ICST/CI×××—2024

CCS

團體標準

T/CIXXX—2024

船舶壓載水管理系統(tǒng)生物滅活有效

性檢測規(guī)程

Codefortestingtheeffectivenessofbiologicalinactivationinship

ballastwatermanagementsystems

（征求意見稿）

2024-X-X發(fā)布2024-X-X實施

中國國際科技1促進會發(fā)布

T/CI×××—2024

船舶壓載水管理系統(tǒng)生物滅活有效性檢測規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了船舶壓載水管理系統(tǒng)生物滅活性能的采樣規(guī)程、L型和S型存活生物指示性

檢測規(guī)程和詳細檢測方法、菌落總數(shù)檢測規(guī)程、耐熱大腸桿菌檢測規(guī)程、大腸埃希氏菌檢測

規(guī)程、腸球菌檢測規(guī)程和有毒霍亂弧菌檢測規(guī)程。本文件適用于船舶壓載水管理系統(tǒng)生物滅

活性能的檢測與評估。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB5750.12-2023生活飲用水標準檢驗方法微生物指標

GB19489-2008實驗室生物安全通用要求

GB4789.38-2012食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌計數(shù)

GB17378.7海洋監(jiān)測規(guī)范第7部分：近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測檢測方法

GB/T12763海洋調(diào)查規(guī)范第6部分：海洋生物調(diào)查

ASTMD5392-2014用兩步膜濾法分離和計數(shù)水中大腸桿菌的標準試驗方法

JT/T1393-2021船舶壓載水指示性分析取樣與檢測要求

SN/T1239-2015國境口岸霍亂檢驗規(guī)程

HJ1215-2021水質(zhì)浮游植物的測定濾膜顯微鏡計數(shù)法

國際海事組織2004《國際船舶壓載水和沉積物管理與控制公約》（以下簡稱壓載水公

約）

國際海事組織BWM.2/Circ.70《船舶壓載水管理系統(tǒng)調(diào)試測試指南》

國際海事組織MEPC,173(58)《G2導則船舶壓載水取樣導則》

國際海事組織MEPC74/INF.18《在船舶壓載水中指示性檢測有毒有害海洋生物可用設備

總結》

美國國家衛(wèi)生基金會認證EPA/600/R-10/146《壓載水處理技術驗證通用協(xié)議》

1

T/CI×××—2024

ISO6222-1999水質(zhì)可培養(yǎng)微生物的計數(shù)方法營養(yǎng)瓊脂介質(zhì)中接種法進行群落計數(shù)

法

ISO9308-1-2014水質(zhì)—大腸埃希氏菌和大腸菌群計數(shù)——第一部分低細菌背景區(qū)系

水的膜過濾法

ISO7899-2-2000水質(zhì)—腸球菌的檢測和計數(shù)第2部分：膜過濾法

ISO8199-1988水質(zhì)—微生物培養(yǎng)計數(shù)通用指南

ISO5667-3-2012水質(zhì)—取樣—第三部分：水樣的處理與保存

3術語和定義

SN/T1239界定的術語和定義適用于本文件，下列術語和定義適用于本標準。

3.1

船舶壓載水Ballastwater

為保持船舶具有一定吃水深度或調(diào)整船體平衡，以便保證船舶航行安全平穩(wěn)，而需泵入

艙內(nèi)、在裝貨時再自艙內(nèi)排出的水體。

3.2

壓載水管理系統(tǒng)Ballastwatermanagementsystem

用于清除、殺死壓載水中的生物或(在排放前)使其失去活性的預制、商用處理系統(tǒng)。供

應商壓載水處理產(chǎn)品的整體將用于實現(xiàn)供應商對處理效果或運行性能的主張，并以集成的方

式包括所有組件。

3.3

處理水Treatedballastwater

壓載水管理系統(tǒng)處理后排出的水。

3.4

環(huán)境水Ambientwater

在測試時提供給處理系統(tǒng)的水。環(huán)境水須在特定的生物密度范圍和水質(zhì)參數(shù)內(nèi)，用于評

定處理設備全面運行條件下的效能。

3.5

等動力取樣Isokineticsamplecollection

從取樣口收集樣品的水流速度與主壓載管中的速度相對等的取樣方式。

2

T/CI×××—2024

3.6

存活生物Viableorganisms

存活生物為有機體和活著的所有生命階段，本標準中僅指浮游生物。

3.6.1L型存活生物

是指最小尺寸≥50μm的浮游動物。

3.6.2S型存活生物

是指最小尺寸＜50μm且≥10μm的浮游生物。

3.7

浮游生物Plankton

懸浮于水中，體型微小，無運動能力或游動能力很弱，不能主動做長距離運動，只能被

動地“隨波逐流”，主要包括浮游植物與浮游動物。

3.8

最小尺寸Minimumsize

基于《壓載水公約》的描述，特指浮游生物的體長、體寬和體高中最小的尺寸，浮游生

物的身體長度、寬度和高度則是通過測量最大的部分來確定的。

L型存活生物的最小尺寸：浮游動物的剛毛、刺、觸須等不包括在內(nèi)，L型存活生物的

最小尺寸為生物的體寬部分如下圖所示。

圖1L型浮游生物最小尺寸的測定（需畫平行線顯示體長）

S型存活生物的最小尺寸：以單個細胞或單個體的體寬為最小尺寸，如下圖所示。

3

T/CI×××—2024

圖2S型浮游生物的最小尺寸示意圖

3.9

脈沖-振幅-調(diào)制Pulse-Amplitude-Modulation（PAM）葉綠素熒光檢測法

通過發(fā)射一系列微弱的光，脈沖誘導藻類細胞內(nèi)葉綠素發(fā)出熒光（F0）而不進行光合作

用，之后以快速強光脈沖關閉所有光合細胞的電子門暫時抑制光合作用，從而使葉綠素熒光

達到最大(Fm)，可變熒光Fv=Fm-F0，根據(jù)Fm和F0可以計算出光合系統(tǒng)PSII的最大量子產(chǎn)量

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm，它反映了浮游植物的潛在最大光合能力，即藻類的生理狀態(tài)。基于這種方

法可用來指示性檢測最小尺寸≥10μm且＜50μm（S型）浮游植物的活體數(shù)量。

3.10

活性熒光檢測法Activefluorescence

是將一定波長的光照射到活的藻類細胞上后得到的活細胞中的葉綠素熒光信號，基于這

種方法可用來指示性檢測最小尺寸≥10μm且＜50μm（S型）浮游植物的數(shù)量。

3.11

三磷酸腺苷Adenosinetriphosphate(ATP)熒光檢測法

在熒光素酶E（luciferase）和Mg2+的作用下，熒光素LH2（luciferin）與ATP發(fā)生腺

苷酰化被活化，活化后的熒光素LH2與熒光素酶E相結合，形成了熒光素—AMP復合體，并

放出焦磷酸（PPi）。該復合體被分子氧氧化，形成激發(fā)態(tài)復合物P*-E·AMP，放出CO2，當

該復合物從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時發(fā)射光，并最終形成氧化蟲熒光素P和AMP，其強度與生物密

度正相關，基于這種方法可用來指示性檢測最小尺寸≥50μm（L型）浮游生物，最小尺寸

≥10μm且＜50μm（S型）浮游生物的數(shù)量。

3.12

運動和熒光軌跡Motilityandfluorescenceassay（MFA）檢測法

4

T/CI×××—2024

根據(jù)浮游動物運動軌跡成像后進行智能計數(shù)，結合浮游植物自發(fā)熒光進行檢測，基于這

種方法來示性檢測最小尺寸≥50μm（L型）存活生物，最小尺寸≥10μm且＜50μm（S

型）存活生物的數(shù)量。

3.13

指標性微生物Indicatorbacteria

用以指示船舶壓載水衛(wèi)生狀況及安全性的指示性微生物，主要包括菌落總數(shù)、耐熱大腸

菌群、大腸埃希氏菌、腸球菌和有毒霍亂弧菌（O1和O139）。

3.14

菌落總數(shù)Aerobicplatecount

壓載水樣品經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間等）培養(yǎng)后，所

得每mL檢樣中形成的菌落總數(shù)。

3.15

耐熱大腸菌群Fecalcoliforms

是指在44.5℃下培養(yǎng)24～48h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無

芽胞桿菌。

3.16

大腸埃希氏菌Escherichiacoli

又稱大腸桿菌，是廣泛存在于人和溫血動物的腸道中，需氧及兼性厭氧，44.5℃生長，

IMViC（靛基質(zhì)、甲基紅、VP實驗、檸檬酸鹽）生化試驗++--或-+--的革蘭氏陰性桿菌。

3.17

腸球菌Intestinalenterococci

一類革蘭氏陽性球菌，兼性厭氧，無芽胞和莢膜，可分解膽汁七葉苷，是評估食品、水、

食品加工設備、食品生產(chǎn)環(huán)境等衛(wèi)生狀況的指標菌之一。

3.18

有毒霍亂弧菌ToxicogenicVibriocholerae

革蘭氏陰性菌，菌體短小呈逗點狀，有單鞭毛、菌毛，部分有莢膜，共分為139個血清

群，其中O1群和O139群可引起霍亂。

5

T/CI×××—2024

4船舶壓載水管理系統(tǒng)生物滅活性能檢測采樣規(guī)程

4.1取樣信息收集

樣品采集前應與船方或壓載水設備生產(chǎn)商充分了解壓載水管理系統(tǒng)型號與安裝信息，如

設備主管道是否有專用取樣口，取樣口的位置、直徑大小及類型，設備操作限制參數(shù)等，相

關信息見附錄A-1/A-2/A-3。

4.2取樣方案制定

根據(jù)船舶和設備基本信息，制定測試方案，其內(nèi)容至少包括：檢測時間、登輪地點、試

航線路、試航時間、返回停靠的港口、測試艙位（標明處理艙及對照艙）、壓載水處理設備

類型及安裝位置、檢測項目、取樣方式、檢測方法、計劃參與取樣和檢測的人員等，并填寫

附錄A-1/A-2/A-3/A-4相關信息。

4.3取樣設備性能要求

4.3.1主要取樣器具組成

壓載水取樣設備應包括管路連接單元、過濾與計量單元、樣品收集單元。

4.3.2主要取樣器具要求

取樣管路閥門建議使用隔膜閥，避免因調(diào)節(jié)流速而造成生物死亡，管路連接單元包含取

樣探頭與連接軟管；過濾與計量單元包含過濾裝置與流速流量監(jiān)控裝置，流量計需定期計量

和期間核查。

4.3.3濾網(wǎng)要求

取樣設備應根據(jù)需要能對最小尺寸≥50μm存活生物（L型）樣品進行收集，取樣設備

中所有接觸或接近壓載管路的部件應具備防腐蝕性，過濾裝置濾網(wǎng)或濾膜孔徑對角線直徑應

達到50μm，網(wǎng)孔孔徑需定期進行計量和期間核查，每次取樣后濾網(wǎng)和管路需清洗干凈，

并進行紫外滅菌20min。

4.4主要取樣耗材

4.4.1樣品袋：5L

4.4.2水樣瓶：1000mL

4.4.3無菌取水袋：500mL

4.4.4棕色玻璃瓶：250mL

4.4.5鹽度計精度1‰

6

T/CI×××—2024

4.4.6溫度計精度0.1℃

4.4.7潛水泵

4.5登輪取樣前準備工作

4.5.1應與代理人員或船方人員或設備商調(diào)試工程師溝通，了解船舶運行情況，壓載水壓載

與卸載情況，壓載水處理系統(tǒng)運行情況，確保船上設備及安全防護措施運作正常，按照要求

填寫附錄A-1/A-2/A-3船舶信息，壓載水信息，壓載水設備信息。

4.5.2加強與碼頭經(jīng)營部門的聯(lián)系，在作業(yè)現(xiàn)場發(fā)出安全指令后方可登輪進入作業(yè)現(xiàn)場。

4.5.3取樣作業(yè)人數(shù)至少2人，取樣人員應按照要求穿戴好防護裝備，穿戴整齊后方可進入

作業(yè)現(xiàn)場，如：安全繩、救生圈、防墜器、安全帽、護目鏡、勞保手套、聽力護具、防護鞋、

登輪服。

4.5.4進入特殊區(qū)域取樣時，宜參考相關國際公約的要求。

4.6樣品采集

取樣人員在排放點附近的排放管上進行壓載水取樣。遇不能從排放管取樣的情況下，可

采用通過測深管、人孔和排水口等方式進行取樣。

4.6.1壓載水管理系統(tǒng)主管路取樣

4.6.1.1處理水取樣時需與船方或設備調(diào)試工程師確認處理水艙位以及處理時間是否已經(jīng)

達到設備技術指標要求，檢查設備處理日志，如壓載水管理系統(tǒng)出現(xiàn)常見錯誤類別需進行現(xiàn)

場應急處理，類別及處理方式詳見附錄B；

4.6.1.2取樣人員需拍攝設備銘牌、流量計初始數(shù)值，階段性取樣體積以及取樣后總體積數(shù)

值以備電子存檔，或使用執(zhí)法記錄儀開展取樣監(jiān)督工作；

4.6.1.3壓載水主管路取樣等動力取樣要求

在壓載水完全發(fā)展成湍流的狀態(tài)下，在排放管內(nèi)取樣，壓載水管理系統(tǒng)主管路取樣示意

圖如圖3所示。

7

T/CI×××—2024

圖3壓載水管理系統(tǒng)主管路取樣示意圖

取樣流速應滿足國際海事組織MEPC,173(58)G2導則船舶壓載水取樣導則要求的等動力

取樣，計算公式如下式所示，取樣平均流速不應超過50L/min。

2

???

?????

Q為取樣流量，Q為壓載水主管?路排=放?流×量，D?為取樣管直徑，D為壓載水主管道排

isom?isom

放管直徑。因此，每次取樣時，取樣工程師應提前獲悉壓載水設備主管道直徑，經(jīng)過現(xiàn)場換

算，攜帶合適尺寸的取樣設備管路，并通過隔膜閥調(diào)整合適的取樣流速，以達到等動力取樣

要求。

4.6.1.4壓載水處理系統(tǒng)主管道出水口附近搭建取樣設備，可根據(jù)不同尺寸壓載水處理系統(tǒng)

取樣口，采用不同規(guī)格墊片與法蘭連接排水口與取樣設備通水管路或采用同等方式連接設備

通水管路。

4.6.1.5啟動船舶壓載水處理設備，檢查其運行情況，通過取樣管路上隔膜閥將流量調(diào)節(jié)至

合適流速運行3-5min，清洗排放管路。

4.6.1.6待流量計歸零后，拍照取證，打開壓載水處理系統(tǒng)采樣口閥門，正式取樣，在取樣

過程中，階段性從取樣管路中取具有代表性的≥10μm和<50μm（S型）生物樣品5-10L，

微生物樣品500mL，理化指標樣品250mL，至少分3次取完S型生物樣品及微生物樣品。

4.6.1.7當處理水取樣達到1000L后，關閉設備等動力采樣口閥門，并拍照流量計取證；

如處理水取不到1000L，則需在附錄A取樣表格中進行情況說明。

4.6.1.8環(huán)境水取樣可通過調(diào)換艙室在對照艙通過設備主管路排放口進行取樣，需更換取樣

濾網(wǎng)，如隨航取樣，則可通過舷邊使用隔膜泵進行富集取樣。

4.6.1.9環(huán)境水取樣過程參考處理水，需更換濾網(wǎng)，取樣體積達到100L后，關閉設備等動

力采樣口閥門，并拍照流量計取證。

4.6.2人孔取樣

4.6.2.1適用對象

（1）此方法適用于未安裝壓載水管理系統(tǒng)或系統(tǒng)出現(xiàn)故障，在壓載水頂邊艙和邊艙滿載

或較高水位時的樣品采集；

（2）壓載水艙人孔中取樣僅用于壓載水在艙內(nèi)或之前進行了壓載水處理的情況；

（3）若壓載水處理中的任何過程是在壓載水排放期間進行的，不應在壓載水艙人孔中取

樣；

8

T/CI×××—2024

（4）盡可能靠近排放管路的排放點進行取樣。

4.6.2.2采集程序

（1）由船方人員負責確認并打開位于甲板上的人孔蓋；

（2）人孔附近搭建取樣裝備，使用潛水泵連接取樣裝備，潛水泵放入人孔后，泵的吸入

管應降低到不同深度采集不同水深樣品，取樣流程參考4.6.1。

4.6.3測深孔/空氣管中取樣

4.6.3.1適用對象

（1）此方法適用于未安裝壓載水管理系統(tǒng)或系統(tǒng)出現(xiàn)故障，壓載水頂邊艙和邊艙樣品采

集，自測量管處采集方法也適用于壓載水底邊艙和底艙的樣品采集；

（2）確保壓載水在測深管/空氣管內(nèi)外充分混合；

（3）船舶記錄簿記錄置換了壓載水時，應謹慎使用測深管/空氣管取樣；

（4）非多孔測深管在置換過壓載水的情況下，管中的壓載水可能會沒有受到置換的影響，

導致無法滿足代表性取樣的要求。

4.6.3.2采集程序

（1）由船方人員打開測量管/空氣管上蓋，用測量尺測定水深和水面高度；

（2）使用合適的潛水泵從測深空/空氣管中抽取壓載水樣品；如液面在操作部位以下10m

深及以下，不適合用負壓泵；

（3）測深孔/空氣管附近搭建取樣裝備，使用潛水泵連接取樣裝備，潛水泵放入人孔后，

泵的吸入管應降低到不同深度采集不同水深樣品，取樣流程參考4.6.1。

4.6.4排水口取樣

4.6.4.1適用對象

此方法適用于壓載水頂邊艙有手動排水口且便于采樣時的樣品采集，自測量管處采集方

法也適用于壓載水底邊艙和底艙的樣品采集。

4.6.4.2采集程序

（1）由船方人員打開壓載水艙頂邊艙手動排水閥門，排水3-5min。

（2）用采樣桶自甲板上墜下或自岸上送至排水口處下方接水。

4.7樣品保存、運送

4.7.1樣品封存

9

T/CI×××—2024

采集樣品直接注入樣品瓶，根據(jù)檢測項目需求進行必要現(xiàn)場預處理，貼標簽，封口，樣

品標簽需包括：船舶名稱、IMO號、樣品類別、取樣方式、取樣日期、取樣體積、檢測項目

等要素。

4.7.2樣品現(xiàn)場檢測

現(xiàn)場可利用鹽度計、溫度計等指示性檢測設備對樣品的溫度、鹽度進行檢測，相關結果

填入附錄A-5。

4.7.3樣品運輸

將樣品封存放入取樣包中，并由取樣人員快遞或專車于24h內(nèi)低溫（4℃±2℃）送達

實驗室開展檢測，除有毒霍亂弧菌與理化樣品以外，其他樣品需存放在保溫箱或車載冰箱中。

5L型和S型存活生物指示性檢測規(guī)程

5.1檢測方法

指示性方法可選擇附錄C中的方法或根據(jù)實際的需要選擇其他合適的方法。

5.2指示性檢測設備要求

指示性檢測設備宜具備出廠檢測報告，設備使用說明書，設備精度與誤差分析報告，歷

史檢測數(shù)據(jù)報告，詳細檢測數(shù)據(jù)偏離分析報告，第三方產(chǎn)品檢測報告。

5.3S型存活生物指示性檢測

5.3.1PAM分析法

基于PAM分析方法，對壓載水中≥10μm且＜50μm（S型）浮游植物進行指示性檢測

分析，至少檢測3次及以上，檢測設備或推薦方法參見附錄C。

5.3.2活性熒光檢測法

基于活性熒光檢測法，對壓載水中≥10μm且＜50μm（S型）浮游植物進行指示性檢

測分析，至少檢測3次及以上，檢測設備或推薦方法參見附錄C。

5.4L型和S型存活生物指示性檢測

5.4.1ATP分析法

基于ATP分析方法，對壓載水中L型和S型存活生物進行指示性檢測分析，L型生物檢

測量不少于500mL，S型生物檢測量不少于200mL，至少檢測3次及以上，方法標準參見

附錄C。

5.4.2MFA分析法

10

T/CI×××—2024

基于MFA分析方法，對壓載水中L型和S型存活生物進行指示性檢測分析，L型生物檢

測量不少于600mL，S型生物檢測量不少于200mL，檢測1次，方法標準參見附錄C。

5.5指示性檢測結果判定

《國際船舶壓載水與沉積物控制與管理公約》D-2標準參見附錄E。

5.5.1PAM分析法

基于PAM分析法對S型生物的檢測，結果為PASS或者FAIL，檢測3次，以2次同樣結

果為最終記錄，如2次及以上為PASS，則判定S型生物符合《國際船舶壓載水與沉積物控

制與管理公約》D-2標準，如2次及以上為FAIL，需開展顯微鏡詳細檢測，如果詳細檢測依

然超標，則判定S型生物不符合《國際船舶壓載水與沉積物控制與管理公約》D-2標準，D-2

排放標準參見附錄E。

5.5.2活性熒光檢測法

基于活性熒光檢測法對S型生物的檢測，檢測結果為RiskFail或者RiskHigh或者

RiskLow，檢測3次，以2次同樣結果為最終記錄，如2次及以上為RiskFail或者RiskHigh，

需開展顯微鏡詳細檢測，如果詳細檢測依然超標，則判定S型生物不符合《國際船舶壓載水

與沉積物控制與管理公約》D-2標準，D-2排放標準參見附錄E。

5.5.3ATP分析法

基于ATP分析法，對壓載水中L型和S型存活生物進行指示性檢測分析，檢測結果為

MostLikelyCompliant或者SignalClosetoLimit或者MostLikelynotCompliant，

樣品檢測3次，以3次平均結果為最終記錄，如結果為SignalClosetoLimit或者Most

LikelynotCompliant，則需開展顯微鏡詳細檢測，如果詳細檢測依然超標，則判定L型和

S型存活生物不符合《國際船舶壓載水與沉積物控制與管理公約》D-2標準；如3次平均結

果為MostLikelyCompliant，則判定L型和S型存活生物符合《國際船舶壓載水與沉積物

控制與管理公約》D-2標準，排放標準參見附錄E。

5.5.4MFA分析法

基于MFA分析法對壓載水中L型和S型存活生物進行指示性檢測分析，檢測結果為Very

LowRisk或者LowRisk或者HighRisk，檢測1次，LowRisk或者HighRisk，則需開展

顯微鏡詳細檢測，如果詳細檢測依然超標，則判定L型和S型存活生物不符合《國際船舶壓

載水與沉積物控制與管理公約》D-2標準；如檢測過VeryLowRisk，則判定L型和S型存

活生物符合《壓載水公約》D-2標準，排放標準參見附錄E。

11

T/CI×××—2024

5.5.5復驗

因船舶壓載水中存活生物可能隨著時間的推移進行不斷繁殖、再生或死亡，因此其數(shù)量

一直是動態(tài)變化的，壓載水樣品不接受復驗。

5.6結果記錄

原始檢測記錄應包括樣品編號、樣品名稱、檢測日期和時間、檢測方法、儀器設備、檢

測結果、檢測人、復核日期、復核人等內(nèi)容，指示性檢測結果均需保留電子圖片存檔，以備

復查溯源。

5.7質(zhì)量控制

定期每季度進行陽性及陰性對照試驗。將培養(yǎng)的浮游生物制成100-200cells/mL的懸

浮液，鏡檢后對指示性檢測設備按照操作程序進行陽性試驗。陰性對照則使用純凈水進行，

如陰性對照或陽性對照試驗結果不符合要求，則應查明原因后重新調(diào)試設備。6L型與S型

存活生物顯微鏡詳細檢測規(guī)程

6L型存活生物詳細檢測規(guī)程

6.1檢測原理

直接觀察法：通過顯微鏡觀察L型生物，當生物體的某部分被嚴重破壞時，該生物體被

判定為不可存活；對于形態(tài)完整但是不動的浮游動物，可以觀察器官活動（如心跳）判斷其

存活/死亡；如不能觀察器官活動，則可用解剖針輕輕戳動，看其是否有反應，如無反應則

判斷為死亡，記錄活體數(shù)量的方法。

差減法：通過顯微鏡觀察L型生物，當生物體的某部分被嚴重破壞時，該生物體被判定

為不可存活；對于形態(tài)完整但是不動的浮游動物，可以觀察器官活動（如心跳）判斷其存活

/死亡；如不能觀察器官活動，則可用解剖針輕輕戳動，看其是否有反應，如無反應則判斷

為死亡。差減法為先計數(shù)死亡個體，再使用滴管加幾滴魯哥氏試劑到計數(shù)框內(nèi)，將樣品固定，

再計數(shù)全體死亡個體數(shù)，兩個計數(shù)相減的數(shù)量為活體數(shù)量的個數(shù)。

6.1.1主要設備、器具

（1）倒置顯微鏡或體視顯微鏡（物鏡4×、10×、20×、40×；目鏡1×）

（2）浮游動物計數(shù)框(80mm×100mm，22mL)

（3）計數(shù)器

（4）電動加樣管：量程20mL

（5）燒杯

12

T/CI×××—2024

6.1.2主要試劑及其配置

6.1.2.1試劑

碘化鉀（KI，分析純），碘（I2，分析純）

6.1.2.2配置

魯哥氏試劑：6g碘化鉀（KI）溶于少量水中（10mL-20mL），待其完全溶解后，加

入4g碘（I2）充分搖動，待碘完全溶解后定容到100mL。

6.1.3L型存活生物活體計數(shù)

6.1.3.1準備工作

L型存活生物樣品送達實驗室后，用量筒計量樣品瓶中壓載水濃縮后的體積（V1），每

次取20mL樣品作為一個子樣品，根據(jù)表1數(shù)量水平選擇不同的檢測方法，根據(jù)樣品應在取

樣后24h內(nèi)開展檢測工作。

6.1.3.2樣品初篩

可先觀察一個浮游生物計數(shù)框的活體生物數(shù)量，預估L型活體生物的數(shù)量，如活體生物

個體低于2個則為低數(shù)量水平，2-20個為中數(shù)量水平，超過20個則為高數(shù)量水平，低數(shù)量

水平推薦計數(shù)片數(shù)為10片，中數(shù)量水平為5片，高數(shù)量水平則為3片，如表1所示：

表1L型存活生物推薦計數(shù)片數(shù)及方法

水平推薦計數(shù)片數(shù)推薦計數(shù)方法

高數(shù)量水平（>100inds./m3）3片差減法/直接觀察法

中數(shù)量水平（10inds./m3-100inds./m3）5片差減法/直接觀察法

低數(shù)量水平（<10inds./m3）10片差減法/直接觀察法

6.1.3.3樣品檢測

（1）直接觀察法

A.將瓶中樣品輕輕上下顛倒若干次搖勻；

B.迅速用電動定量加樣管取20mL樣品注入浮游動物計數(shù)框內(nèi)，在倒置或體視顯微鏡

下計數(shù)存活的數(shù)量（nL1），檢測浮游動物計數(shù)框移動方式如圖4所示；

13

T/CI×××—2024

圖4浮游動物計數(shù)框在顯微鏡視野下的移動方式示意圖

C.當生物體的某部分被嚴重破壞時，該生物體被判定為不存活；對于形態(tài)完整但是不

動的浮游動物，可以觀察器官活動（如心跳）判斷其存活/死亡；如不能觀察器官活動，則

可用解剖針輕輕戳動，看其是否有反應，如無反應則判斷為死亡；

D.每個樣品平均單片存活生物個體數(shù)按如下計算公式來計算。

計算公式：單片存活生物個數(shù)平均數(shù)為NL=(NL1+NL2+NL3+....NLm)/m；

NL為平均單片L型存活生物個體數(shù)，單位為inds./片；NL1，NL2，NL3，NLm為第1片，第2

片，第3片，....第m片上L型存活生物個體數(shù)，單位為inds.；m為計數(shù)片數(shù)；單片體積

數(shù)為20mL。

（2）差減法

A.將瓶中樣品輕輕上下顛倒若干次搖勻；

B.用電動加樣管取20mL瓶中樣品注入浮游動物計數(shù)框內(nèi)，在倒置或體視顯微鏡下計

數(shù)已死亡的L型生物（Nd(Dead)），檢測存活生物框轉動如圖4所示；

C.當生物體的某部分被嚴重破壞時，該生物體被判定為不存活；對于形態(tài)完整但是不

動的浮游動物，可以觀察器官活動（如有心跳）判斷存活；如不能觀察器官活動，則可用浮

游動物解剖針輕輕戳動，看其是否有反應，如無反應則判斷為死亡；

D.先計數(shù)死亡個體Nd，再使用滴管加幾滴魯哥氏試劑到計數(shù)框內(nèi)，將樣品固定，再按

照如下計算公式，計數(shù)全體Nt(Total)個體數(shù)；

計算公式：單片存活生物個體數(shù)NL=Nt(Total)-Nd(Dead);

單片存活生物平均個數(shù)NL，參考計算公式2：

單片存活生物個數(shù)平均數(shù)為NL=(NL1+NL2+NL3+....NLm)/m；

14

T/CI×××—2024

NL為平均單片L型存活生物個體數(shù)，單位為inds./片；NL1，NL2，NL3，NLm為第1片，第2

片，第3片，....第m片上L型存活生物個體數(shù)，單位為inds.；m為計數(shù)片數(shù)；單片體積

數(shù)為20mL。

注：第三片計算結果和前兩片的平均數(shù)之差如不大于其均數(shù)的±20%，其均數(shù)視為有效

結果，否則必須再測一片，直至三片數(shù)值與前兩片平均數(shù)之差不超過平均數(shù)的20%為止，即

可視為有效平均計數(shù)結果。

6.1.3.4計算

3

每m壓載水樣品中L型存活生物個體數(shù)量DL可參考如下公式計算：

計算公式：

DL(inds./m3)=（NL×V1）/（V2×V3）

式中：NL為每個樣品平均單片存活生物個體數(shù)（inds./片）；V1為濃縮樣體積（mL）；

3

V2為計數(shù)體積（20mL）；V3為采樣量（m）。

6.2S型存活生物詳細檢測規(guī)程

6.2.1檢測原理

雙熒光染色法（CMFDA/FDA），其中FDA是熒光素二乙酸酯，英文全稱是Fluorescein

Diacetate，CMFDA是5-氯甲酸熒光素酯是FDA的氯甲基衍生物，英文全稱

5-chloromethy-lfluoresceindiacetate，這兩種是可自由透過活細胞膜對細胞進行示蹤

的熒光染料。具細胞膜滲透性，無色，不具有熒光發(fā)光性。當通過被動運輸穿透細胞膜進入

活細胞后，CMFDA中的親脂性基團可被胞漿內(nèi)非特異性酯酶水解，生成5-氯甲基熒光素

（5-chloromethylfluorescein）；5-氯甲基熒光素可發(fā)出綠色熒光，因帶電荷而不能自由

穿透細胞膜，并利用自身氯甲基與細胞內(nèi)蛋白和多肽中的谷胱甘肽在谷胱甘肽巰基轉移酶作

用下生成加合物，能完好地保留在胞內(nèi)。經(jīng)CMFDA/FDA標記的細胞，在465nm-495nm波段

下可激發(fā)穩(wěn)定的熒光，穩(wěn)定標記的時間可達數(shù)天（至少3d），可用于S型細胞的活體計數(shù)。

6.2.2主要設備、器具

（1）正置或倒置熒光顯微鏡（可激發(fā)465nm-495nm波段）

（2）浮游植物計數(shù)框（50mm×20mm×1mm，1mL）

（3）計數(shù)器

（4）移液槍：量程1mL，10μL

（5）燒杯：500mL

15

T/CI×××—2024

（6）離心管：1.5mL

6.2.3主要試劑及其配置

6.2.3.1試劑

熒光素二乙酸酯（FDA），5-氯甲酸熒光素酯（CMFDA），二甲基亞砜（DMSO）

6.2.3.2CMFDA的配制

（1）將50μg的CMFDA，加入430μL的二甲基亞砜（DMSO）并渦旋混勻，配制成

濃度為250μM的CMFDA存儲液，避光；

（2）通過移液槍，將存儲液等分成100μL每份，保存在1.5mL的離心管中；

（3）每管貼上標簽，注明復溶日期和濃度，-20℃，避光保存；

（4）每次用完后仍需重新-20℃，避光保存。

6.2.3.3FDA的配制

（1）取100mg的FDA溶于4.8mL的DMSO中，配制成濃度為50mM的FDA準備液；

（2）取10μL的50mMFDA準備液，溶于990μL的二甲基亞砜DMSO中，制成濃

度為500μM的FDA儲存液；

（3）通過移液槍，將存儲液等分成100μL每份，保存在1.5mL的離心管中；每管

貼上標簽，注明復溶日期和濃度，-20℃避光保存。

（4）每次用完后仍需重新保存在-20℃避光保存。

6.2.4S型存活生物計數(shù)

6.2.4.1準備工作

S型存活生物樣品送達實驗室后，采用CMFDA和FDA雙熒光染料進行染色，并使用1mL

浮游植物計數(shù)框在熒光顯微鏡激發(fā)光465-495nm下進行染色細胞計數(shù)，樣品應在取樣后24

h內(nèi)開展檢測工作。

預估樣品密度水平，選擇生物分布較為平均的視野進行計數(shù)，視野中計數(shù)10個格子，

如活體細胞總數(shù)小于10，則為低密度水平；如計數(shù)10-100個活體細胞總數(shù)，則為中密度水

平，大于100個活體細胞的為高密度水平，參考表2開展推薦計數(shù)條數(shù)計算。

表2S型存活生物推薦浮游植物框計數(shù)方法

S型存活樣品預估密度水平推薦計數(shù)條數(shù)

高密度水平（>103cells/mL）3條法計數(shù)（2、5、8條）

16

T/CI×××—2024

中密度水平（102cells/mL-103cells/mL）5條法計數(shù)（2、4、6、8、10條）

低密度水平（<102cells/mL）全片計數(shù)

6.2.4.2檢測

（1）將水袋中S型生物樣品輕輕顛倒，再倒入500mL燒杯中，用1000μL移液槍吸取

S型尺寸樣品980μL于1.5mLEP管中，分別再加入10μL的500μM的FDA工作液和

10μL250μM的CMFDA工作液，使FDA的終濃度為5μM，CMFDA的終濃度為2.5μM，

避光染色10min；

（2）將染色后樣品輕輕搖勻，用移液槍將樣品加入1mL計數(shù)框內(nèi)，在激發(fā)波長為465

nm-495nm的熒光顯微鏡下，4倍或10倍物鏡下分別計數(shù)被FDA和CMFDA著色的S型尺寸活

體細胞數(shù)，被染色的生物體、運動的生物體或被染色同時運動的生物體都被視為存活生物，

并用顯微鏡軟件測量存活生物細胞的最小尺寸，如圖5所示；

圖5雙熒光染色后顯微鏡視野下活體細胞示例圖

（3）染色后樣品應在20min內(nèi)檢測完畢，以防熒光信號減弱；參考HJ1215水質(zhì)浮游

植物的測定濾膜顯微鏡計數(shù)法，檢測時注意視野范圍內(nèi)細胞參照圖5Whipple視野計數(shù)約定

規(guī)則，即：視野中處于下邊界及右邊界線的細胞計入總數(shù)，處于上邊界及左邊界線的細胞不

計入總數(shù)，如圖6所示。若出現(xiàn)絲狀體等較大個體顯著穿過兩個或多個格子的邊界時，應在

低倍鏡下單獨計數(shù)，再計入總數(shù)；

圖6Whipple視野計數(shù)約定規(guī)則示意圖

17

T/CI×××—2024

（4）若單個視野中生物體過多，參考表2計數(shù)方法，可采用長條計數(shù)法，選取兩相鄰刻

度從計數(shù)框左邊一直計數(shù)到計數(shù)框右邊稱為一個長條。如樣品細胞數(shù)為高密度水平，則計數(shù)

3條，即第2、5、8條，單片細胞密度為3條計數(shù)數(shù)量除以計數(shù)條數(shù)；若樣品細胞數(shù)為中密

度水平，則計數(shù)五條，即第2、4、6、8、10，單片細胞密度為5條計數(shù)數(shù)量除以計數(shù)條數(shù)；

若生物體密度為低密度水平，則應全片計數(shù)，破損細胞不計數(shù)。計數(shù)時宜緩慢移動顯微鏡載

物臺，如圖7所示，一般檢測片數(shù)為3片。

圖7顯微鏡視野在浮游植物框下移動示意圖

（5）對于S型存活生物每mL細胞密度DS，參考如下計算公式：

計算公式：DS=(NS1+NS2+NS3)/3

式中：NS1為第1片計數(shù)細胞密度（cells/mL）；NS2為第2片計數(shù)細胞密度（cells/mL）；

NS3為第3片計數(shù)細胞密度（cells/mL）。

注：第三片計算結果和前兩片的平均數(shù)之差如不大于其均數(shù)的±20%，其均數(shù)視為有效

結果，否則必須再測一片，直至三片數(shù)值與前兩片平均數(shù)之差不超過均數(shù)的20%為止，即可

視為有效平均計數(shù)結果。

6.3原始記錄

原始檢測記錄應包括樣品編號、樣品名稱、檢測日期和時間、檢測方法、儀器設備、檢

測結果、檢測人、復核日期、復核人等內(nèi)容，如樣品檢測不合格，則需對存活生物保存至少

10張帶標尺圖片，保存的照片應帶有系統(tǒng)自帶的標尺和日期，以供溯源。

6.4結果報告

數(shù)量/細胞計數(shù)≤10個時，以實際數(shù)量報告；數(shù)量/細胞計數(shù)＞10個且≤100個時，以

整數(shù)報告；如＞于100個時，將第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，

后面用0代替位數(shù)，也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位

有效數(shù)字。

18

T/CI×××—2024

6.5結果判定

6.5.1最小尺寸≥50μm（L型）存活生物結果不符合附錄ED-2排放標準，則判定該壓載

水不合格，按照相應法律、法規(guī)、部門規(guī)章等進行處置。

6.5.2最小尺寸＜50μm且≥10μm（S型）存活生物結果不符合附錄ED-2排放標準，則

判定為該壓載水不合格，按照相應法律、法規(guī)、部門規(guī)章等進行處置。

6.5.3《國際船舶壓載水與沉積物控制與管理公約》D-2標準參見附錄E。

6.6復驗

因存活生物樣品24h內(nèi)檢驗完畢，因此當實驗室檢測結果中的某一項檢驗結果不符合

檢驗依據(jù)的要求時，樣品不接受復驗。

7菌落總數(shù)檢測規(guī)程

7.1檢驗原理

將待測樣品原液或經(jīng)適當稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀

釋樣液涂布到平板上，經(jīng)過指定的溫度和時間培養(yǎng)，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見

的菌落，即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞；統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣

接種量即可換算出樣品中的菌落總數(shù)。

7.2設備和材料

電子天平、抽濾裝置、0.45μm無菌濾膜、鑷子、量筒、恒溫培養(yǎng)箱、接種針、接種

環(huán)、酒精燈、培養(yǎng)皿等。

7.3培養(yǎng)基和試劑

7.3.1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（g/L）

組分質(zhì)量

蛋白胨10.0g

牛肉膏3.0g

氯化鈉5.0g

瓊脂15.0-20.0g

將上述成分或商品化粉末，用1000mL去離子蒸餾水重懸，攪拌均勻，經(jīng)121℃高壓蒸

汽滅菌20min，冷卻至45-50°C倒入無菌培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基最終pH值應為7.2±0.2，在

4℃避光條件下保存，兩周有效。

7.3.2無菌水：取適量實驗用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。

7.3.310%Na2S2O3：稱取15.7g硫代硫酸鈉，定容100mL水中，滅菌。

19

T/CI×××—2024

7.4檢驗程序

7.4.1水樣前處理

若電解原理的壓載水處理設備產(chǎn)生的樣品，則水樣含有活性氯成分，需在收到樣品后根

據(jù)樣品體積加入10%濃度Na2S2O3溶液，以除去活性氯對細菌的抑制作用（每125mL容積加

入0.1mL的Na2S2O3溶液，若500mL水樣則加入0.4mL的Na2S2O3溶液），在24h以內(nèi)處

理采集樣品。

7.4.2梯度稀釋

使用無菌容器進行稀釋，設置2-3個梯度，每個梯度2-3個平行。根據(jù)不同類別水樣壓

載地點，樣品稀釋度可以參考表3，梯度稀釋可使用50mL原液加入450mL無菌水中。

表3樣品稀釋度參考表

樣品類型樣品狀態(tài)110-110-210-3

處理前▲▲▲

公海水

處理后▲▲▲

處理前▲▲▲

港口水

處理后▲▲▲

7.4.3接種

以無菌操作方式用1mL滅菌移液槍吸取充分混勻的樣品或稀釋樣品1mL，注入滅菌平

皿中，傾注15-20mL冷卻到44-47℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即旋搖平皿，使樣品或稀釋

樣品與培養(yǎng)基充分混勻，每個樣品或稀釋樣品傾注2個平皿。

7.4.4培養(yǎng)

待平皿內(nèi)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基冷卻凝固后，翻轉平皿，使底面向上（避免因表面水分凝結

而影響細菌均勻生長），其中一組在36℃±2℃條件下，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)44±4h，另一

組是22℃±2℃培養(yǎng)68±4h后觀察結果。

7.4.5空白對照

用無菌水做實驗室空白測定，培養(yǎng)后平皿上不得有菌落生長，否則，該次樣品測定結果

無效，應查明原因后重新測定。

7.5計數(shù)

7.5.1計數(shù)規(guī)則

20

T/CI×××—2024

作平皿菌落計數(shù)時，可用眼睛直接觀察，必要時使用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各

平皿的菌落數(shù)后，應求出不同稀釋度的平均菌落數(shù)，供下一步計算時應用。平皿上有較大片

狀菌落超過平皿一半時，該平皿不參加計數(shù)。片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半菌落分

布又很均勻時，將此分布均勻的菌落計數(shù)。

片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半菌落分布又很均勻時，將此分布均勻的菌落計數(shù)，

并乘以2代表全皿菌落總數(shù)。

外觀（形態(tài)或顏色）相似，距離相近卻不相觸的菌落，只要它們之間的距離不小于最小

菌落的直徑，予以計數(shù)。緊密接觸而外觀相異的菌落，予以計數(shù)。

若未能及時觀察，可5±3℃溫度保存，48h內(nèi)計數(shù)。

7.5.2不同稀釋度的選擇及報告方式

（1）首先選擇平均菌落數(shù)在30-399之間者進行計算，若只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符

合此范圍時，則將該菌落乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表4中實例1）。

（2）若有兩個稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30-300之間，則視二者之比值來決定，若其

比值小于2應報告兩者的平均數(shù)（如表4中實例2）。若大于2則報告其中稀釋度較小的菌

落總數(shù)（如表4中實例3）。若等于2亦報告其中稀釋度較小的菌落數(shù)（見表4中實例4）。

（3）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應以按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀

釋倍數(shù)報告之（見表4中實例5）。

（4）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應以按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋

倍數(shù)報告之（見表4中實例6）。

（5）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，則應以最接近30或300的平均菌

落乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表4中實例7）。

（6）若所有稀釋度的平板上均無菌落生長，則以未檢出報告之。

（7）如果所有平板上都有菌落密布，不要用“多不可計”報告，而應在稀釋度最大的平

板上，任意數(shù)其中2個平板1cm2中的菌落數(shù)，除2求出每cm2內(nèi)平均菌落數(shù)，乘以皿底面

積63.6cm2，再乘以其稀釋倍數(shù)作報告。

（8）菌落計數(shù)的報告菌落數(shù)在100以內(nèi)時按實有數(shù)報告，大于100時，采用兩位有效數(shù)

字，在兩位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計算，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)也可用

10的指數(shù)來表示（見表4報告方式欄）。

表4稀釋度選擇及菌落總數(shù)報告方式

21

T/CI×××—2024

實不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個稀釋度菌落總數(shù)/報告方式（CFU/mL）

例10-110-210-3菌落數(shù)之比（CFU/mL）

1136516420——1640016000或1.6×104

22760295461.63775038000或3.8×104

32890271602.22710027000或2.7×104

4150308215001500或1.5×103

5多不可計1650513——5130051000或5.1×104

627115——270270或2.7×102

7多不可計305123020031000或3.1×104

8耐熱大腸桿菌檢測規(guī)程

8.1檢測原理

耐熱大腸桿菌Thermotolerantcoliforms又稱糞大腸菌群(FecalColiforms)，44.5℃

培養(yǎng)24h，能在mTEC擇性培養(yǎng)基上生長，并形成黃色菌落的腸桿菌科細菌。

8.2設備和耗材

電子天平、抽濾裝置、0.45μm無菌濾膜、鑷子、量筒、恒溫培養(yǎng)箱、接種針、接種

環(huán)、酒精燈等。

8.3培養(yǎng)基和試劑配置

（1）mTEC培養(yǎng)基（g/L）

組分含量

乳糖10.0g

氯化鈉7.5g

月示蛋白胨5.0g

磷酸氫二鉀3.3g

酵母提取物3.0g

X-Gluc0.5g

SDS0.2g

22

T/CI×××—2024

脫氧膽酸鈉0.1g

瓊脂15.0g

將上述成分或商業(yè)化產(chǎn)品粉末稱取