elav-GAL4）會誘導(dǎo)一種可重復(fù)的、可定量的啟動子表現(xiàn)損傷，該損傷可由能沿玻璃圓柱壁向上爬的NT-HTT128Q型果蠅百分比定量測量，對照組為無NT-HTT128Q的elav-GAL4果蠅（圖3a-f）。我們獲取了所有公開方式可得到的攜帶與我們篩選所得的基因相對應(yīng)的過表達(dá)或失能等位基因的果蠅株型（補(bǔ)充圖3a）。3個位點(diǎn)的同源基因（SSRP、KLK14、NPR1）沒有經(jīng)過測試，因?yàn)槲覀冞M(jìn)行篩選時沒有獲得相關(guān)的株型。經(jīng)過測試的10個同源位點(diǎn)中，六個（NUB1,VEGFC,SEC61B,SEC61G,LAP3和KLHL22）調(diào)控了NT-HTT128Q誘導(dǎo)的爬行障礙，與在細(xì)胞中觀察到的蛋白改變所預(yù)測的一致（圖3a-f；KLHL22未顯示，因?yàn)閷⑵潆s交入果蠅時引起了毒性和果蠅過早死亡，影響了精確測量爬行障礙）。一個位點(diǎn)未顯示調(diào)控作用（RAE1），三個位點(diǎn)（PICALM,CDA,TRAPPC9）顯示與細(xì)胞篩選結(jié)果不符的改變（結(jié)果未顯示）。我們之后利用HTRF技術(shù)監(jiān)測了這些果蠅體內(nèi)的NT-HTT128Q蛋白水平。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致的是，我們發(fā)現(xiàn)CG15445或CG7103（分別為NUB1和VEGFC的果蠅同源基因）缺乏會導(dǎo)致NT-HTT128Q蛋白水平上升（圖3g、h）。這表明這兩個基因影響mHTT的機(jī)制在動物體內(nèi)也是活躍的。NUB1抑制果蠅體內(nèi)mHTT毒性兩個基因中的一個，即NUB1，在行為學(xué)和HTRF實(shí)驗(yàn)中顯示出一致的結(jié)果，并且生理上與mHTT存在相互作用。NUB1主要在大腦中表達(dá)，通過胞外干擾素-β（IFNβ）處理可以被誘導(dǎo)。CG15445（NUB1的同源基因）shRNA似乎能加劇NT-HTT128Q誘導(dǎo)的啟動子損傷，但本身表型并不強(qiáng)。為了弄清NUB1和HTT之間的相互作用是否具有特異性，我們對表達(dá)了人類NUB1基因的轉(zhuǎn)基因果蠅（控制為GAL4-UAS）進(jìn)行了運(yùn)動行為測試，以探究NUB1過表達(dá)能否抑制NT-HTT128Q誘發(fā)的神經(jīng)退化。受測試的果蠅中五個轉(zhuǎn)入了人類NUB1基因的不同株型顯示了對NT-HTT128Q誘發(fā)的運(yùn)動行為損傷的抑制（圖4a，部分?jǐn)?shù)據(jù)未顯示），并且果蠅頭部的NT-HTT128Q量顯著減少（圖4b）。為了在一個獨(dú)立試驗(yàn)中確認(rèn)我們的實(shí)驗(yàn)觀察，我們評估了視網(wǎng)膜退化。結(jié)果顯示人類NUB1在果蠅視網(wǎng)膜中的表達(dá)也抑制了NT-HTT128Q引起的細(xì)胞損失和視網(wǎng)膜萎縮，而CG15445對應(yīng)shRNA的表達(dá)則加劇了視網(wǎng)膜疾病表型（圖4c-f）。在哺乳動物模型中NUB1防止mHTT毒性的產(chǎn)生Westernblost結(jié)果確認(rèn)，NUB1的siRNA減少了NUB1蛋白量，使Q68患者的成纖維細(xì)胞和STHdhQ7/Q111細(xì)胞的內(nèi)源性HTT蛋白含量增加(Coriellch00096)。此外，在mHTT存在的情況下我們發(fā)現(xiàn)在上述細(xì)胞中NUB1對野生型HTT蛋白含量有著與mHTT相同的方向（補(bǔ)充圖4a、b），盡管我們并沒有在一株來自非患者的成纖維細(xì)胞對照系中觀察到類似變化（補(bǔ)充圖3a）。這一差異可能是由mHTT等位基因的存在或缺失導(dǎo)致。為了研究NUB1含量增加能否減少內(nèi)源性HTT蛋白含量，我們將人類NUB1的cDNA轉(zhuǎn)入STHdhQ7/Q111細(xì)胞。mHTT和野生型HTT含量均顯著降低（47±_11%formHTTbyMW1westernblot,P=0.0011,n=7;49±_19%formHTTpluswtHTTby2B7westernblot,P=0.033,n=5;圖5a）。HTT蛋白含量變化并非源自針對HTTmRNA的效應(yīng)，因?yàn)椴还苁荖UB1siRNA還是cDNA均沒有改變HTT的mRNA量（圖5a及補(bǔ)充圖5a）。HTT蛋白含量變化也不是來自完全長度的HTT蛋白的降解或聚合，因?yàn)殡娪緱l帶中低分子量區(qū)域或不溶性區(qū)域都沒有增加（補(bǔ)充圖5a）。為了證實(shí)HTT含量減少是通過蛋白降解完成的，我們進(jìn)行了非放射性脈沖－示蹤實(shí)驗(yàn)來追蹤HTT降解。NUB1過表達(dá)顯著（P≤0.01）增加了HTT降解率，但沒有對GAPDH產(chǎn)生影響（補(bǔ)充圖5b）。用蛋白酶體抑制劑（MG132，補(bǔ)充圖5b）阻礙了NUB1對HTT蛋白降解的增強(qiáng)作用，而細(xì)胞自噬抑制劑（巴弗洛霉素補(bǔ)充圖5b）并沒有這樣的作用。這些結(jié)果表面，NUB1過表達(dá)增強(qiáng)了HTT蛋白的蛋白酶體降解。為了確定NUB1介導(dǎo)的mHTT含量變化是否影響了細(xì)胞毒性標(biāo)記，我們使用了兩種mHTT敲入模型。表達(dá)mHTT的STHdh增加了半胱氨基天冬氨酸水解酶3和／或7（caspase3and/or7）在應(yīng)激條件下的活性，例如血清移除。NUB1過表達(dá)顯著降低了血清移除－饑餓誘導(dǎo)的STHdhQ111/Q111細(xì)胞中的caspase3和／或7的活性（to63.7+1.5%，圖5b），表明mHTT誘導(dǎo)的caspase活性受到抑制。我們也研究了來自HTT140Q/140Q敲入老鼠的初級皮層神經(jīng)元細(xì)胞。在慢病毒感染5天后NUB1過表達(dá)顯著降低了該細(xì)胞中的內(nèi)源性mHTT水平（33.2±6.4%lower，圖5c），而內(nèi)源性野生型HTT蛋白在野生型神經(jīng)元細(xì)胞中沒有顯著改變（9.4±5.8%lower，圖5c）。與野生型神經(jīng)元細(xì)胞相比，HTT140Q/140Q神經(jīng)元細(xì)胞的內(nèi)源性NUB1蛋白含量和NUB1過表達(dá)程度都升高了（圖5c）。這可能表明存在一種mHTT的毒性誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)，這種反應(yīng)或者增加了NUB1的表達(dá)或者穩(wěn)定了NUB1蛋白，最終增強(qiáng)了mHTT的降解。之前的工作已經(jīng)證明，經(jīng)MTT檢測，在培養(yǎng)10天后HTT140Q/140Q初級神經(jīng)元的細(xì)胞通透性低于野生型神經(jīng)元（MTT即3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽），見在線實(shí)驗(yàn)方法）。為了了解增加NUB1是否能保護(hù)HTT140Q/140Q神經(jīng)元免于細(xì)胞死亡，我們用NUB1或?qū)φ眨↙acZ）的慢病毒感染了培養(yǎng)5天的野生型和HTT140Q/140Q神經(jīng)元，并用MTT測試細(xì)胞通透性。培養(yǎng)10天后，未經(jīng)處理的HTT140Q/140Q神經(jīng)元細(xì)胞通透性低于野生型（圖5c、d）。就生存情況而言，相比于未感染慢病毒（61.14±0.01%，指存活細(xì)胞數(shù)量占野生型神經(jīng)元的比例，下同）和對照組（57.36±0.02%）的HTT140Q/140Q神經(jīng)元細(xì)胞，感染了NUB1對應(yīng)病毒的HTT140Q/140Q神經(jīng)元顯示出更高的存活率（81.82±0.01%）（圖5d）。這些發(fā)現(xiàn)顯示，哺乳動物神經(jīng)元中的mHTT毒性可以通過NUB1含量增加來緩解，作用機(jī)制是降低mHTT含量。在人類胚胎干細(xì)胞（hESC）／誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化神經(jīng)元中NUB1降低mHTT含量為了在人類神經(jīng)元范疇中研究NUB1，我們使用了hESC分化神經(jīng)元細(xì)胞（補(bǔ)充圖6）。hESC分化神經(jīng)元被短暫地轉(zhuǎn)染了表達(dá)一個Q73mHTT外顯子1（HTT-exon1-Q73）的結(jié)構(gòu)體，時長為3天，而mHTT通過HTRF、westernblot或者免疫染色法檢測。用HTRF加兩組抗體對（4C9-Tb/MW1-D2）檢測顯示，cDNA共轉(zhuǎn)染的NUB1過表達(dá)減少了mHTT含量（幅度達(dá)74.4±0.8%，圖6a左），而另兩組抗體對（4C9-Tb/4C9-D2）則檢測到聚合的mHTT（98.5±0.8%，圖6a中）。Westernblot結(jié)果與HTRF一致（圖6a右）。此外，mHTT聚合物用抗體EM48通過免疫染色實(shí)現(xiàn)可視化（圖6b）。在免疫染色與HTRF或westernblot得到的mHTT含量改變情況一致的結(jié)果中，NUB過表達(dá)降低了經(jīng)EM48+免疫染色的神經(jīng)元百分比（從8.5±0.9%降至1.5%±0.3%；圖6b）。mHTT-NUB1轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元中該百分比（43.6±1.6%）稍高于無NUB1共轉(zhuǎn)染的HTT轉(zhuǎn)染細(xì)胞（34.3±1.2%；圖6b），這可能表明mHTT誘發(fā)的毒性得到降低。相比之下，當(dāng)mHTT外顯子1上所有的賴氨酸殘基都突變?yōu)榫彼幔≦73_3R）時，NUB1介導(dǎo)的降低作用對mHTT無效（圖6a、b），表明mHTT賴氨酸修飾可能參與了相關(guān)反應(yīng)，并通過翻譯后修飾機(jī)制協(xié)助了NUB1介導(dǎo)的mHTT含量降低過程。盡管hESC分化神經(jīng)元能模擬人類神經(jīng)元，但它過表達(dá)的是mHTT片段而非內(nèi)源性全長mHTT。為了確認(rèn)NUB1能否在人類神經(jīng)元中清除內(nèi)源性mHTT，我們培養(yǎng)了從患病者身上得到的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）分化的神經(jīng)元。與非定位對照組相比，在NUB1被siRNA敲除后細(xì)胞內(nèi)mHTT水平顯著升高（HTRF測得增幅為17.2±0.0%，圖6c左）。此外，NUB1經(jīng)慢病毒感染過表達(dá)后與LacZ對應(yīng)慢病毒感染的細(xì)胞相比，mHTT含量顯著降低（HTRF測得降幅為15.7±1.7%，圖6c右），與未感染樣本相比也有類似結(jié)果。mHTT含量降低程度沒有老鼠神經(jīng)元大（圖5c），可能是由于iPSC分化神經(jīng)元的病毒感染效率較低（iPSC為~35%，而老鼠神經(jīng)元>95%，通過IRES-GFP判斷；數(shù)據(jù)未顯示）。和最近的研究結(jié)果一致的是，我們觀察到我們的iPSC分化神經(jīng)元在培養(yǎng)基中從腦部提取的嗜神經(jīng)組織因子（neurotropicfactor,BDNF）被移除后升高了caspase3和/或7的活性（圖6d、e）。通過HTTsiRNA轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)的HTT敲除將caspase活性降低到接近野生型水平（圖6d、e），說明存在一種mHTT依賴的神經(jīng)毒性。在Q70的iPSC分化神經(jīng)元中，NUB1過表達(dá)降低了caspase3和/或7的活性，表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)性（圖6d、e）。總而言之，NUB1降低了mHTT含量，保護(hù)了我們測試的所有人類神經(jīng)元模型中保護(hù)了神經(jīng)元，這其中包括來自亨廷頓舞蹈癥患者的iPSC分化神經(jīng)元（最接近患者神經(jīng)元的體外模型）。NUB1通過CUL3依賴的多聚泛素化降低mHTT含量mHTT賴氨酸殘基的參與（圖6a、b）和關(guān)于NUB1的研究報(bào)道表明了可能存在一種賴氨酸翻譯后修飾機(jī)制，通過泛素樣蛋白NEDD8或FAT10實(shí)現(xiàn)NUB1依賴的mHTT清除。評估NEDD8或FAT10對于底物的影響是具有挑戰(zhàn)性的，這可能是通道過多或蛋白量過高的結(jié)果。因此，為了弄清NUB1對mHTT含量的改變是否需要NEDD8和／或FAT10參與，我們使用了老鼠HN10成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞（表達(dá)了NEDD8但沒有可測量的FAT10，補(bǔ)充圖7）。當(dāng)與一個HTT外顯子1-Q73結(jié)構(gòu)體共轉(zhuǎn)染時，NUB1轉(zhuǎn)染與空白轉(zhuǎn)染相比顯著降低了mHTT含量（補(bǔ)充圖8a），表明NUB1依賴的mHTT降解并不需要FAT10。siRNA敲除NEDD8則阻礙了NUB1介導(dǎo)的HTT外顯子1清除（補(bǔ)充圖8a）。NUB1過表達(dá)對HTT外顯子1-Q73_3R沒有作用（補(bǔ)充圖8a）。因此，NEDD8（而不是FAT10）是NUB1介導(dǎo)的mHTT降解所必須的。與mHTT清除需要NEDD8一樣，對Q68成纖維細(xì)胞用MLN4924（一種強(qiáng)有力的NEDD8激活酶抑制劑）進(jìn)行處理也能增加內(nèi)源性mHTT含量（補(bǔ)充圖8b左）。通過siRNA敲除實(shí)現(xiàn)的NUB1表達(dá)缺失導(dǎo)致了MLN4924活性缺失，表明其活性通路與功能性NUB1以及NEDD化級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)（補(bǔ)充圖8b右）。綜上所述，最簡單的解釋就是mHTT受到NEDD8的調(diào)控（NEDD化），而NEDD化的mHTT通過NUB1被清除。然而，盡管我們付出了廣泛的努力（數(shù)據(jù)未顯示），我們依然沒能檢測到任何NEDD化的mHTT。因此，我們猜測是通道內(nèi)的其他成分被NEDD化了而非mHTT本身。描述最完善的NEDD8底物是滯蛋白泛素E3連接酶類。我們通過過表達(dá)帶有一個V5抗原決定基的顯性負(fù)滯蛋白類（dnCUL1-dnCUL5）（見在線實(shí)驗(yàn)步驟）研究滯蛋白類對之前描述的過程的參與情況。只有dnCUL3過表達(dá)阻礙了NUB1介導(dǎo)的mHTT降解（從61.0±4.4%降為19.7±13.4%，n=5），表明CUL3參與了這一過程。因?yàn)镃UL3是一個泛素E3連接酶的主要組成部分，我們便尋找mHTT的泛素化。我們在STHdh細(xì)胞中短暫地共表達(dá)了血凝素（HA）標(biāo)記的HTT外顯子1-Q73（Q73-HA）蛋白與NUB1/dnCUL3（任一或者兩者均有，圖7b）。細(xì)胞之后經(jīng)過了MG132處理，Q73-HA經(jīng)過免疫沉降反應(yīng)后進(jìn)行了westernblot（抗體結(jié)合泛素）以檢測泛素化（圖7b左）。我們在HTT外顯子1-Q73中檢測到了一個微弱的基線多聚泛素化信號，大約在110-160kDa處。NUB1過表達(dá)增強(qiáng)了該信號，并且與背景相比沒有出現(xiàn)在賴氨酸三聯(lián)突變體中。dnCUL3稍微降低了基線多聚泛素化，但強(qiáng)烈抑制了NUB1誘導(dǎo)的mHTT多聚泛素化增強(qiáng)。因此，似乎是NUB1過表達(dá)通過CUL3泛素E3連接酶增強(qiáng)了mHTT多聚泛素化過程。與依賴CUL3一致的是，dnCUL3共轉(zhuǎn)染部分抑制了NUB1介導(dǎo)的STHdh細(xì)胞保護(hù)作用（圖7）。這可以通過移除血清培養(yǎng)基后STHdhQ111/Q111細(xì)胞的caspase3和/或7酶活性降低程度進(jìn)行測定（本實(shí)驗(yàn)中活性從36.5±0.6%降到25.1±0.1%）。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了CUL3的參與，并確認(rèn)了NUB1介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)是通過減少mHTT完成的。綜上所述，NUB1促進(jìn)HTT降解的一個可能的解釋是，通過與HTT和NEDD化蛋白的實(shí)質(zhì)性接觸，NUB1將NEDD化的活性CUL3運(yùn)送到HTT蛋白，增強(qiáng)了泛素化和HTT降解（補(bǔ)充圖9）。IFNβ處理導(dǎo)致NUB1介導(dǎo)的mHTT含量降低為了加強(qiáng)NUB1介導(dǎo)的HTT降解，我們檢測了作為一種潛在的亨廷頓舞蹈癥治療途徑的NUB1表達(dá)誘導(dǎo)。根據(jù)前人報(bào)道，NUB1是一種可由IFNβ誘導(dǎo)的蛋白，而IFNβ經(jīng)FDA批準(zhǔn)可用于臨床使用。因此，我們研究了IFNβ處理對HTT含量和神經(jīng)毒性的影響，作為針對NUB1的可能治療途徑概念的證據(jù)。胞外使用IFNβ兩天后在Q68成纖維細(xì)胞和STHdhQ7/Q111細(xì)胞中均出現(xiàn)NUB1蛋白含量升高和HTT含量降低的現(xiàn)象（圖8）。這一影響不是通過改變HTT基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)镮FNβ處理沒有減少HTT基因的mRNA含量（圖8b）。HTT含量降低與IFNβ處理之間的劑量－應(yīng)答關(guān)系具有617Uml-1的半最大效應(yīng)濃度（EC50）（圖8c），這與之前報(bào)道的誘導(dǎo)NUB1基因表達(dá)的IFNβ濃度接近；此外，IFNβ處理沒有引起顯著的毒性（圖8c）。為了確認(rèn)IFNβ誘導(dǎo)的HTT含量降低是由NUB1主導(dǎo)的，我們將NUB1基因的siRNA或者對照組siRNA轉(zhuǎn)染入Q68成纖維細(xì)胞，之后對細(xì)胞進(jìn)行IFNβ處理。與對照組或未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染了NUB1基因siRNA的細(xì)胞的IFNβ劑量－應(yīng)答曲線出現(xiàn)了明顯的右移（EC50移至大于4000Uml-1；圖8c）。為了探究在哺乳動物神經(jīng)元中IFNβ是否能抑制mHTT誘導(dǎo)的毒性，我們對HTT140Q/140/Q初級神經(jīng)元的培養(yǎng)體系進(jìn)行了IFNβ處理以誘導(dǎo)NUB1蛋白的表達(dá)。HTT含量顯著降低（wtHTT降低了36.9±10.6%而mHTT降低了50.0±7.7%；圖8d）。HTT140Q/140/Q神經(jīng)元的通透性恢復(fù)到了與經(jīng)BDNF處理過的細(xì)胞相似的水平（102.6±3.0%；圖8e）。與BDNF的無特異性神經(jīng)營養(yǎng)功能相比，通過IFNβ的神經(jīng)恢復(fù)只針對mHTT神經(jīng)元，在野生型神經(jīng)元中沒有活性。這與之前的假說（即因IFNβ而增加的NUB1拯救了mHTT引發(fā)的神經(jīng)毒性，而不是提供無特異性的神經(jīng)保護(hù)）一致。為了進(jìn)一步證明IFNβ通過NUB1保護(hù)神經(jīng)元，我們檢測了沒有NUB1表達(dá)的IFNβ的影響。由于沒有Nub1敲除的老鼠模型，我們在STHdh細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而且通過siRNA達(dá)到了近乎完全的Nub1基因敲除（補(bǔ)充圖4b）。在STHdhQ111/Q111細(xì)胞中，IFNβ抑制了刺激誘導(dǎo)的caspase活性（52.1±0.6%；圖8f），而Nub1siRNA轉(zhuǎn)染顯著地削弱了這一影響（降至11.0±1.5%；圖8f）表明IFNβ引發(fā)的保護(hù)作用的主要機(jī)制是通過NUB1完成的。上述發(fā)現(xiàn)突出了IFNβ或NUB1誘導(dǎo)作為亨廷頓舞蹈癥治療途徑的潛能。討論人們認(rèn)為，減少mHTT的含量是一種有效的亨廷頓舞蹈癥治療方法。然而，由于沒有針對mHTT含量變化的篩選方面的努力，經(jīng)確認(rèn)的調(diào)控mHTT蛋白的位點(diǎn)很少。這里我們報(bào)告了據(jù)我們所知的首次目標(biāo)為確認(rèn)mHTT含量調(diào)控物的全基因組篩選。盡管我們可能因各種失誤（其中包括從果蠅到人類的同源基因繪譜不完全，以及其他在確認(rèn)過程中不可避免的損失）排除了一些位點(diǎn)，我們通過在不同物種間測試和多個體系中實(shí)驗(yàn)將假陽性的風(fēng)險降到最低。我們在人類患者細(xì)胞系中確認(rèn)了13個調(diào)控內(nèi)源性mHTT含量的位點(diǎn)，而測試的10個位點(diǎn)中的6個顯示出與其在HTT蛋白實(shí)驗(yàn)中的活性一致的體內(nèi)活性。盡管有報(bào)告顯示在幾百個確認(rèn)的蛋白中NUB1與HTT存在相互作用，我們的研究是第一個展示NUB1在亨廷頓舞蹈癥中的生物功能的。在人類神經(jīng)元模型中，它減少了全長mHTT蛋白，防止了mHTT聚合物的形成。該活性在果蠅、人類和老鼠中均一致，證明了NUB1是一個強(qiáng)有力的，而且進(jìn)化上保守的mHTT蛋白調(diào)控因子。在哺乳動物模型和轉(zhuǎn)基因果蠅體內(nèi)模型中，NUB1顯示出mHTT特異性的神經(jīng)保護(hù)活性。NUB1調(diào)控mHTT含量的功能及與之伴隨的對依賴mHTT的細(xì)胞毒性的抑制一起，支持了定位NUB1基因的可能治療策略。NUB1過表達(dá)可能也會降低wtHTT含量，至少在一些經(jīng)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系中（例如圖5a）。這可能引發(fā)對靶向定位NUB1基因的關(guān)注；然而，與降低mHTT伴隨的wtHTT部分缺失可能是對mHTT殘留有利