DB41DB41/T1422—2017蝴蝶蘭建蘭花葉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法2017-07-07發(fā)布2017-10-07實(shí)施河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1蝴蝶蘭建蘭花葉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法建蘭花葉病毒為ssRNA病毒，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的作用將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，針對(duì)核酸保守時(shí)PCR所需的循環(huán)次數(shù)為Ct值，與樣本細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定、豐度較低的基因（內(nèi)參基因，2蝴蝶蘭建蘭花葉病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR特異性引物為Cymv-F：5’-TGCCAGACGGTGCTATCGTA-3’、Cymv-R：5’-AGAAAGGTGGAAG蝴蝶蘭實(shí)時(shí)熒光RT-PCR內(nèi)參引物為PeActin-F：5’-CTCTTTCACAACCACTGCGG-3’、PeActin-R：5’-TGGGCACCTAAATCTCTCAGC-3’3將制備好的樣品置于實(shí)時(shí)熒光PCR儀上，設(shè)置95查看擴(kuò)增曲線（圖2）。擴(kuò)增曲線包括熒光背景信號(hào)階段、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)46.6.1待測(cè)樣品內(nèi)參基因PeActin引物Ct值為18≤Ct≤20，Cymv引物Ct值為40時(shí)，判定結(jié)果為陰6.6.2待測(cè)樣品內(nèi)參基因PeActin引物Ct值為18≤Ct≤20，Cymv引物Ct值為≤35時(shí)，則判定結(jié)果6.6.3待測(cè)樣品內(nèi)參基因PeActin引物Ct值為18≤Ct≤20，Cymv引物Ct值為35＜Ct＜40時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行測(cè)試。如果測(cè)試的Cymv引物Ct值為40時(shí)，則判定結(jié)果為陰性；如果重新測(cè)試的Cymv引物Ct5建蘭花葉病毒病毒顆粒呈線狀，長(zhǎng)度475nm，寬度13nm，螺旋對(duì)糖蛋白體，有一種結(jié)構(gòu)蛋白（外殼蛋白）和基因組ssRNA組成。外殼蛋白的分子量為23.6kDa左右220個(gè)氨基酸組成。核酸為線性正義鏈ssRNA，分子量為稀釋限點(diǎn)5×10-5，鈍化溫度65℃~70℃。通過(guò)一次PEG沉淀，在蔗糖密度梯度離心后病毒成明顯的條CymMV的RNA基因組全長(zhǎng)為6227bp，3’末端有poly（A）加尾，5’端有帶帽結(jié)構(gòu)，與馬鈴薯X屬類似。其基因組結(jié)構(gòu)包括5個(gè)開(kāi)放式閱讀框（ORFORF1編碼CymMV所編碼的蛋白與馬鈴薯X病毒屬其它成員編碼的對(duì)應(yīng)蛋白有很高的同源性。不