2DB21/T—2019玉米轉(zhuǎn)基因成分檢測操作技術規(guī)程本標準規(guī)定了玉米轉(zhuǎn)基因成分檢測過程中抽樣、樣品接收、樣品處理、關鍵試劑驗證、檢測、結(jié)果判定與復驗、檢測后樣品的保存及處置、廢棄物處理等內(nèi)容。本標準適用于PCR方法和試紙條方法檢測玉米及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分的操作規(guī)程。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T19495.8轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測蛋白質(zhì)檢測方法SN/T4835實驗室生物廢棄物管理要求農(nóng)業(yè)部1485號公告-4-2010轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測DNA提取和純化農(nóng)業(yè)部2031號公告-19-2013轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抽樣農(nóng)業(yè)部2259號公告-4-2015轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測定性PCR方法制定指南3術語與定義下列術語和定義適用于本文件。3.1陽性PCR對照positivePCRcontrol用含有目的序列的樣品DNA進行PCR擴增。3.2陰性PCR對照negativePCRcontrol用不含有目的序列的樣品DNA進行PCR擴增。3.3PCR空白對照PCRblank,negativereagentcontrol以水或不含目的DNA試劑進行PCR反應，以驗證PCR反應過程中未被污染。3.43DB21/T—2019檢測試紙條dipstickformat應用雙抗體夾心免疫層析的原理，試紙條包裝上明確標注了保質(zhì)期、穩(wěn)定性試驗證明、生產(chǎn)廠家、限量值等內(nèi)容，適合快速定性分析的側(cè)向流動試紙條。3.5抽樣sampling采用適合的工具按照規(guī)定的方法，從市場或田間隨機采集樣品的活動。3.6送樣Samplesending送檢單位自行抽取和標識，符合轉(zhuǎn)基因檢測樣品要求，自行送到轉(zhuǎn)基因檢測機構(gòu)委托檢測的活動。3.7DNA提取試劑盒DNAExtractionKit通過物理和化學方法使DNA從樣品的不同組分中分離出來，利用不同的純化方法獲得純化DNA，商業(yè)化生產(chǎn)的一組試劑或耗材。4抽樣4.1總體要求按照農(nóng)業(yè)部2031號公告-19-2013的規(guī)定執(zhí)行。4.2種子及其加工品4.2.1種子及其加工品抽樣時，按照指定區(qū)域隨機購買產(chǎn)品即可，每份樣品抽取量不少于2Kg。4.2.2所需物品：抽樣工作單、潔凈無污染物的樣品袋等。4.2.3抽樣工作單根據(jù)實際情況，包含以下內(nèi)容：樣品名稱、樣品編號、商標、型號規(guī)格、生產(chǎn)日期或批號、抽樣數(shù)量、抽樣場所、受檢單位情況（受檢單位名稱、通訊地址、法定代表人、聯(lián)系人、電話）、生產(chǎn)單位情況（單位名稱、通訊地址、聯(lián)系人、電話）、抽樣單位情況（單位名稱、聯(lián)系人、電話、通訊地址）、受檢人簽字、受檢單位負責人簽字、受檢單位（公章）、抽樣人簽字、抽樣單位（公章）、抽樣日期、備注。4.3葉片4.3.1每份樣品隨機抽取20個單株的葉片混合，每片葉片取頂端約5cm長的葉尖。4DB21/T—20194.3.2根據(jù)實際需要，所需物品如下：GPS定位儀、采樣信息表、自封袋、離心管、離心管架、塑料滴管、小燒杯、剪刀、稱量紙、試紙條、玻璃研磨棒等。4.3.3采樣信息表根據(jù)實際情況包含以下內(nèi)容：單位名稱（公章）、序號、樣品編號、取樣地點（市、縣、鄉(xiāng)）、GPS信息、試紙條檢測參數(shù)及結(jié)果、抽樣日期、抽樣人員、備注。5樣品接收5.1所送樣品按照樣品接收所規(guī)定的要求執(zhí)行。5.2樣品接收應登記以下項目：樣品名稱、樣品編號、檢驗類型、樣品重量、樣品狀態(tài)、時間要求、是否保留副樣、報告領取方式、提供報告要求、檢測依據(jù)、檢測項目、委托單位、聯(lián)系電話、付費總額、付費方式、委托人、到樣日期、收樣人、備注。5.3在檢出限量為0.1%的情況下，要求送檢玉米樣品數(shù)量應達到3000?；蛑亓窟_到1000g。如果送檢玉米樣品不能達到規(guī)定數(shù)量或重量，則應注明不能復檢。其它限量時需要的樣品數(shù)量可以按照農(nóng)業(yè)部2031號公告-19-2013的規(guī)定執(zhí)行。5.4樣品接收時注意包裝是否完好，如有破損應及時更換樣品，對紗網(wǎng)袋包裝的樣品裝入潔凈無污染的樣品袋后再進行編號。5.5樣品由接樣人員接收，登記，編號后，交由樣品保管員入庫管理。檢測人員檢測時填寫樣品領取返還記錄表。6樣品處理6.1每份樣品處理要使用獨立的研磨杯，研磨杯在使用前應先刷洗，并使用次氯酸鈉溶液或者商業(yè)化的含有DNA酶的試劑浸泡10分鐘，再用清水沖洗干凈，最后用蒸餾水漂洗，晾干備用。6.2固體樣品研磨處理成顆粒狀，直徑在2mm以下。6.3樣品處理的研磨過程需在負壓或局部負壓環(huán)境下操作。6.4每個樣品研磨后，使用次氯酸鈉溶液進行環(huán)境清潔，防止交叉污染。注意通風櫥臺面和研磨機機體等位置的擦拭，防止樣品處理過程中交叉污染。6.5樣品研磨后的粉末為正樣，用于檢測，剩余的樣品為副樣，樣品應粘貼明確的狀態(tài)標識，信息包括“待檢、在檢和檢畢”。正樣和副樣應妥善保管，用于復驗和復檢。5DB21/T—20196.6稱取0.1g～0.5g研磨好的樣品，或遵照所使用的DNA提取方法規(guī)定的樣品量稱取樣品，用于DNA的提取。7關鍵試劑驗證7.1試劑包括：DNA提取試劑盒、引物、PCR反應體系相關試劑和試紙條。7.2每批試劑到貨后均需進行驗證，驗證可以使用已知的轉(zhuǎn)基因陽性樣品，對新購試劑進行驗證。8檢測8.1DNA提取8.1.1DNA提取方法可以選用農(nóng)業(yè)部1485號公告-4-2010中適合的方法進行，也可以選用經(jīng)過驗證的商業(yè)化DNA提取試劑盒進行提取。8.1.2樣品DNA的提取純度OD260/OD280值應在1.7～2.0之間，超出范圍的應重新進行提取。提取好的DNA按照公式：加水量(μLDNA濃度ng/μL÷25-1）×吸取DNA量(μL稀釋至25ng/μL，置于冰箱冷藏箱內(nèi)備用。8.2樣品的試紙條檢測8.2.1試紙條檢測可以按照GB/T19495.8轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測蛋白質(zhì)檢測方法中的方法進行。8.2.2商業(yè)化的試紙條在使用前需用已知轉(zhuǎn)基因陽性樣品進行驗證，合格后再使用。8.2.3葉片進行試紙條檢測時，可先將葉片剪成小塊，裝入離心管中，加入適量純凈水，使用研磨棒研磨至水呈黃綠色，即可進行試紙條檢測。8.3引物設計與合成8.3.1需要進行引物設計時，按照農(nóng)業(yè)部2259號公告-4-2015轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測定性PCR方法制定指南的規(guī)定進行設計和驗證。8.3.2引物需按現(xiàn)行有效的標準進行合成。8.3.3引物一般采用外協(xié)的方式進行合成，應保留委托方提供的引物合成的質(zhì)量記錄，即在每批引物使用前進行質(zhì)量合格的驗證。8.4PCR擴增8.4.1PCR擴增體系的配制和DNA樣品加入應在不同的超凈工作臺或生物安全柜內(nèi)進行。8.4.2PCR擴增體系中，應包括PCR空白對照、陰性PCR對照、陽性PCR對照，且擴增結(jié)果必須與預期結(jié)果一致。8.4.3玉米樣品的PCR擴增參數(shù)包括：CaMV35S啟動子、NOS終止子、bar或pat基因和玉米內(nèi)標準基因等。8.5瓊脂糖凝膠電泳8.5.1根據(jù)選用參數(shù)的擴增片段，選擇合適的Marker，一般選用DL2000Marker。6DB21/T—20198.5.2配制的瓊脂糖凝膠濃度為2%，即每100mL電泳液中加入2g瓊脂糖。8.5.3配制瓊脂糖凝膠的溶液須與電泳的電極緩沖液一致，可直接購買50×TAE，稀釋至1×備用。瓊脂糖凝膠板應提前制作好，至少冷卻30min以上才能使用。8.5.4DNA向電泳的正極泳動，點樣孔放置于負極方向。8.5.5電源控制在2V/cm～5V/cm,膠板長度在12cm左右時，電壓一般在80V～110V，電泳時間為40min～60min。9結(jié)果判定與復驗9.1篩選因子檢測結(jié)果為陰性的，即可判定為轉(zhuǎn)基因陰性樣品。篩選因子檢測結(jié)果出現(xiàn)一個或多個因子為陽性的，需要進行復驗。9.2復驗結(jié)果與初檢結(jié)果一致時，即可確認為陽性結(jié)果，并需進一步確認轉(zhuǎn)基因玉米樣品的轉(zhuǎn)化體。9.3復驗結(jié)果與初檢結(jié)果不一致時，需取正樣進行第三次復驗，結(jié)果以兩次相同結(jié)果為準。9.4根據(jù)篩選因子的陽性結(jié)果，通過轉(zhuǎn)基因玉米的分子特征，選擇相對應的轉(zhuǎn)化體進行確認。常見轉(zhuǎn)基因玉米的分子特征及對應的轉(zhuǎn)基因玉米品種見附錄A。10檢測后樣品的保存及處置10.1保存10.1.1樣品在檢畢區(qū)保存。10.1.2樣品保存區(qū)域應具有防盜和監(jiān)控設施。10.1.3樣品檢測后將陽性樣品和陰性樣品分開保存，陽性樣品保存于可以上鎖的裝置中，鑰匙由樣品保管員保管，樣品封閉好包裝袋，避免交叉污染。10.1.4陰性樣品保存三個月，陽性樣品保存6個月，以備復檢。10.1.5種子樣品冰箱冷藏保存，葉片樣品冰箱冷凍保存。10.2處置10.2.1超過保留期的樣品，在丟棄之前應進行詳細的記錄，內(nèi)容包括：中心編號，樣品名稱，樣品狀態(tài)，樣品重量，樣品處理方法，樣品保管人，申請?zhí)幚頃r間，批準人，備注等項目。10.2.2超過保留期的陰性玉米樣品，包括正樣和副樣，按照實驗室樣品處理程序執(zhí)行。10.2.3超過保留期的陽性玉米產(chǎn)品，正樣和副樣經(jīng)121℃高壓滅活，再按照實驗室樣品處理程序執(zhí)行。11廢棄物處理11.1實驗過程中產(chǎn)生的廢液主要為DNA提取過程中的廢液，需由有資質(zhì)的回收企業(yè)進行回收，統(tǒng)一處7DB21/T—201911.2使用過的移液器吸頭、PCR擴增后的產(chǎn)物應放入次氯酸鈉溶液的容器內(nèi)浸泡，浸泡時間不少于24h，進行無害化處理之后按照SN/T4835實驗室生物廢棄物管理要求進行處理。11.3在進行瓊脂糖凝膠電泳時，盡量避免使用EB（溴化乙錠）進行染色，如必需使用時，應將使用后的電泳液進行活性炭吸附過濾，進行無害化處理之后按照SN/T4835實驗室生物廢棄物管理要求進行處理。1DB21/TXXXX—2019（資料性附錄）常見轉(zhuǎn)基因玉米分子特征常見轉(zhuǎn)基因玉米分子特征信息見表A.1.表A.1常見轉(zhuǎn)基因玉米分子特征CaMV35SNOSCaMV35SpatNOSP-CDPKcry1AbCaMV35SP-PPCcry1AbCaMV35SCaMV35SBarCaMV35SPractI/RuBiSCom-epspsNOSCaMV35Scry1AbCaMV35Scry3Bb1T-hspCaMV35SnptIINOSeCaMV35SCp4-epspsNOSPractI/CTP2C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