DB51TechnicalspecificationforisolationandidentI 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 5 5 5 5 6 本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定1豬A型塞內卡病毒分離鑒定技術規(guī)范本文件適用于豬A型塞內卡病毒的病原分離和鑒定4縮略語DNAmarker：DNA相對分子質5.1主要試劑25.2主要儀器設備穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽、凝膠成像儀、倒置生物用一次性注射器吸取臨床發(fā)病豬只水泡液0.5mL~1mL，并將水泡液裝入保存管，用0.01mol/LPBS（pH7.4）清洗水泡表面，然后用滅菌手術剪刀剪取水泡皮2g~5g，裝存管，加適量50%甘油-PBS保存液，使保存液液面沒過樣品，不能立即使用應置于-70℃冷凍保裝入樣品保存管，加適量50%甘油-PBS保存液，使保存液液面沒過樣品，加蓋封口，不能立即使用即放SVA分離鑒定時，應在高等級生物安全實驗室操作，按照G水泡液4℃3000r/min離心10min，以0.22μm無菌濾膜過濾除菌后，-73按常規(guī)方法將PK-15細胞分裝在25cm2細胞培養(yǎng)瓶濃度應為2×105個/mL~3×105個/mL，培養(yǎng)48h。，37℃、5%CO2條接種2瓶~4瓶細胞，另設細胞對照2瓶~4瓶。液面，最后溶解脫落。對照細胞單層應完好，細胞形態(tài)基本正?；蛏杂兴ダ稀Ｈ舫霈F(xiàn)CPE，將接毒細胞若接種細胞第1代72h后未出現(xiàn)明顯CPE，按上述收毒方法收獲細胞/病毒液再接種生長良好的單層PK-15細胞進行盲傳，即1mL第一代細胞/病毒液加4mL細胞維持液，37°C培養(yǎng)。如此盲傳3代~5代，再進行取，并使用反轉錄試劑盒將提取核酸反轉錄成cDNA，于-20反應體系中各組分見表2，反應體系可根據(jù)表中各組分比例4體積(μL）BstDNA聚合酶緩沖液BstDNA聚合酶12221反應體系見表3，反應體系可根據(jù)表中各組分比體積(μL）5131159結果判定9.1RT-LAMP陽性對照出現(xiàn)1條梯狀條帶并發(fā)出綠色熒光，陰性對照無條帶不顯色，結果出現(xiàn)與陽性對照一致條帶，且顯色反應樣品管發(fā)出綠色熒光，判定為SVA核酸陽性；若樣品電泳結果無條帶，顯色反應樣品管無綠色熒光變化，判定為9.2RT-PCR出現(xiàn)與陽性對照大小一致的特異性擴增條帶，則判定為SVA核酸陽性；若樣品電泳結果未出現(xiàn)特異性擴9.3病毒分離鑒定6NaClNa2HPO4?12H2ONaOH或者HCl調pH值7.0~7.4，滅菌雙蒸水定容至1000mL,121℃、15min高0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四待上述混合物完全溶解后，加蒸餾水至1000mL，置4℃冰箱中備用，如配制1%的瓊脂糖凝膠和用作電泳緩沖液，則用蒸餾水稀釋50倍，成TAE電泳A.31.0%瓊脂糖凝膠板制備微波爐充分溶解后，加入溴化乙錠，倒入凝膠板中，在距離底板0.5mm的位置上放置梳子，凝膠的厚度為4mm，待凝膠完全凝固后，小心移去梳子，將凝膠板放入電泳槽中，電泳緩沖液沒過膠面。7豬A型塞內卡病毒VP1蛋白基因LAMP和RT-PCR擴CCGATCTCGACTACTGAATGTAATTAAGGTACTGGAGAAGGACGCCGTCTTCCCCACAGCAACAGGTGCACAGCAGGACGATGGTTACTTTTGTCTTCTAACACCCGCTTCCCGACCCGCTACTCGTTTCGGCCTGTACGTCAACCCGTCTGACAGTTACAGTTTGGCCTGTTTCACTTACTTTAGATCAGACCTTGAAGTCACGGT