12-分子生物學(xué)研究方法第十二章分子生物學(xué)研究方法212-分子生物學(xué)研究方法SNP概述單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)：單個核苷酸的突變而引起的多態(tài)性。單體型(Haplotype)：染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)被稱作單體型。相鄰SNPs的等位位點(diǎn)傾向于以一個整體信息傳遞給后代。312-分子生物學(xué)研究方法SNP分類：基因編碼區(qū)SNP(cSNP)：同義cSNP：SNP導(dǎo)致的編碼序列改變并不影響蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基和未突變堿基含義相同。非同義cSNP：堿基改變使蛋白質(zhì)序列發(fā)生變化，從而影響蛋白質(zhì)的功能。常是生物性狀發(fā)生改變的直接原因?；蛘{(diào)控區(qū)SNP(pSNP)：影響基因表達(dá)量的多少?；蜷g隨機(jī)非編碼區(qū)(rSNP)：cSNP、pSNP在功能和疾病發(fā)生、發(fā)展方面具有更重要的意義。412-分子生物學(xué)研究方法SNP檢測技術(shù)基因芯片、Taqman技術(shù)、分子信標(biāo)、焦磷酸測序。Taqman技術(shù)原理：探針設(shè)計(jì)上，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)換(FRET)技術(shù)，探針5'和3'端分別用特殊的染料標(biāo)記，稱為供體-受體染料對或引爆-猝滅染料對。正常情況下，由于探針5'端熒光基團(tuán)和3'端猝滅基團(tuán)緊鄰在一起，供體所發(fā)熒光由于其光譜在空間上接近受體染料而被猝滅，只有當(dāng)兩者分離時(shí)才能檢測到供體所發(fā)出的熒光。512-分子生物學(xué)研究方法612-分子生物學(xué)研究方法Taqman技術(shù)的基本原理是利用Taq酶的5'核酸外切酶活性，PCR反應(yīng)中除了兩個傳統(tǒng)的PCR引物P1、P2外，還有第三個引物P3(等位特異性Taqman探針)，含有待檢測的SNP位點(diǎn)，特異結(jié)合在P1結(jié)合位點(diǎn)的下游。P3探針的5'端和3'端分別標(biāo)有熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，因P3的3'端被猝滅基團(tuán)封阻而不能以自身為引物進(jìn)行擴(kuò)增。712-分子生物學(xué)研究方法PCR反應(yīng)中，Taq酶以P1為引物合成新的DNA鏈，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，Taq酶接觸到P3并激發(fā)其5→3外切酶活性，使P3從5端開始降解，最后DNA鏈得以延伸，而P3探針上的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)由于不再在一個分子上，熒光基團(tuán)釋放而發(fā)出熒光信號。812-分子生物學(xué)研究方法焦磷酸測序法：核心：由四種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)反應(yīng)。四種酶：DNA聚合酶(DNApolymerase)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase)、熒光素酶(luciferase)、雙磷酸酶(apyrase)。底物：5’-磷酰硫酸(adenosine5’-phosphosulfate,APS)、熒光素(luciferin)。912-分子生物學(xué)研究方法每輪測序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，如果該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)(PPi)，PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個峰值，每個峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比，然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。1012-分子生物學(xué)研究方法第一步：1個特異性的測序引物和單鏈DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物(DNAPolymerase、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶)和底物混合物(5’-磷酰硫酸APS和熒光素Luciferin)。1112-分子生物學(xué)研究方法第二步：向反應(yīng)體系中加入1種dNTP，如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3'末端，同時(shí)釋放出一個分子的焦磷酸(PPi)。1212-分子生物學(xué)研究方法第三步：在ATP硫酸化酶作用下，生成的PPi與APS結(jié)合形成ATP。在熒光素酶催化下，生成的ATP又與熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光。通過CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。1312-分子生物學(xué)研究方法第四步：反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在雙磷酸酶的作用下發(fā)生降解。1412-分子生物學(xué)研究方法第五步：加入另一種dNTP，使第2－4步反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。1512-分子生物學(xué)研究方法1612-分子生物學(xué)研究方法SNP應(yīng)用人類基因單體型圖的繪制。SNP與疾病易感基因的相關(guān)性分析。指導(dǎo)用藥與藥物設(shè)計(jì)。1712-分子生物學(xué)研究方法cDNA差示分析法克隆基因——RDA代表性差異分析(representationaldifferenceanalysis,RDA)：RDA充分發(fā)揮了PCR以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈DNA模板而以線性形式擴(kuò)增單鏈模板的特性，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴(kuò)增目的基因片段。1812-分子生物學(xué)研究方法因試驗(yàn)對象(Tester)和供試探針(Driver)在接受差示分析前均經(jīng)一個4堿基切割酶處理，形成平均長度256bp的代表群(representation)，保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。每次T減D反應(yīng)中兩者物質(zhì)的量比要求達(dá)到1:100或更高，經(jīng)2-3次重復(fù)，T群體非特異性序列幾乎沒有偶然逃脫的可能性。1912-分子生物學(xué)研究方法2012-分子生物學(xué)研究方法使用Gateway?技術(shù)進(jìn)行克隆和表達(dá)一切皆有可能2112-分子生物學(xué)研究方法通過TOPO反應(yīng)將目的基因PCR產(chǎn)物連接到Entry載體中。2212-分子生物學(xué)研究方法LR反應(yīng)可將目的片段從Entry載體重組到表達(dá)載體中。Entry載體上基因兩端具有attL1和attL2位點(diǎn)，目的載體中含有attR1和attR2位點(diǎn)，通過重組形成新的位點(diǎn)attB1和attB2，從而將目的基因亞克隆到表達(dá)載體中。2312-分子生物學(xué)研究方法

雙向電泳等電聚焦：蛋白質(zhì)在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳。蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點(diǎn)的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場中移動，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點(diǎn)位置時(shí)，其凈電荷數(shù)為零，在電場中不移動，據(jù)此將蛋白質(zhì)分離。SDS-聚丙烯酰胺：分子質(zhì)量2412-分子生物學(xué)研究方法2512-分子生物學(xué)研究方法2612-分子生物學(xué)研究方法2712-分子生物學(xué)研究方法2812-分子生物學(xué)研究方法2912-分子生物學(xué)研究方法3012-分子生物學(xué)研究方法3112-分子生物學(xué)研究方法生物學(xué)問題的提出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對照組樣品的制備蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點(diǎn)的切取胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證（westernblot等）蛋白信息的初步獲得3212-分子生物學(xué)研究方法蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析技術(shù)基質(zhì)輔助激光解析電離：飛行質(zhì)譜儀(MALDI-TOF)。電噴霧質(zhì)譜ESI-MS：3312-分子生物學(xué)研究方法從2D膠中分離得到的或其它來源的蛋白質(zhì)，酶解成小肽后與基質(zhì)混合，將樣品混合物點(diǎn)到金屬靶表面上并使之干燥結(jié)晶，然后用激光轟擊，將呈離子化氣體的待分析物從靶表面噴射出去。離子化的氣體中每個分子帶有一個或更多的正電荷，這些氣體肽段在電場中被加速后，到達(dá)檢測器的時(shí)間由肽段的質(zhì)量和其所帶電荷數(shù)的比值(m/z)決定。3412-分子生物學(xué)研究方法3512-分子生物學(xué)研究方法生物質(zhì)譜的一般流程：蛋白酶解成肽段。肽段分離。離子進(jìn)入質(zhì)譜，得到質(zhì)譜圖。用計(jì)算機(jī)軟件將質(zhì)譜圖與蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，從而鑒定出蛋白。3612-分子生物學(xué)研究方法3712-分子生物學(xué)研究方法3812-分子生物學(xué)研究方法基因表達(dá)系列分析技術(shù)基因表達(dá)系列分析(Serialanalysisofgeneexpression,SAGE)是以DNA序列測定為基礎(chǔ)，定量分析全基因組表達(dá)模式的技術(shù)，能夠直接讀出任何一種細(xì)胞類型或組織的基因表達(dá)信息。LongSAGE；ShortSAGE。3912-分子生物學(xué)研究方法在轉(zhuǎn)錄組水平上，任何長度超過9-10個堿基的核苷酸片段都可能代表一種特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。因此，用特定限制性核酸內(nèi)切酶分離轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中具有基因特異性的9-10個堿基的核苷酸序列并制成標(biāo)簽。將這些序列標(biāo)簽連接、克隆、測序后，根據(jù)其占總標(biāo)簽數(shù)的比例即可分析其對應(yīng)編碼基因的表達(dá)頻率。4012-分子生物學(xué)研究方法4112-分子生物學(xué)研究方法4212-分子生物學(xué)研究方法原位雜交技術(shù)(insituhybridization,ISH)是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細(xì)胞、間期核及染色體上對核酸進(jìn)行定位或相對定量研究的一種手段。分為RNA原位雜交和染色體原位雜交。4312-分子生物學(xué)研究方法RNA原位雜交：用放射性或非放射性(地高辛、生物素等)標(biāo)記的特異性探針與被固定的組織切片反應(yīng)，若細(xì)胞中存在與探針互補(bǔ)的mRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈RNA，就可通過檢測放射性標(biāo)記或酶促免疫反應(yīng)顯色，對該基因的表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞水平上做出定性定量分析。4412-分子生物學(xué)研究方法熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)：首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標(biāo)記，然后用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結(jié)合，再通過與熒光素分子相偶聯(lián)的單克隆抗體來確定該DNA序列在染色體上的位置。FISH技術(shù)不需要放射性同位素，實(shí)驗(yàn)周期短，檢測靈敏度高。4512-分子生物學(xué)研究方法按標(biāo)記物不同又可分為直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法。用生物素(biotin)或地高辛配體(digoxingenin)標(biāo)記稱為間接標(biāo)記，雜交后需要通過免疫熒光抗體檢測方能看到熒光信號，因而步驟較多、操作麻煩，其優(yōu)點(diǎn)是在信號較弱或較小時(shí)可經(jīng)抗原抗體反應(yīng)擴(kuò)大，需進(jìn)行染色體定位的基因片段往往較小，因而間接標(biāo)記具有其優(yōu)勢。4612-分子生物學(xué)研究方法直接用熒光素標(biāo)記DNA的方法稱為直接標(biāo)記。由于直接標(biāo)記的探針雜交后可馬上觀察到熒光信號，省去了繁瑣的免疫熒光反應(yīng)，不再需要購買熒光抗體，也由于近年來熒光素的亮度和抗淬滅性的不斷改進(jìn)和提高，直接標(biāo)記的熒光探針越來越成為首選，其熒光強(qiáng)度和信號大小都易于在普通熒光顯微鏡下觀察，操作過程中也不需要嚴(yán)格避光，使FISH過程變得簡便而易于操作。缺點(diǎn)是信號不能放大。4712-分子生物學(xué)研究方法4812-分子生物學(xué)研究方法4912-分子生物學(xué)研究方法5012-分子生物學(xué)研究方法基因定點(diǎn)突變技術(shù)重疊延伸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變：大引物誘變法：重疊延伸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變：使用帶突變堿基的互補(bǔ)引物對兩段目的基因序列分別進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行重疊退火延伸，獲得帶突變堿基的完整序列。使用該完整序列的兩端引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。5112-分子生物學(xué)研究方法5212-分子生物學(xué)研究方法大引物誘變法：將所使用的引物之一進(jìn)行定點(diǎn)堿基突變后，作第一輪PCR擴(kuò)增。將第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物作為第二輪PCR擴(kuò)增的引物來使用，從而使第二輪擴(kuò)增的產(chǎn)物帶突變的堿基。5312-分子生物學(xué)研究方法PCR1使用正向誘變引物(M)和反向引物(R1)擴(kuò)增產(chǎn)生雙鏈大引物，退火與野生型基因復(fù)性，第二輪PCR時(shí)第二種退火產(chǎn)物可以延伸，再用正向引物(F2)擴(kuò)增產(chǎn)生帶有突變的雙鏈DNA，F(xiàn)2的退火溫度明顯高于第一輪PCR所使用的引物M和R1，可以忽略引物M和R1所造成的干擾。5412-分子生物學(xué)研究方法5512-分子生物學(xué)研究方法酵母單雜交系統(tǒng)(yeastone-hybridsystem)是二十世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的技術(shù)，常用于研究DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用。其特點(diǎn)是可識別穩(wěn)定結(jié)合于DNA上的蛋白質(zhì)，可在酵母細(xì)胞內(nèi)研究真核生物中DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用，并通過篩選DNA文庫直接獲得與靶序列相互作用蛋白的編碼基因。此外，該體系也是分析鑒定細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與順式作用元件相互作用的有效方法。5612-分子生物學(xué)研究方法將已知的特定順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動子(minimalpromoter,Pmin)上游，把報(bào)告基因連接到Pmin下游，然后將編碼待檢測轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)融合表達(dá)載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活Pmin啟動子，使報(bào)告基因得到表達(dá)。5712-分子生物學(xué)研究方法5812-分子生物學(xué)研究方法酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeasttwo-hybridsystem)原理：真核生物的轉(zhuǎn)錄因子大多是由兩個結(jié)構(gòu)上分開、功能上獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成的，即由DNA結(jié)合域(BD)和轉(zhuǎn)錄激活域(AD)構(gòu)成。單獨(dú)的BD能與特定基因地啟動區(qū)結(jié)合，但不能激活基因的轉(zhuǎn)錄，而由不同轉(zhuǎn)錄因子的BD和AD所形成的融合蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。5912-分子生物學(xué)研究方法實(shí)驗(yàn)方法：首先利用基因重組技術(shù)將編碼已知蛋白的DNA序列連接到帶有酵母轉(zhuǎn)錄因子BD編碼區(qū)的表達(dá)載體上。導(dǎo)入酵母細(xì)胞中，使之表達(dá)帶有BD的融合蛋白，與報(bào)告基因上游的啟動調(diào)控區(qū)相結(jié)合，準(zhǔn)備作為“誘餌”捕獲與已知蛋白相互作用的基因產(chǎn)物。將AD的DNA與待篩選的cDNA文庫中不同插入片段相連接，獲得“獵物”載體，轉(zhuǎn)化含有“誘餌”的酵母細(xì)胞。6012-分子生物學(xué)研究方法實(shí)驗(yàn)方法：一旦酵母細(xì)胞中表達(dá)的“誘餌”蛋白與“獵物”載體中表達(dá)的某個蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的AD和BD結(jié)構(gòu)域就會被牽引靠攏，激活報(bào)告基因表達(dá)。分離有報(bào)告基因活性的酵母細(xì)胞，得到所需要的“獵物”載體，獲得與已知蛋白相互作用的新基因。6112-分子生物學(xué)研究方法6212-分子生物學(xué)研究方法6312-分子生物學(xué)研究方法6412-分子生物學(xué)研究方法Farwestern-體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)6512-分子生物學(xué)研究方法6612-分子生物學(xué)研究方法6712-分子生物學(xué)研究方法CFP(青色熒光蛋白)的發(fā)射光譜與YFP(黃色熒光蛋白)的吸收光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B，當(dāng)它們足夠接近時(shí)，用CFP的吸收波長激發(fā)，CFP的發(fā)色基團(tuán)將會把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至YFP的發(fā)色基團(tuán)上，引起CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是YFP的熒光。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究-熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FRET)6812-分子生物學(xué)研究方法用CFP吸收波長440nm作為激發(fā)波長，實(shí)驗(yàn)靈巧設(shè)計(jì)，使當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與b沒有發(fā)生相互作用時(shí)，CFP與YFP相距很遠(yuǎn)不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，因而檢測到的是CFP的發(fā)射波長為480nm的熒光。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與b發(fā)生相互作用時(shí)，由于蛋白質(zhì)b受蛋白質(zhì)a作用而發(fā)生構(gòu)象變化，使CFP與YFP充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時(shí)檢測到的就是YFP的發(fā)射波長為527nm的熒光。6912-分子生物學(xué)研究方法2000年，RNA的研究進(jìn)展被美國《科學(xué)》雜志評為重大科技突破；2001年“RNA干擾”作為當(dāng)年最重要的科學(xué)研究成果之一，再次入選“十大科技突破”；2002年12月20日，Science雜志將“SmallRNA&RNAi”評為2002年度最耀眼的明星。同時(shí)，Nature雜志亦將SmallRNA評為年度重大科技成功之一。2003年，小核糖核酸的研究第四次入選“十大科技突破”，排在第四位。RNA研究的突破性進(jìn)展，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域近20年來，可與HGP（人類基因組計(jì)劃，生物通網(wǎng)站注）相提并論的最重大成果之一。7012-分子生物學(xué)研究方法RNAi(RNAinterference,RNA)技術(shù)RNA干擾廣泛存在于植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴乃至人類的幾乎所有真核生物中，大腸桿菌中也存在RNA干擾現(xiàn)象。雙鏈小分子RNA可高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA，阻斷靶基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型，這種現(xiàn)象稱為RNA干擾(RNAi)。這些雙鏈小RNA稱siRNA(Small/shortinterferingRNA,siRNA)。引發(fā)RNAi的雙鏈RNA長度必須在30nt以上，具有5'-P、3'-OH基團(tuán)，且3'端有兩個突出的堿基。7112-分子生物學(xué)研究方法7212-分子生物學(xué)研究方法miRNA研究發(fā)現(xiàn)miRNA的主要功能是調(diào)節(jié)生物體內(nèi)在的與機(jī)體生長、發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關(guān)的基因的表達(dá)，而且研究人員推測這種小分子調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因7312-分子生物學(xué)研究方法MicroRNA也可以寫做miRNA，是一種21－25nt長的單鏈小分子RNA。它廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，其本身不具有開放閱讀框（ORF）。成熟的miRNA，5′端有一個磷酸基團(tuán)，3′端為羥基。7412-分子生物學(xué)研究方法編碼miRNAs的基因最初產(chǎn)生一個長的pri-RNA分子，這種初期分子還必須被剪切成約70-90個堿基大小、具發(fā)夾結(jié)構(gòu)單鏈RNA前體（pre-miRNA）并經(jīng)過Dicer酶加工后生成。7512-分子生物學(xué)研究方法7612-分子生物學(xué)研究方法MiRNA的作用方式miRNA基因是一類高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分為兩種：第一種以線蟲lin-4為代表，作用時(shí)與靶標(biāo)基因不完全互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而抑制翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性（不改變mRNA豐度），這種miRNA是目前發(fā)現(xiàn)最多的種類；第二種以擬南芥miR-171為代表，作用時(shí)與靶標(biāo)基因完全互補(bǔ)結(jié)合，作用方式和功能與siRNA非常類似，最后切割靶mRNA；7712-分子生物學(xué)研究方法MiRNA的特異性

研究表明MiRNAs在物種間具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性——在特定的時(shí)間、組織才會表達(dá)。擬南芥中的miR-171僅在其花序中高水平表達(dá)，在某些組織低水平表達(dá)，在莖、葉等組織中卻無任何表達(dá)的跡象；20-24h的果蠅胚胎提取物中可發(fā)現(xiàn)miR-12，卻找不到miR3-miR6，在成年果蠅中表達(dá)的miR-1和let-7也無法在果蠅胚胎中表達(dá)。MiRNA表達(dá)的時(shí)序性和組織特異性暗示miRNA的分布可能決定組織和細(xì)胞的功能特異性，也可能參與了復(fù)雜的基因調(diào)控，對組織的發(fā)育起重要作用。7812-分子生物學(xué)研究方法相同點(diǎn)：MiRNA和siRNA都是由22個左右的核苷組成；它們都是Dicer酶的產(chǎn)物；它們都會和RISC復(fù)合體結(jié)合；它們都可以抑制靶標(biāo)基因的翻譯；7912-分子生物學(xué)研究方法兩者之間的主要差異：起源階段SiRNA：通常是外源的，如病毒感染和人工插入的dsRNA被剪切后產(chǎn)生外源基因進(jìn)入細(xì)胞（注：病毒入侵，或者是自身合成RNA中出現(xiàn)錯誤，細(xì)胞內(nèi)就會產(chǎn)生雙鏈RNA，來阻止這些異?；虻谋磉_(dá)）。MiRNA：是內(nèi)源性的，是一種非編碼的RNA；由miRNA基因表達(dá)出最初的pri-miRNA分子。8012-分子生物學(xué)研究方法成熟過程SiRNA：直接來源是長鏈的dsRNA（通常為外源）；經(jīng)過Dicer酶*切割形成雙鏈siRNA,而且每個前體dsRNA能夠被切割成不定數(shù)量的siRNA片段。MiRNA：在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄的較大的pri-miRNA經(jīng)由Drosha(一種RNAseⅢ酶)加工成為單鏈pre-miRNA；接著，發(fā)夾狀、部分互補(bǔ)的pre-miRNA在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer*（一種RNAseⅢ酶）酶切割形成miRNA；在生物體中的表達(dá)具有時(shí)序性、保守性和組織特異性。8112-分子生物學(xué)研究方法功能階段miRNA可抑制靶標(biāo)基因的翻譯，也可導(dǎo)致靶標(biāo)基因降解，即在轉(zhuǎn)錄水平后和翻譯水平起作用；而siRNA只能導(dǎo)致靶標(biāo)基因的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控；8212-分子生物學(xué)研究方法凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)是體外分析DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。原理：在凝膠電泳中