4GB/Txxxxx—XXXX化學(xué)品重復(fù)劑量毒性合并生殖/發(fā)育毒性篩選試驗方法該文件規(guī)定了化學(xué)品重復(fù)劑量毒性合并生殖/生長發(fā)育毒性篩選試驗的范圍、術(shù)語和定義、試驗基本原則、試驗方法、試驗數(shù)據(jù)和報告。該文件適用于檢測化學(xué)品的重復(fù)劑量毒性及致畸性、繁殖及生長發(fā)育毒性篩選。該文件也可以作為致畸試驗、一代和兩代繁殖毒性的預(yù)試驗。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語、定義和縮略語下列術(shù)語、定義和縮略語適用于本文件。3.1術(shù)語和定義3.1.1雄激素活性androgenicity一種化學(xué)物質(zhì)在哺乳動物體內(nèi)表現(xiàn)得像天然雄激素（例如睪酮）的能力。3.1.2抗雄激素活性antioestrogenicity一種化學(xué)物質(zhì)能夠在哺乳動物體內(nèi)抑制或干擾天然雄激素（如睪酮）作用的能力。這種物質(zhì)可能通過阻斷雄激素受體或抑制雄激素的生成來實現(xiàn)其效果。3.1.3抗雌激素活性antioestrogenicity一種化學(xué)物質(zhì)在哺乳動物體內(nèi)抑制天然雌激素激素（例如雌二醇17β)作用的能力。3.1.4抗甲狀腺素活性antithyroidactivity一種化學(xué)物質(zhì)能夠抑制哺乳動物體內(nèi)天然甲狀腺激素（如三碘甲腺原氨酸，T3）的作用的能力。這種化學(xué)物質(zhì)可以通過多種方式抑制甲狀腺激素的功能，從而影響新陳代謝和其他依賴甲狀腺激素的生理過程。3.1.5繁殖力損害impairmentoffertility雌性或雄性動物生殖功能或能力異常。3.1.6生長發(fā)育毒性developmentaltoxicity屬生殖毒性，系指子代在出生前、圍產(chǎn)期和出生以后所顯現(xiàn)出的結(jié)構(gòu)（機體缺陷）或功能異3.1.7劑量dose系指受試物的量，常以受試動物每單位體重每日所給予的受試物的量（mg/kg/day）來表示；如將受試物摻入飼料進行喂養(yǎng)染毒時，也可以用受試物在飼料中的恒定質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/kg）來表示。GB/Txxxxx—XXXX3.1.8用量dosage包括染毒劑量、染毒次數(shù)及染毒期限在內(nèi)的一般性術(shù)語。3.1.9明顯毒性evidenttoxicity給予受試樣品后出現(xiàn)的明確的毒作用表現(xiàn)，可作為危險度評價的充分證據(jù)，預(yù)期隨染毒劑量的增加可發(fā)展為嚴(yán)重的中毒癥狀直至死亡。3.1.10未觀察到有害作用的劑量no-observed-adverse-effectlevel（NOAEL）未發(fā)現(xiàn)與染毒有關(guān)的有害作用的最高劑量。3.1.11雌激素活性oestrogenicity一種化學(xué)物質(zhì)在哺乳動物體內(nèi)表現(xiàn)得類似于天然雌激素激素（例如雌二醇17β)的能力。3.1.12生殖毒性reproductiontoxicity后代的有害影響和/或?qū)δ行院团陨彻δ芑蚰芰Φ膿p害。3.1.13甲狀腺素活性thyroidactivity一種化學(xué)物質(zhì)在哺乳動物體內(nèi)表現(xiàn)得類似于天然甲狀腺激素（例如T3）的能力。3.2縮略語3.2.1AGDanogenitaldistance，從肛門到生殖器之間的距離3.2.2PNDPostnatalDay，通常在生物醫(yī)學(xué)和發(fā)育生物學(xué)中用于描述出生后經(jīng)過的天數(shù)。3.2.3UVCBsChemicalSubstancesofUnknownorVariableComposition,ComplexReactionProductsandBiologicalMaterials，未知或有多種組成成分的物質(zhì)、復(fù)雜的反應(yīng)產(chǎn)物或生物材料。4試驗基本原則4.1應(yīng)設(shè)多個劑量組，受試物按設(shè)計的劑量對數(shù)組雄性的雌性動物染毒，雄性動物的染毒期至少四周直至處死，包括處死的前一天，即交配前最少染毒兩周，交配期和交配后期染毒約兩周。由于雄性動物交配前染毒時間相對較短，繁殖力不能作為睪丸毒性的特異性敏感指標(biāo)，因此對睪丸進行詳細的組織學(xué)檢查很重要。通過包括對交配前染毒兩周的總共至少四周的染毒期內(nèi)雄性動物的交配行為/繁殖能力的觀察，以及隨后的雄性動物生殖腺的詳細組織病理學(xué)檢查足以檢出對雄性動物繁殖力和精子形成的主要毒性作用。4.2雌性動物在整個試驗期都應(yīng)接受染毒。包括交配前染毒兩周(至少包括兩個完整的發(fā)情期)，交配期、妊娠期和分娩后至少13天直至處死的前一天都需進行染毒。4.3在適應(yīng)期結(jié)束后，試驗持續(xù)時間取決于雌性動物的毒性表現(xiàn)。試驗期限大約為63天，即交配前至少為14天，交配期為14天左右，妊娠期和哺乳期則分別為22天和13天左右。4.4染毒期間，應(yīng)每日密切觀察動物的毒性表現(xiàn)。對試驗期間死亡或處死的動物都應(yīng)進行解剖檢查。試驗結(jié)束時，全部存活動物均應(yīng)處死并進行解剖檢查。6GB/Txxxxx—XXXX5試驗方法5.1動物品系選擇本方案的受試動物為大鼠。如選用其他種屬動物，應(yīng)作適當(dāng)修改。避免選用繁殖力低和公認(rèn)生長發(fā)育缺陷率高的品系。首選健康、剛進入性成熟期、未經(jīng)交配，并且未參加過任何試驗的動物。所選動物應(yīng)注明種類、品系、性別、體重和（或）周齡。試驗開始時，動物的體重相差不應(yīng)超過同性別平均體重的20%。如果本試驗是某項長期試驗或完整的生殖試驗的預(yù)試驗，應(yīng)確保兩個試驗所選實驗動物的品系和來源的一致性。5.2飼養(yǎng)條件5.2.1動物實驗室的環(huán)境溫度應(yīng)為22℃±3℃,相對濕度至少應(yīng)為30%，最好不超過70%，但清掃動物實驗室時除外。照明方式應(yīng)為人工晝夜（12h光照，12h黑暗喂飼常規(guī)飼料，動物自由飲水。如采用喂飼染毒方式，為保證與受試物均勻混合，可能會影響飼料的選擇。5.2.2試驗動物可單籠飼養(yǎng)，或按性別少量動物分籠群養(yǎng)（每籠不能超過5只交配過程應(yīng)在合適的籠具中進行。孕鼠應(yīng)單籠飼養(yǎng)，并給予造窩墊料。哺乳期雌鼠與其仔鼠分別單獨放置在籠中。5.3動物準(zhǔn)備健康初成年動物隨機分成對照組和染毒組。籠具的安置方式應(yīng)能盡量降低籠具放置不當(dāng)對試驗結(jié)果的影響。對動物和籠具進行唯一性標(biāo)記，并于試驗開始前在籠中適應(yīng)性喂養(yǎng)至少5天。5.4樣品處理5.4.1推薦經(jīng)口方式給予受試樣品，如有更合適的途徑，也可采用其他染毒方式。如選用經(jīng)口染毒，一般采用灌胃方式給予，也可以通過摻入飼料或飲用水的方式給予。5.4.2可根據(jù)試驗需要將受試樣品溶解或混懸于適宜的賦形劑中。應(yīng)盡可能選擇水溶液或水混懸液，如確實不能以水作為溶劑，再考慮選用油溶液或油乳化液（如玉米油然后才可考慮其他可能使用的賦形劑。當(dāng)賦形劑不是水時，必須了解賦形劑的毒性及受試樣品在賦形劑中的穩(wěn)定性和均勻性。5.5試驗程序5.5.1動物數(shù)量和性別各組在試驗開始時至少有10只雄性和12-13只雌性。在研究開始之前，雌性動物將被評估其發(fā)情周期。如果動物未表現(xiàn)出典型的4-5天周期，將不包括在研究中。因此，建議增加雌性動物的數(shù)量，以確保每組有10只雌性。除非出現(xiàn)明顯的毒性效應(yīng)，每組至少應(yīng)有8只懷孕的雌鼠，這通常是可接受的最低懷孕數(shù)量。這樣做的目的是為了獲得足夠的數(shù)據(jù)，以便正確評估樣品對動物的繁殖、妊娠、母鼠和仔鼠行為，以及對子代從受孕到出生后第13天的生長發(fā)育的影響。如果計劃對實驗動物進行階段性處死，則應(yīng)增加動物數(shù)量以滿足計劃要求。受試樣品最高劑量組和陰性對照組每個性別均應(yīng)各設(shè)置一個由5只動物組成的附加組，用于在試驗期結(jié)束后繼續(xù)對系統(tǒng)毒性作用的恢復(fù)、持續(xù)或遲發(fā)等情況進行至少14天的觀察。附加組的動物不進行交配，因此不用于評價生殖/發(fā)育毒性。5.5.2動物分組和劑量設(shè)計試驗至少設(shè)三個染毒組和一個對照組。受試樣品的劑量水平應(yīng)根據(jù)其急性毒性試驗或多次染毒試驗的結(jié)果來設(shè)定。如果沒有適宜的一般毒性資料可供參考，應(yīng)進行預(yù)試驗確定劑量水平。7GB/Txxxxx—XXXX對照組動物除不給予受試樣品外，其余的處理應(yīng)與染毒組完全相同。如果受試樣品使用賦形劑配制，對照組應(yīng)接受所用賦形劑的最大使用量進行平行染毒。染毒劑量水平的選擇應(yīng)考慮受試樣品或相關(guān)物質(zhì)已知的毒性和毒代動力學(xué)的數(shù)據(jù)。還應(yīng)注意懷孕和非懷孕動物對受試樣品敏感性的差異。最高劑量組應(yīng)可以使親代動物出現(xiàn)毒性反應(yīng)，但又不引起動物死亡或明顯的損害；下一個劑量水平應(yīng)選擇可以出現(xiàn)與劑量有關(guān)的反應(yīng)，最低劑量組應(yīng)不引起親代及其子代動物的任何毒性反應(yīng)。組間距通常為2-4倍。若設(shè)第四個劑量組，劑量組間的組距則可考慮大一些，例如10倍。在觀察到一般毒性（如體重減輕，肝臟、心臟、肺或腎臟的影響等）或其他可能不是毒性反應(yīng)的變化（如食物攝入減少、肝臟增大）時，應(yīng)謹(jǐn)慎解讀對內(nèi)分泌敏感終點的觀察結(jié)果。5.5.3限量試驗如果受試樣品每天以1000mg/kg的劑量經(jīng)口給予，或經(jīng)飼料/飲水給予相當(dāng)?shù)膭┝?，仍未觀察到任何毒副作用時，則可以采用限量試驗，即不必做有多個劑量組的完整試驗。若根據(jù)結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物資料預(yù)期不會產(chǎn)生毒性，也可采用限量試驗。但當(dāng)人的接觸情況表明需要采用較高劑量水平時，則不能進行限量試驗。若試驗采用的是其他的染毒途徑：如吸入或經(jīng)皮染毒，染毒的最高濃度通?？捎墒茉嚇悠返睦砘匦詠頉Q定。5.5.4染毒試驗動物每天染毒一次，每周染毒7d，受試樣品一般通過灌胃給予。應(yīng)使用灌胃針管或其他合適的插管一次灌胃給予。灌胃量取決于實驗動物的大小，最大的量通常不超過1mL/100g。如果受試樣品為水溶液，灌胃量則可以考慮增大到2mL/100g。在整個試驗過程中，應(yīng)該采用相同的灌胃體積，通過調(diào)整受試物濃度確保各劑量組的灌胃體積相同，盡量降低灌胃體積對試驗結(jié)果的影響。但由于具有刺激性或腐蝕性的物質(zhì)在濃度較高時通常毒作用會加劇。如果將受試樣品摻入飼料或溶于飲水中進行染毒，受試樣品在飼料或飲水中的含量不應(yīng)影響正常的營養(yǎng)成分或水的平衡。飼料中受試物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/kg）或按體重計算的劑量水平應(yīng)恒定不變，使用其他替代方法應(yīng)說明理由，灌胃染毒應(yīng)在每天的相同時間進行，為使染毒劑量保持一致，應(yīng)根據(jù)體重的變化每周至少調(diào)整一次灌胃總體積。如果本試驗是某項長期試驗或完整的生殖試驗的預(yù)試驗，應(yīng)確保兩次試驗飼料來源一致。5.5.5試驗程序雄性和雌性動物經(jīng)過至少5d的適應(yīng)期后進入正式試驗，交配前兩周開始染毒。試驗日程的安排應(yīng)能保證動物在進入完全性成熟后盡快開始交配，由于不同品系大鼠的性成熟期不完全相同，因此，針對不同品系動物選用的交配時間存在輕微差異，例如，SD大鼠的交配期應(yīng)從10周開始，而Wistar大鼠的交配期則應(yīng)從12周開始。孕鼠應(yīng)在分娩后第13天或稍晚處死。如果采集血樣需要對母鼠進行隔夜禁食，則不必在同一天處死母鼠和仔鼠。完成分娩過程的當(dāng)天計為分娩后第0天，未能成功交配的雌鼠應(yīng)在交配期最后一天的24天～26天處死。雌、雄性動物在交配期內(nèi)均繼續(xù)染毒。雄性動物在交配期后仍繼續(xù)染毒，至少持續(xù)至整個染毒期達到28天。根據(jù)試驗設(shè)計處死雄性動物，如認(rèn)為合適，可保留用于進行再一次的交配。母鼠在整個懷孕期、直至分娩后13天或處死的前一天都應(yīng)每天染毒。如吸入或經(jīng)皮染毒，染毒至少應(yīng)持續(xù)至懷孕的第19天，并且應(yīng)盡快重新開始給藥，不得遲于出生后第4天。對附加組動物應(yīng)持續(xù)觀察，不進行交配。觀察期至少持續(xù)到自第一次處死母鼠后的第14天，不再進行任何處理，以觀察延遲出現(xiàn)或持續(xù)存在的毒性效應(yīng)，或毒性效應(yīng)的恢復(fù)情況。試驗流程表見附錄B。5.5.6發(fā)情周期為了篩選具有規(guī)律發(fā)情周期的雌性動物，在開始染毒前監(jiān)測發(fā)情周期。從染毒開始直至出現(xiàn)交配現(xiàn)象，應(yīng)每天進行陰道涂片。如果擔(dān)心開始染毒時急性應(yīng)激反應(yīng)會改變發(fā)情周期，可以讓動物暴露兩周，每天收集陰道涂片，在交配前至少兩周內(nèi)監(jiān)測發(fā)情周期，并在交配期繼續(xù)監(jiān)測，直至出現(xiàn)交配現(xiàn)象。在獲取陰道/宮頸細胞時，注意避免粘膜干擾，以防誘導(dǎo)假孕[1][2]。5.5.7交配方法8GB/Txxxxx—XXXX雄性和雌性動物按1：1比例合籠交配。為避免雄性動物的偶然死亡對試驗造成影響，可不采用此交配比例。雌鼠應(yīng)始終與同劑量組的同一只雄鼠合籠交配直至受孕，合籠時間最長可達兩周。在交配過程中，每天早晨應(yīng)對雌鼠進行檢查，查看陰道中是否有精子或陰栓。將檢查到精子或陰栓的當(dāng)天計為雌鼠妊娠的第0天（判為交配成功動物）。若交配兩周后仍未受孕，可以將不育的雌鼠與同一劑量組內(nèi)已被證實有生育功能的雄鼠重新配對，再次合籠交配。5.5.8窩產(chǎn)仔數(shù)在出生后的第4天，根據(jù)所用鼠品系的正常窩仔數(shù)量，通過隨機選擇淘汰多余幼仔，將每窩的幼仔數(shù)量調(diào)整為盡可能接近每性別4-5只。從多余的仔鼠中收集兩份血液樣本，合并后用于測定血清T4水平。根據(jù)體重或有肛門生殖距離（AGD）的選擇性不合適淘汰仔鼠。當(dāng)雄性或雌性仔鼠的數(shù)量不足以達到每性別有4-5只時，可進行調(diào)整（如6只雄性和4只雌性）。當(dāng)窩產(chǎn)仔數(shù)低于淘汰目標(biāo)（8或10只幼崽/窩則不淘汰任何幼仔。如果只有一只幼仔達到淘汰目標(biāo)，則只淘汰一只幼仔用于采血以進行T4評估。如果沒有調(diào)整窩產(chǎn)仔數(shù)，在出生后的第4天每窩處死兩只仔鼠，并采集血液樣本以測量血清甲狀腺激素濃度。處死的兩只仔鼠應(yīng)盡可能是雌性，保留雄性幼仔進行乳頭評估。當(dāng)窩產(chǎn)仔數(shù)降至每窩8只或10只以下（取決于所用鼠品系的正常窩產(chǎn)仔數(shù)）時，將不會淘汰任何幼仔。如果在正常窩產(chǎn)仔數(shù)以上只有一個幼仔可用，則只淘汰一只幼仔用于采血以進行T4評估。5.5.9觀察指標(biāo)試驗期間，每日至少應(yīng)對動物進行一次一般臨床觀察，應(yīng)在預(yù)期毒性癥狀出現(xiàn)的高峰期進行觀察，且應(yīng)在每天同一時間點進行觀察。應(yīng)記錄動物的健康狀況。動物發(fā)病和死亡情況每天至少觀察兩次。在第一次染毒前應(yīng)對所有動物進行詳細檢查（獲得基線狀況用于動物自身的前后對照其后每周至少檢查一次，檢查時應(yīng)在籠外標(biāo)準(zhǔn)臺面上，每次檢查應(yīng)同一時間點進行。應(yīng)詳細記錄檢查結(jié)果，建議采用評分系統(tǒng)，實驗室應(yīng)有明確的評分標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)盡量減少實驗條件的差異對檢查結(jié)果的影響，建議由不知道動物組別的人員進行觀察。觀察體征應(yīng)包括（但不限于）以下內(nèi)容：皮膚、被毛、眼睛和黏膜的變化，是否有分泌物或排泄物，自主運動情況（如流淚、豎毛、瞳孔大小、異常呼吸等）。還應(yīng)記錄步態(tài)、姿勢和對染毒操作的反應(yīng)等狀態(tài)的改變，是否出現(xiàn)陣攣、強直性動作，是否有固定動作（如特別的梳理毛發(fā)動作、重復(fù)轉(zhuǎn)圈等是否出現(xiàn)難產(chǎn)或產(chǎn)程延長，是否有異常行為（例如自殘、倒退行走）等[3]。試驗過程中應(yīng)從每個組中隨機選擇5只雌性和5只雄性動物進行一次功能性檢查，指標(biāo)包括:對不同形式刺激的反應(yīng)性（聲音、視覺和本體感受刺激等）[1][2][4]、抓力強度和活動度[5][6]。對雄性動物的檢查應(yīng)選在接近染毒結(jié)束、即將被處死取血測定血液生化指標(biāo)時進行。對雌性動物的檢查應(yīng)在相同的生理狀態(tài)下進行檢測，推薦在哺乳期即將被處死時進行。為了防止仔鼠體溫過高，應(yīng)將母鼠與仔鼠分開一定時間后再進行檢查，盡可能減少母鼠和幼鼠的分離時間。如果本試驗是某項亞慢性試驗（90天）或長期試驗的預(yù)試驗，則研究結(jié)束時可不進行功能檢查，但應(yīng)對附加組進行功能檢查。另一方面，利用本試驗獲得的功能檢查結(jié)果，可以為亞慢性試驗（90d）或長期試驗的劑量設(shè)計提供更充分的依據(jù)。如果某些受試樣品劑量組已出現(xiàn)明顯的毒性癥狀，且這些毒性癥狀可對功能檢查造成干擾，則無需進行功能檢查。記錄妊娠持續(xù)時間，應(yīng)從懷孕的第0天開始計算。分娩后應(yīng)盡早檢查并記錄每窩的出生仔鼠數(shù)、活仔數(shù)、死仔數(shù)、低體重仔數(shù)和性別以及幼仔外觀有無異常和畸形。以每窩為單位，按性別稱重活仔鼠出生后24小時內(nèi)(產(chǎn)后第0天或第l天)和產(chǎn)后第4天和第13天的窩重。除觀察母鼠外，還應(yīng)記錄仔鼠的所有異常行為。在出生后第0天到第4天之間的同一天測量每只幼仔的AGD[7]；在測量AGD當(dāng)天應(yīng)收集幼崽體重，并將AGD歸一化為幼仔大小的一個量度，最好是體重的立方根。雄性幼崽的乳頭/乳暈數(shù)量應(yīng)在出生后第12或13天計算[8]。5.5.10體重和食物消耗量雌、雄動物應(yīng)在染毒的第一天進行稱重，以后每周至少稱量一次，試驗結(jié)束時一次。雌鼠還應(yīng)在妊娠的第0天、第7天、第14天和第20天，以及分娩后的24小時內(nèi)（產(chǎn)后第0天或第9GB/Txxxxx—XXXX1天）和產(chǎn)后第4天和第13天稱重。數(shù)據(jù)應(yīng)逐只進行記錄。交配期、孕期和哺乳期，至少應(yīng)測定每日食物消耗量（交配期的食物消耗量為選測指標(biāo)）。如果受試樣品是加入飲水中染毒的，水的攝入量也應(yīng)按上述時間要求進行測量。5.5.11血液學(xué)指標(biāo)試驗開始時就應(yīng)在每組動物中隨機選取5只雌性和5只雄性動物進行血液學(xué)檢查，測定指標(biāo)包括血細胞比容、血紅蛋白濃度、紅細胞計數(shù)、網(wǎng)織紅細胞、總和分類白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)以及凝血時間/功能等。如果受試樣品或其代謝物具有或疑似具有氧化性質(zhì)，則應(yīng)進行的其他測定包括高鐵血紅蛋白濃度和亨氏小體。血樣應(yīng)在指定的采血部位采集。雌性動物在采血時應(yīng)處于相同的生理期，為了避免懷孕時間不同造成的實際操作困難，可在開始交配時采血代替孕期血樣。雄性動物最好在處死前采血，也可與雌性動物一起在交配時采血。血樣應(yīng)在合適條件下儲存。5.5.12臨床生化臨床生化指標(biāo)用于檢測組織的重要功能損傷，特別是對腎臟和肝臟功能的損害作用。應(yīng)在試驗結(jié)束時進行。應(yīng)在每組動物中隨機選取5只雌性和5只雄性動物進行臨床生化指標(biāo)測定。采血前應(yīng)隔夜禁食（在對血清或血漿進行臨床生化指標(biāo)測定，特別是需要測定血糖時，必須進行禁食。否則會增加指標(biāo)的變異程度，從而會掩蓋一些不明顯的反應(yīng)，并給結(jié)果的解釋帶來困難。另一方面，隔夜禁食會影響懷孕動物的代謝水平，干擾哺乳和育仔行為，特別是在喂飼研究中，還會對受試樣品每天的暴露劑量造成影響。如果需進行隔夜禁食，則應(yīng)在第四周內(nèi)完成功能檢測尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、總蛋白（TP）、白蛋白（Alb）至少兩種可反映肝臟細胞功能的酶（例如：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、山梨醇脫氫酶(SDH)等）和膽汁酸。在某些情況下，檢測其他酶活性（肝或其他器官的）和膽紅素，可提供有用的信息。根據(jù)以下時間表從指定部位采集血樣：如果幼鼠數(shù)量足夠，則在出生后的第4天每窩至少采集兩只幼鼠的血液；在第13天終止時，采集所有母鼠以及每胎至少兩只幼鼠的血液；在試驗終止時，采集所有成年雄鼠的血液。所有血液樣本都在適當(dāng)條件下儲存。評估第13天幼鼠和成年雄鼠的血液樣本中血清甲狀腺激素（T4）水平。如果有關(guān)聯(lián)，則對母鼠和第4天幼鼠的血液樣本進行進一步的T4評估。如果有必要，可以選擇測量其他激素。幼鼠血液可以按窩合并進行甲狀腺激素分析。甲狀腺激素（T4和TSH）最好合并進行測量。根據(jù)試驗的情況，也可在第4周從每組動物中隨機選取5只雄性動物進行尿常規(guī)檢查，收集動物一定時間內(nèi)的尿液，檢測外觀，容量，滲透壓或比重，pH值，蛋白質(zhì)，葡萄糖和血液/血細胞。另外還應(yīng)考慮檢測血清中可反映組織損傷的標(biāo)志物。如果根據(jù)受試樣品的特性推測或懷疑其可能對代謝產(chǎn)生的影響，包括對鈣（Ca）、磷酸鹽、空腹甘油三脂（TG）、空腹血糖（Glu）、特異性激素、高鐵血紅蛋白（MeHb）、膽堿脂酶（ChE）活性等的影響，則應(yīng)根據(jù)具體情況測定其他指標(biāo)。以下因素可能影響激素的變異性和絕對濃度：-處死時間，激素濃度存在晝夜-處死方法，以避免對動物造成不必要的壓力，從而可能影響激素濃度-測定激素的試劑盒，它們可能在標(biāo)準(zhǔn)曲線上有所不同。專門用于激素測定的血漿樣品應(yīng)在一天中相對可比的時間采集。使用不同的商業(yè)檢測試劑盒分析激素濃度時得到的數(shù)值會有所不同。如果歷史基線數(shù)據(jù)不充分，應(yīng)考慮在給藥開始前或優(yōu)選使用一組未包含在實驗組中的動物，測定血液學(xué)和臨床生物化學(xué)變量。對于雌性動物，數(shù)據(jù)必須來自哺乳期的動物。5.5.13病理大體解剖檢查GB/Txxxxx—XXXX.1對所有受試的成年動物進行全面系統(tǒng)的大體解剖檢查，仔細檢查體表、所有體腔開口處、顱腔、胸腔和腹腔及其內(nèi)部臟器。應(yīng)重點觀察生殖系統(tǒng)的組織和器官，同時記錄著床數(shù)和黃體數(shù)。解剖當(dāng)天應(yīng)進行陰道涂片檢查，以確定發(fā)情周期的階段，并與雌性生殖器官的組織病理學(xué)進行相關(guān)性分析。.2所有成年雄性動物的睪丸和附睪，以及前列腺和精囊腺應(yīng)適當(dāng)去除任何附著的組織，并在解剖后盡快測量其濕重，以避免干燥。所有成年動物的卵巢、睪丸、附睪、附屬性器官，以及所有呈現(xiàn)肉眼異常的器官，都應(yīng)予以保存。.3應(yīng)將所有成年雄性和雌性以及每窩1只13天的雄性和雌性幼鼠的甲狀腺保存在合適的固定液中，以備后續(xù)組織病理學(xué)檢查。固定后可測定甲狀腺重量。在固定后仔細修剪附著組織，以避免組織損傷，組織損傷會影響組織病理學(xué)分析。血液樣本應(yīng)在動物安樂死之前采集，并在適當(dāng)?shù)臈l件下儲存。.4此外，應(yīng)在每組動物中隨機選取5只雌性和5只雄性動物，取出肝、腎、腎上腺、胸腺、脾、腦、心臟等臟器，仔細去除附著的組織，如可能，解剖后應(yīng)盡快稱濕重，以防水分丟失。下列臟器應(yīng)選用適宜的固定液保存，以便進行組織學(xué)檢查：所有肉眼可見異常的器官、腦（一般應(yīng)包括大腦、小腦和腦橋）、脊髓、胃、小腸和大腸（包括Peyer氏淋巴結(jié)）、肝、腎、腎上腺、脾、心臟、胸腺、甲狀腺、氣管和肺（先以固定液灌注再浸入固定液）、子宮、膀胱、淋巴結(jié)（最好取一個與染毒途徑有關(guān)的，以觀察染毒的直接影響，另取一個遠離染毒途徑的，以觀察系統(tǒng)毒性[16]）、周圍神經(jīng)（坐骨神經(jīng)或脛神經(jīng)，建議選擇近肌肉端）、一段骨髓（或一定量新鮮抽取的骨.5建議選用使用Bouin氏液或改良Davidson氏固定液[9][10][11]固定睪丸和附睪，不選用常規(guī)的福爾馬林溶液進行固定。根據(jù)臨床和其他所見還需檢查有關(guān)的組織，同時，根據(jù)已知的受試樣品特性，對其可能的靶器官也應(yīng)進行保存和檢查。.6下列組織可能提供有價值的內(nèi)分泌相關(guān)指標(biāo)的指征：性腺（卵巢和睪丸）、附屬性器官（包括宮頸、附睪、精囊腺等）、陰道、垂體、雄性乳腺和腎上腺。雄性乳腺的變化尚未得到充分的記錄，但這一參數(shù)可能對具有雌激素作用的物質(zhì)比較敏感。.7死亡的和出生后13天（或稍晚）被處死的仔鼠也應(yīng)仔細檢查外觀有無異常。應(yīng)特別注意檢查外生殖器官，以檢查發(fā)育異常的跡象。組織病理學(xué)檢查先對高劑量組和對照組動物的卵巢、睪丸、附睪進行詳細的組織學(xué)檢查（特別強調(diào)精子發(fā)生的階段和睪丸間質(zhì)的細胞結(jié)構(gòu)）。如果有必要，也可檢查保存的其他組織，包括幼鼠和成年動物的甲狀腺。固定后可測定甲狀腺重量。修剪要非常謹(jǐn)慎，并且應(yīng)該在固定后進行，以避免組織損傷。組織損傷可能會影響組織病理學(xué)分析。在高劑量組發(fā)現(xiàn)組織病理學(xué)改變時，就要對其他劑量組的動物進行檢查。應(yīng)對所有大體解剖檢查時發(fā)現(xiàn)異常的臟器或組織進行組織學(xué)檢查。如果將試驗結(jié)果用于確定NOAEL，則除最高劑量組外，還應(yīng)對其他各組動物的靶器官進行檢查，特別是被認(rèn)為是NOAEL的劑量組。如在試驗中設(shè)置了附加組，則也應(yīng)根據(jù)受試物劑量組中組織和器官的變化對附加組動物相應(yīng)的組織和器官進行組織病理學(xué)檢查。6試驗數(shù)據(jù)和報告6.1數(shù)據(jù)6.1.1應(yīng)提供每只動物的數(shù)據(jù)，并列表表示試驗結(jié)果。表中應(yīng)顯示實驗開始時每組的動物數(shù)、試驗中死亡或人道處死的動物數(shù)及時間、交配的動物數(shù)、受孕的動物數(shù)、出現(xiàn)毒性體征的動物數(shù)。詳細描述觀察到的毒性體征，包括出現(xiàn)的時間、持續(xù)時間和嚴(yán)重程度，病理組織學(xué)改變的類型和全部相關(guān)的仔鼠資料。將生殖/發(fā)育試驗結(jié)果按附錄A中匯總表的格式進行匯總，有益于評價生殖/發(fā)育毒性。6.1.2如可能，對屬于連續(xù)變量的檢測結(jié)果應(yīng)采用合適并被廣泛接受的方法進行統(tǒng)計分析，應(yīng)在試驗設(shè)計時確定所用的統(tǒng)計學(xué)方法。由于研究獲得的數(shù)據(jù)有限，“統(tǒng)計學(xué)意義”在對很多檢測終GB/Txxxxx—XXXX點，特別是生殖終點的判定，其參考價值有限。很多被廣泛使用的方法并不適合，特別是對集中趨勢進行參數(shù)檢驗的方法。如需要對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，應(yīng)根據(jù)數(shù)據(jù)的分布情況選用適合的統(tǒng)計學(xué)方法，而且應(yīng)該在試驗設(shè)計時就根據(jù)需要選定適合的統(tǒng)計學(xué)方法。6.2結(jié)果評價6.2.1受試樣品的毒性作用應(yīng)按試驗觀察、大體解剖和病理組織學(xué)的檢查結(jié)果進行評價，并根據(jù)受試樣品的劑量與下列異常情況及其嚴(yán)重程度之間是否存在劑量-反應(yīng)關(guān)系進行評價（如肉眼觀察到的大體損傷、確定的靶器官、不育、臨床表現(xiàn)異常、對生殖和幼仔生存的影響、體重變化、對死亡率及其他毒性作用的影響）。6.2.2由于雄性動物染毒時間較短，評價受試樣品對雄性動物生殖系統(tǒng)的影響時，不僅要考慮繁殖能力數(shù)據(jù)，還應(yīng)對行睪丸和附睪的組織病理學(xué)檢查進行綜合評價。生殖/發(fā)育的歷史資料（如窩的大小有助于對研究結(jié)果的解釋。6.2.3為了質(zhì)量控制，建議收集歷史控制數(shù)據(jù)，并計算數(shù)據(jù)變異系數(shù)，特別是與內(nèi)分泌干擾物檢測相關(guān)的參數(shù)。6.3試驗報告試驗報告應(yīng)包括以下內(nèi)容：6.3.1受試樣品a）來源、批號、使用期限（如可用）b）測試化學(xué)品的穩(wěn)定性（如已知）。6.3.2單一成分物質(zhì)a）物理性狀、水溶性和其他相關(guān)理化性質(zhì)；b）化學(xué)性質(zhì)，如IUPAC或CAS名稱、CAS編號、SMILES或InChI代碼、結(jié)構(gòu)式、純度、雜質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)。6.3.3多成分物質(zhì)、UVBCs和混合物：通過各組分的化學(xué)鑒定（見上文）、定量發(fā)生和相關(guān)理化性質(zhì)進行表征。6.3.4賦形劑如果使用的賦形劑不是水，則應(yīng)說明理由。6.3.5實驗動物a）種類、品系；b）數(shù)量調(diào)齡、性別；c）來源、飼養(yǎng)條件、飼料等；d）試驗開始每只動物體重。如不是嚙齒類，說明原因。6.3.6試驗條件a）劑量水平選擇的理由；b）受試樣品配比/飼料制備以及應(yīng)用濃度和穩(wěn)定性、均勻性的詳細資料；c）受試樣品染毒方式的詳細資料；d）如摻入飼料或飲用水，飼料或飲用水中受試樣品的含量換算成實際劑量（mg/kg?de）飼料和飲水質(zhì)量的詳細資料。f）詳細說明選擇幼崽進行剔除（如果被剔除）的隨機程序。6.3.7結(jié)果a）體重/體重變化；b）飼料（或飲水）消耗量（如需要GB/Txxxxx—XXXXc）按性別和劑量組分別記錄的毒性反應(yīng)，包括繁殖力、妊娠和其他的毒性癥狀；d）孕期持續(xù)時間；e）毒性或?qū)ι场⒆哟统錾笊L情況等的其他影響；f）毒性作用的癥狀和表現(xiàn)、嚴(yán)重程度和持續(xù)時間（是否可逆g）感覺、抓力和活動度評價；h）血液學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果（包括相關(guān)基線值i）臨床生化指標(biāo)檢測結(jié)果（包括相關(guān)基線值j）活仔數(shù)和著床后的丟失數(shù)；k）肉眼可見明顯畸形和低體重仔鼠數(shù)；1）試驗中動物死亡時間或存活至試驗結(jié)束的動物數(shù)；m）著床數(shù)、黃體數(shù)（推薦）、每窩仔鼠的多少及重量；n）親代動物處死時體重和臟器重量；o）尸檢所見；p）詳細的組織學(xué)檢查結(jié)果；q）吸收胎數(shù)據(jù)（如可得r）統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果（如有）。6.3.8結(jié)果討論6.3.9結(jié)論6.4結(jié)果解釋本試驗可評價動物在多次接觸某一受試樣品后所引起的生殖/發(fā)育毒性作用。由于本試驗既觀察一般毒性也關(guān)注生殖/發(fā)育毒性，因此可以區(qū)分對親代在無一般毒性情況下出現(xiàn)的生殖/發(fā)育毒性效應(yīng)，和在某劑量水平對親代動物造成損害時的生殖/發(fā)育毒性效應(yīng)，可作為判定是否需要進一步研究及其試驗設(shè)計的依據(jù)。GB/Txxxxx—XXXX（規(guī)范性附錄）生殖／生長發(fā)育試驗結(jié)果匯總觀察值用量（單位）對照組劑量1劑量2劑量3...起始配對數(shù)（N）發(fā)情周期（至少不規(guī)則周期的平均長度和頻率）有交配跡象的雌性（N）成功懷孕的雌性（N）懷孕第1-5天（N）懷孕第6天（N）懷孕第21天（N）懷孕第22天（N）妊娠第23天（N）有活產(chǎn)幼崽的母鼠（N）第4天幼崽存活的母鼠（N）著床/母鼠（均值）出生時活仔數(shù)（均值）第4天的活仔數(shù)（均值）出生性別比（m/f均值）第4天性別比（m/f均值）出生時窩重（均值）第4天產(chǎn)仔重（均值）出生體重（均值）測量AGD時體重（男性平均值，女性平均值）出生后第4天同日的平均年齡（平均男性，平均女性，注PND）第4天體重（均值）仔鼠乳頭保留第13天（均值）第13天體重（均值）異常的仔鼠0個仔鼠的母鼠數(shù)1個仔鼠的母數(shù)數(shù)≥2個仔鼠的母鼠數(shù)子代的丟失產(chǎn)前/著床后（著床減去活產(chǎn)）雌性為0雌性有1個雌性有2個雌性有≥3個產(chǎn)后（活產(chǎn)減去產(chǎn)后第13天的活產(chǎn)）雌性為0雌性有1個GB/Txxxxx—XXXX雌性有2個雌性有≥3個GB/Txxxxx—XXXX（規(guī)范性附錄）最長試驗周期（交配期為14d）的生殖/發(fā)育試驗流程GB/Txxxxx—XXXX參考文獻[1]GoldmanJ.M.,MurrA.S.,BuckalewA.R.,FerrellJ.M.andCooperR.L.(2007).TheRodentEstrousCycle:CharacterizationofVaginalCy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