ICS35.240.80C07團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/CHIA42.1-2023RNA和蛋白相互作用注釋標(biāo)準(zhǔn)1部分：RIP-seqCLIP-seq的實(shí)驗(yàn)方法流程Specificationsforinteractionbetweenlongnon-codingRNAandproteinsPart1：ExperimentpipelineofRIP-seqandCLIP-seq2023-11-14發(fā)布 2024-02-01實(shí)施中國衛(wèi)生信息與健康醫(yī)療大數(shù)據(jù)學(xué)會(huì) 發(fā)布T/CHIA42.1-2023T/CHIA42.1-2023目 次前 言 I引 言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和縮略語 1RIP-seq實(shí)驗(yàn)流程 2CLIP-seq實(shí)驗(yàn)流程 2T/CHIA42.1-2023T/CHIA42.1-2023PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2020給出的規(guī)則起草。T/CHIA42-2023《長非編碼RNA和蛋白相互作用注釋標(biāo)準(zhǔn)》分為以下3個(gè)部分：——第1部分：RIP-seq和CLIP-seq的實(shí)驗(yàn)方法流程——第2部分：RIP-seq和CLIP-seq的數(shù)據(jù)分析方法——第3部分：長非編碼RNA及其相互作用蛋白質(zhì)的功能注釋本標(biāo)準(zhǔn)為T/CHIA42-2023的第1部分。本標(biāo)準(zhǔn)由中國科學(xué)院生物物理研究所提出，由中國衛(wèi)生信息與健康大數(shù)據(jù)學(xué)會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：中國科學(xué)院生物物理研究所、中國科學(xué)院北京基因組研究所（國家生物信息中心）、浙江大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)、清華大學(xué)、中國人民解放軍總醫(yī)院、北京蛋白質(zhì)組研究中心、中國科學(xué)院微生物研究所、北京大學(xué)人民醫(yī)院、中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所、中南大學(xué)、空軍軍醫(yī)大學(xué)（第四軍醫(yī)大學(xué)）、中國科學(xué)院計(jì)算技術(shù)研究所和北京睿博解碼生物科技有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳潤生、何順民、宋廷瑞、張鵬、周紅紅、王曉娜、方向東、金力、何昆侖、李亦學(xué)、張學(xué)工、段會(huì)龍、周水庚、渠鴻竹、趙思琪、錢穎、王霞、趙屹、呂旭東、朱云平、馬俊才、楊忠、石樂明、吳松峰、吳林寰、王振、陳先來、賈志龍、張昭軍、婁曉敏、阮修艷、單廣樂、喬楠、劉登輝、丁子建。引 言RNA1部分：RIP-seqCLIP-seq的實(shí)驗(yàn)方RNA和蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)技術(shù)的檢測條件，為長非編碼RNA和蛋白質(zhì)相互作用的檢測實(shí)驗(yàn)流程提供一套術(shù)語規(guī)范、定義明確、語義語境無歧義的標(biāo)準(zhǔn)。T/CHIA42.1-2023T/CHIA42.1-2023PAGEPAGE1長非編碼RNA和蛋白相互作用注釋標(biāo)準(zhǔn)第1部分：RIP-seq和CLIP-seq的實(shí)驗(yàn)方法流程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了RIP-seq和CLIP-seq的實(shí)驗(yàn)方法流程規(guī)范。RIP-seqCLIP-seqRNA與蛋白質(zhì)相互作用的樣品制備作業(yè)。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本標(biāo)準(zhǔn)必不可少的條款。其中，注日（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T29859-2013生物信息學(xué)術(shù)語GB/T30989-2013高通量基因測序技術(shù)規(guī)程GB/T35890-2018高通量測序數(shù)據(jù)序列格式規(guī)范術(shù)語和定義GB/T29859-2013中界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。長非編碼RNA和蛋白相互作用（Longnon-codingRNAandproteininteractions）RNARNA免疫沉淀（RNAImmunoprecipitation）利用免疫沉淀獲取RNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法交聯(lián)免疫沉淀（Cross-linkingimmunoprecipitation）利用交聯(lián)后免疫沉淀的方法捕獲RNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法縮略語下列縮略語適用于本文件。RIP-seq:RNA（RNAImmunoprecipitationandhigh-throughputsequencing）CLIP-seq：紫外交聯(lián)免疫沉淀結(jié)合高通量測序（cross-linkingimmunoprecipitationandhigh-throughputsequencing）RIP-seq本文件的高通量基因測序方法涉及如下步驟:1×107EPDEPC-PBS3次。1ml30分鐘（10分鐘震蕩混勻一次）。3) 4℃，2000g20分鐘。proteinA/G的磁珠。30ul磁珠，41小時(shí)，做預(yù)清除。2EP管，棄磁珠。515ug對照IgG30ul磁珠，43小時(shí)。755次。5分鐘，westernTRIzolRNARNA含量。CLIP-seq本文件的高通量基因測序方法涉及如下步驟。irCLIP80%HeLaPBS0.25nM0.3J/cm2PBS/10mM5分鐘，通過細(xì)胞刮鏟收集，并計(jì)數(shù)。將沉淀的細(xì)胞在0.2mLSDS裂解緩沖液（1%SDS;50mMTris,pH7.5;1mM中裂解，并使用超聲波破碎儀進(jìn)行超聲處理（60秒的六個(gè)循環(huán)，45秒休息）。15稀釋緩沖液（1.1TritonX-10050mMTris，pH7.51mM450mMNaCl）加入SDSPierceBCA蛋白質(zhì)測定試劑盒分兩份進(jìn)行定量。將裂解物在4℃下旋轉(zhuǎn)1.5小時(shí)，同時(shí)將抗體與proteinA/G磁珠預(yù)結(jié)合。將免疫沉淀物依次在4℃下用1mLhigh-stringency緩沖液（20mMTris，pH7.5;120mMNaCl;25mMKCl;5mM1Trition-X1001%脫氧膽酸鈉）10分鐘。1mL（20mM7.51MNaCl;5mM1Trition-X1001Na-脫氧膽酸鹽0.001SDS）10分鐘。1mL低鹽緩沖液（20mMTris，pH7.55mM10分鐘。0.25mL0.1mLNT2緩沖液（50mMTris，pH7.5150mMNaCl;1mMMgCl20.0005%Igepal）漂洗磁珠兩次。將RNaseA和RNaseI在NT2緩沖液中稀釋。使用RNaseA20~1.6mLNaseI0.4至0.065uu10x300MNaAceaepH4.6，2800mMNaCl10mMZnSO4S112~1u/ul。30ul6ulPEG400（16.7%）。在重新懸浮免疫沉淀物之前，將反應(yīng)物在冰上冷卻。30℃15分鐘，151,400轉(zhuǎn)/秒靜息。0.5mLhigh-stringency0.25mL然后用0.05mL冰冷的NT2緩沖液快速?zèng)_洗免疫沉淀物。將NaseA和NaseI消化的復(fù)合物用4NK在恒溫混勻儀中在rpm，30ul反應(yīng)中（50mMTris，pH7.0；10mMMgCl2；5mMDTT）90秒去磷酸3010T4PNK0.1ulSUPERase-IN6ulPEG400。3'T4RNAI5秒1,400rpm9030l反應(yīng)含有10單位4NA連接酶1poe的preA-DNAadapter0.1ulSUPERase-IN6ulPEG400（16.7%）。10ul的樣品緩沖液+75℃15分鐘。將樣品儲(chǔ)存在-20℃4~12%Bis-Tris（1.0mm×12孔45RNP4℃，400mA，60轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。KRNA-蛋白結(jié)合片段轉(zhuǎn)膜后不允許硝化纖維素膜干燥。準(zhǔn)備硅化管用于所有文庫步驟。將膜置于預(yù)濕潤的玻璃纖維濾紙上，并用手術(shù)刀切除靶區(qū)域。0.5~1mm1.5mL離心管的底部。0.2mL10ulK的蛋白酶K（100mMTris，pH7.5；50mMNaCl；1mMEDTA；0.2％SDS）并在恒溫混勻儀中孵育。50℃，60分鐘，1,000rpm，15秒轉(zhuǎn)動(dòng)，30秒靜止。1K反應(yīng)物點(diǎn)印跡在硝酸纖維RNA-adapter-連接蛋白的完全釋放。200ul飽和