分子生物學(xué)方式檢測(cè)結(jié)核桿菌對(duì)利福平耐藥性研究進(jìn)展摘要:最近幾年對(duì)結(jié)核桿菌耐藥機(jī)制的研究說(shuō)明，rpoB基因是利福平耐藥相關(guān)基因，耐藥株通常發(fā)生特定位點(diǎn)基因突變，因此能夠通過(guò)鑒定突變有無(wú)而評(píng)估其利福平耐藥性，本文對(duì)這方面研究做一簡(jiǎn)要綜述。結(jié)核病至今仍是世界上一個(gè)嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問(wèn)題，估量目前全世界每一年有800萬(wàn)新病例發(fā)生，290萬(wàn)人死于結(jié)核病，是現(xiàn)今單一致病菌致死的最要緊死因。近十幾年來(lái)結(jié)核病疫情呈現(xiàn)全世界性明顯上升趨勢(shì)，產(chǎn)生緣故之一是耐藥菌株的產(chǎn)生和播散。1990年我國(guó)結(jié)核病流行調(diào)查結(jié)果說(shuō)明，我國(guó)臨床分離株耐藥率達(dá)％，初始耐藥率％，復(fù)治繼發(fā)耐藥率％。利福平是一種要緊的抗結(jié)核藥物，對(duì)利福平耐藥常常致使化療失敗，且被以為是多耐藥菌株的標(biāo)志之一。因此初期迅速對(duì)結(jié)核患者利福平耐藥性進(jìn)行鑒定十分重要?，F(xiàn)將有關(guān)研究進(jìn)展做進(jìn)一簡(jiǎn)要綜述。傳統(tǒng)方式依托直接或間接含藥培育進(jìn)行結(jié)核分支桿菌利福平耐藥性鑒定，這是體外結(jié)核桿菌耐藥性的直接證據(jù)，而且能夠了解其對(duì)利福平耐藥程度。但各實(shí)驗(yàn)室間所用培育基不同，檢測(cè)方式不同，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)不一，致使結(jié)果報(bào)告不同，而且由于結(jié)核分支桿菌本身屬于緩慢生長(zhǎng)菌，使得耐藥培育耗時(shí)長(zhǎng)，通常需8～12周，不能知足現(xiàn)代短程化療需要。最近幾年進(jìn)展起來(lái)的應(yīng)用BACTEC460TB系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)核桿菌快速培育及藥敏測(cè)定能夠大大縮短結(jié)果回報(bào)時(shí)刻，但此法成立在培育方式基礎(chǔ)上仍需數(shù)天出結(jié)果，加上儀器試劑昂貴，有放射性污染等，限制了臨床普遍應(yīng)用。1利福平耐藥基因的研究關(guān)于結(jié)核桿菌利福平耐藥機(jī)制一直存在三種假設(shè)，膜通透性改變、耐藥質(zhì)粒介導(dǎo)及染色體組基因突變（耐藥性有關(guān)基因），其中已證明耐藥基因突變與利福平耐藥有緊密關(guān)系。關(guān)于細(xì)菌利福平耐藥基因研究第一在大腸桿菌取得重要沖破。第一發(fā)覺(jué)利福平耐藥的大腸桿菌其RNA聚合酶有突變而且只發(fā)生在β亞單位上，并推知產(chǎn)生這種β亞單位突變的基因位點(diǎn)相接，進(jìn)一步對(duì)基因研究取得了大腸桿菌野生株編碼RNA聚合酶β亞單位基因（rpoB）序列，并發(fā)覺(jué)耐利福平的大腸桿菌有rpoB基因突變。由于編碼RNA聚合酶基因在細(xì)菌進(jìn)化中呈高度序列保守性，依照對(duì)大腸桿菌利福平耐藥基因的研究資料，Telenti[1]第一對(duì)結(jié)核分支桿菌利福平耐藥基因突變進(jìn)行了全面研究，發(fā)此刻與大腸桿菌rpoB基因突變多發(fā)區(qū)（Ⅰ區(qū)）相應(yīng)位點(diǎn)（511～533aa）的長(zhǎng)69bp片段內(nèi)，64/66耐藥株有突變發(fā)生，而未見(jiàn)于56株利福平靈敏結(jié)核菌株。爾后許多研究都證明這一結(jié)果，并發(fā)覺(jué)發(fā)生于此區(qū)城內(nèi)新的突變位點(diǎn)[2～5]。而Miller[6]做了如此一項(xiàng)研究，他應(yīng)用致點(diǎn)突變技術(shù)造成編碼rpoB基因531號(hào)氨基酸（參考大腸桿菌基因位點(diǎn)）堿基突變并將其導(dǎo)入利福平靈敏的恥垢分支桿菌株LRZZZ中，使之發(fā)生了表型改變，即由原先的利福平靈敏株轉(zhuǎn)為利福平耐藥，也證明rpoB基因突變是致使利福平耐藥的唯一緣故。Williams[4]對(duì)一患者感染的結(jié)核桿菌株發(fā)生利福平耐藥表型轉(zhuǎn)換前后做了rpoB基因序列分析研究，證明表型發(fā)生改變后其耐藥基因發(fā)生了改變。但ropB基因突變致利福平耐藥詳細(xì)機(jī)制目前還未十分明了。2分子生物學(xué)檢測(cè)方式上述對(duì)結(jié)核桿菌利福平耐藥機(jī)制研究取得的重要功效為運(yùn)用分子生物學(xué)方式進(jìn)行耐藥性評(píng)估提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)，其技術(shù)線路大體上是在用PCR方式對(duì)rpoB基因突變集中區(qū)域擴(kuò)增基礎(chǔ)上，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行突變鑒定，歸納如下：直接順序法對(duì)突變多發(fā)區(qū)城序列分析是鑒定突變的最直觀靠得住的方式，能夠準(zhǔn)確判定突變的有無(wú)及突變性質(zhì)，也是其它快速間接辨別方式的金標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用放射性同位素或熒光標(biāo)記測(cè)序法，已發(fā)覺(jué)許多突變位點(diǎn)及不同的氨基酸置換。突變?cè)?11-533這一區(qū)域內(nèi)發(fā)生率達(dá)95％以上，其中以531，526，533，516四個(gè)位點(diǎn)最為常見(jiàn)[1～5]。Williams研究了流行病學(xué)特點(diǎn)和結(jié)核桿菌利福平耐藥突變性質(zhì)之間的內(nèi)在聯(lián)系，以為突變位點(diǎn)及性質(zhì)與耐藥模式及程度，IS6110圖譜及地位來(lái)源等無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系。但Taniguechi[5]有不同意見(jiàn)，他研究結(jié)果說(shuō)明513，526，531位點(diǎn)的突變致使對(duì)利福平高度耐藥而其他位點(diǎn)那么明顯低度耐藥或全然無(wú)耐藥性?？傊苯訙y(cè)序能夠取得突變?cè)敿?xì)資料，還能夠?qū)π掳l(fā)覺(jué)突變進(jìn)行鑒定，不足的地方是儀器試劑昂貴，操作復(fù)雜，本錢(qián)高，有放射性污染，不適于普遍推行應(yīng)用。多聚酶鏈?zhǔn)椒从?單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法（PCR-SSCP）其原理為依照在非變性聚丙烯酰胺凝膠中相同長(zhǎng)度單鏈DNA片段泳動(dòng)距離的改變判定單個(gè)堿基變異。由于利福平耐藥突變只在特定區(qū)域內(nèi)發(fā)生，而通過(guò)PCR方式擴(kuò)增這段基因，直接電泳判定突變有無(wú)，大大簡(jiǎn)化了突變分析操作。Telenti[1]最先評(píng)估了放射性同位素標(biāo)記PCR-SSCP方式的結(jié)核桿菌rpoB突變中的應(yīng)用價(jià)值。所有利福平耐藥菌株均成功地被檢測(cè)出來(lái)，證明此方式特異準(zhǔn)確。它能夠同時(shí)進(jìn)行大量臨床標(biāo)本挑選，使結(jié)果回報(bào)時(shí)刻縮至48～72小時(shí)。目前國(guó)內(nèi)外本方式的研究較多，并已有成功用于臨床痰標(biāo)本及腦脊液標(biāo)本檢測(cè)的報(bào)導(dǎo)[2,7,8]。SSCP方式為臨床快速簡(jiǎn)便鑒定結(jié)核桿菌ropB基因突變開(kāi)辟了新領(lǐng)域，盡管存在必然不足，如每次電泳均需有標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核桿菌株對(duì)照及有時(shí)不同不易區(qū)分、不能辨別沉默突變[9]等，但仍不失為一種有普遍應(yīng)用前景的方式。雙脫氧指紋圖法（dideoxyfingerprinting,ddF）在對(duì)PCR產(chǎn)和的進(jìn)行ropB基因突變檢測(cè)方式的研究中，F(xiàn)elmee應(yīng)用了ddF法[9]，這種方式結(jié)合運(yùn)用了雙脫氧結(jié)尾終止法及SSCP法的原理，它將ropB基因片段復(fù)制產(chǎn)物做模板直接加入用于產(chǎn)生類似DNA測(cè)序產(chǎn)物的有放射性標(biāo)記的不同長(zhǎng)度的雙脫氧結(jié)尾片段，再行SSCP，經(jīng)放射自顯影后得出針對(duì)不同突變的特異的ddF。如此，若是有ropB基因突變，在SSCP電泳中不僅能夠從因單鏈構(gòu)象改變產(chǎn)生的泳動(dòng)距離不同在SSCP中得以辨別，同時(shí)由于其雙脫氧結(jié)尾終止位點(diǎn)不同于標(biāo)準(zhǔn)株，雙脫氧末段片段數(shù)量也不同而得以區(qū)分。Felmee檢測(cè)出了有不同突變（其中包括了80％已報(bào)導(dǎo)的ropB突變）的所有多耐藥菌株，每一突變均有特異的ddF。在與SSCP分析法的對(duì)照研究中，以為ddF方式能夠克服SSCP結(jié)果受電泳條件、電泳時(shí)刻阻礙大，受突變性質(zhì)（位點(diǎn)及突變堿基）阻礙大及不能區(qū)分出，在時(shí)刻和本錢(qián)上都有優(yōu)越性，但未見(jiàn)有進(jìn)一步臨床應(yīng)用情形的報(bào)導(dǎo)。異源雙鏈形成法（heteroduplexformation,HDF）HDF可用于檢測(cè)DNA單個(gè)堿基突變或缺失，原理為突變基因與無(wú)突變基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合，變性后使其溫度緩慢下降，部份可形成別離來(lái)源于突變與靈敏株基因的異源雙鏈，同時(shí)有部份形成同源雙鏈，電泳后可將二者區(qū)分開(kāi)來(lái)，而且突變不同（如單堿基突變，插入、或缺失），形成的異源雙鏈遷移距離也不同。Williams[4]用HDF法進(jìn)行了結(jié)核桿菌利福平ropB突變檢測(cè)的嘗試，110株RFP耐藥株經(jīng)HDF檢測(cè)取得多條帶形，證明有異源雙鏈形成，而靈敏株那么只形成一條同源雙鏈，HDF法與DNA測(cè)序法符合率達(dá)100％。這種方式操作簡(jiǎn)便，判定容易，不需放射性標(biāo)記，適合應(yīng)用于臨床，但有關(guān)報(bào)導(dǎo)較少。反向系列探針雜交法（Innolineprobeassay,LiPA）LiPA方式基于探針雜交原理，先設(shè)計(jì)合成一系列探針，覆蓋整個(gè)ropB突變多發(fā)區(qū)，其中S系列探針針對(duì)野毒株序列，R系列探針含數(shù)個(gè)有常見(jiàn)突變序列的探針，還能夠設(shè)計(jì)一個(gè)有種屬特異性的探針，將這一系列探針按序固定于同一雜交膜上，在嚴(yán)格條件下與親和素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交，檢測(cè)雜交信號(hào)，依照不同雜交帶譜判定出突變有無(wú)及大致位置。這種雜交方式能夠同時(shí)進(jìn)行種屬鑒定，檢測(cè)試劑盒已有廠家生產(chǎn)，結(jié)果判定容易，特異性高，易于標(biāo)準(zhǔn)化。如Beenhouwer[10]應(yīng)用此法對(duì)臨床痰標(biāo)本的檢測(cè)中與藥敏結(jié)果對(duì)照有97％（65/67）的符合率。最近有學(xué)者[11]應(yīng)用此法同時(shí)對(duì)結(jié)核分支桿菌進(jìn)行種屬鑒定及PCR靈敏性測(cè)定，特異性達(dá)100％，對(duì)107株已知序列的結(jié)核桿菌臨床分離株測(cè)定中，61株靈敏株全數(shù)顯示靈敏型雜交帶譜，203株耐藥株除4株外均檢測(cè)到突變帶譜，誤診率下降到％。不足的地方是操作復(fù)雜，本錢(qián)較高。以上分子生物學(xué)方式對(duì)結(jié)核桿菌RFP耐藥性檢測(cè)應(yīng)用中均有快速、準(zhǔn)確，特異等優(yōu)勢(shì)，可在72h內(nèi)報(bào)告結(jié)果，能夠知足初期臨床診治需要，是結(jié)核桿菌RFP耐藥性測(cè)定進(jìn)展必然趨勢(shì)。下一步研究重點(diǎn)是提高臨床標(biāo)本ropB基因擴(kuò)增特異性（因其單拷貝存在于基因組中），技術(shù)條件標(biāo)準(zhǔn)化、標(biāo)準(zhǔn)化，和將耐藥性診斷及種屬鑒定同時(shí)進(jìn)行的方式，使其能夠成為直接應(yīng)用于臨床的有效方式。參考文獻(xiàn)1Telenti,ImbodenP,MarchesiF,etal.Lancet,1993；341:647-6502TeletiA,ImbodenP,MarchesiF,etal.AntimicroAgentsChemother,1993；37:2045-20583KapurV,LiLL,IordanescuS,etal.JClinMicrobiol,1994；32:1095-10984WilliamsDL,WaguespackC,EisenachK,etal.1994；35:2380-23865TaniguichiH,AramakiH,NikadoY,etal.FEBS-microbiolLett,1996；144:103-1086MillerLP,CrawfordJJ,ShinnickTM.AntimicroAgentsChemother,1994；38:805-8117ScarpelliniP,BragliaS,BrambillaAM,etal.JClinMicrobiol,1997；5:2802-28068程紹基，嚴(yán)碧涯，馬嶼，等。中華結(jié)核和呼吸雜志，1996；19：333-3379FelmeeTA,LiuQ,Wh