一、引言1.1研究背景與意義大腸桿菌（Escherichiacoli）作為一種廣泛存在于人和動(dòng)物腸道中的革蘭氏陰性菌，在維持腸道微生態(tài)平衡方面發(fā)揮著重要作用。然而，某些特定血清型的大腸桿菌具有致病性，能夠引發(fā)一系列嚴(yán)重的健康問題。在腸道內(nèi)，致病性大腸桿菌可導(dǎo)致腹瀉、腹痛、嘔吐以及膿血便等腸道感染癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引發(fā)脫水和水電解質(zhì)紊亂，對(duì)嬰幼兒、老年人和免疫力低下人群的健康構(gòu)成極大威脅。而當(dāng)大腸桿菌突破腸道屏障，進(jìn)入泌尿系統(tǒng)時(shí)，會(huì)引發(fā)尿道炎、膀胱炎等泌尿系統(tǒng)感染，給患者帶來尿頻、尿急、尿痛等不適癥狀，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。在更為嚴(yán)重的情況下，大腸桿菌還可能進(jìn)入血液，引發(fā)敗血癥，甚至突破血腦屏障，導(dǎo)致腦膜炎，尤其是對(duì)于新生兒等免疫力較弱的群體，這些感染可能會(huì)帶來致命的后果。長(zhǎng)期以來，抗生素一直是治療大腸桿菌感染的主要手段。但隨著抗生素在醫(yī)療、養(yǎng)殖等領(lǐng)域的廣泛甚至過度使用，大腸桿菌的耐藥問題日益嚴(yán)峻。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)告顯示，全球已有超過70%的大腸桿菌對(duì)至少一種抗生素產(chǎn)生耐藥性。在中國(guó)，禽源大腸桿菌對(duì)阿莫西林、頭孢噻肟、慶大霉素等常用抗生素的耐藥率分別達(dá)到了45%、60%和65%。耐藥大腸桿菌的出現(xiàn)，使得原本有效的抗生素治療效果大打折扣，不僅增加了治療成本和治療周期，還顯著提高了患者的死亡率。更為嚴(yán)重的是，耐藥基因可以通過水平基因轉(zhuǎn)移等方式在不同細(xì)菌之間傳播，進(jìn)一步加速了耐藥性的擴(kuò)散，使得耐藥問題變得愈發(fā)復(fù)雜和難以控制。在大腸桿菌的耐藥機(jī)制研究中，Cpx系統(tǒng)（Cpxenvelopestressresponsesystem）逐漸成為關(guān)注的焦點(diǎn)。Cpx系統(tǒng)作為一種雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，由組氨酸蛋白激酶CpxA和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白CpxR組成。當(dāng)大腸桿菌受到外界環(huán)境脅迫，如抗生素刺激、溫度變化、滲透壓改變等，CpxA會(huì)感知這些信號(hào)，并通過自身磷酸化將磷酸基團(tuán)傳遞給CpxR。激活后的CpxR會(huì)結(jié)合到特定的DNA序列上，調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)，從而幫助大腸桿菌適應(yīng)環(huán)境變化，其中就包括介導(dǎo)抗生素耐受。研究表明，Cpx系統(tǒng)可以通過調(diào)節(jié)外膜蛋白的表達(dá)，改變細(xì)胞膜的通透性，減少抗生素的進(jìn)入；還能調(diào)控外排泵的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)抗生素的排出，從而使大腸桿菌在抗生素環(huán)境下得以生存和繁殖。對(duì)大腸桿菌Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)的抗生素耐受機(jī)制進(jìn)行深入研究，具有重大的理論和實(shí)際意義。在理論層面，有助于更全面、深入地理解細(xì)菌耐藥的分子機(jī)制，豐富和完善細(xì)菌應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)性理論體系。通過揭示Cpx系統(tǒng)在抗生素耐受中的具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和作用途徑，能夠?yàn)楹罄m(xù)研究其他細(xì)菌的耐藥機(jī)制提供重要的參考和借鑒，推動(dòng)微生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。從實(shí)際應(yīng)用角度來看，該研究成果有望為開發(fā)新型抗菌藥物和治療策略提供全新的靶點(diǎn)。針對(duì)Cpx系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)設(shè)計(jì)特異性的抑制劑，阻斷其介導(dǎo)的抗生素耐受途徑，從而恢復(fù)抗生素對(duì)耐藥大腸桿菌的敏感性，有效解決臨床治療中面臨的耐藥難題，為保障人類和動(dòng)物的健康做出重要貢獻(xiàn)。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入揭示大腸桿菌Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)抗生素耐受的詳細(xì)分子機(jī)制，通過多維度的研究方法，全面解析Cpx系統(tǒng)在大腸桿菌應(yīng)對(duì)抗生素脅迫過程中的關(guān)鍵作用和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這不僅有助于從分子層面理解細(xì)菌耐藥現(xiàn)象，也為解決臨床耐藥難題提供理論基礎(chǔ)。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，本研究將聚焦以下幾個(gè)關(guān)鍵問題：首先，Cpx系統(tǒng)如何精確感知抗生素脅迫信號(hào)，以及信號(hào)在CpxA和CpxR之間的傳遞機(jī)制是什么？CpxA作為信號(hào)感受器，其結(jié)構(gòu)中哪些關(guān)鍵位點(diǎn)負(fù)責(zé)識(shí)別不同種類的抗生素信號(hào)，又是如何通過自身磷酸化將信號(hào)傳遞給CpxR的，這一系列過程涉及到哪些分子間的相互作用，都需要深入探究。其次，激活后的CpxR如何調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，這些靶基因在介導(dǎo)抗生素耐受中發(fā)揮著怎樣的具體功能？CpxR與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合模式是怎樣的，它如何招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，從而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄水平，以及這些靶基因編碼的蛋白質(zhì)如何參與到抗生素的外排、細(xì)胞壁的合成修飾等耐受過程中，都是亟待解決的問題。再者，Cpx系統(tǒng)與其他耐藥相關(guān)系統(tǒng)之間是否存在交互作用，這種交互作用對(duì)大腸桿菌整體的抗生素耐受能力有何影響？在大腸桿菌復(fù)雜的耐藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，Cpx系統(tǒng)與其他如PhoP/PhoQ系統(tǒng)、ArcA/ArcB系統(tǒng)等是否存在信號(hào)通路的交叉，它們之間是如何相互協(xié)調(diào)、共同應(yīng)對(duì)抗生素脅迫的，深入研究這些交互作用，有助于全面理解大腸桿菌的耐藥機(jī)制。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究將采用實(shí)驗(yàn)研究與生物信息學(xué)分析相結(jié)合的方法，從多個(gè)層面深入探究大腸桿菌Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)的抗生素耐受機(jī)制。在實(shí)驗(yàn)研究方面，首先進(jìn)行菌株培養(yǎng)與抗生素處理。選用標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌菌株，如MG1655，在LB培養(yǎng)基中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。隨后，將培養(yǎng)好的菌株分別暴露于不同種類和濃度的抗生素環(huán)境中，如氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素等，設(shè)置多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。通過定期取樣，采用比濁法測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線，觀察不同抗生素處理下大腸桿菌的生長(zhǎng)情況，初步判斷Cpx系統(tǒng)在抗生素耐受中的作用。接著進(jìn)行基因敲除與互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。利用Red同源重組技術(shù)構(gòu)建Cpx系統(tǒng)相關(guān)基因（如cpxA、cpxR）的敲除菌株。該技術(shù)的原理是利用重組蛋白A、B、C對(duì)外源DNA片段與宿主DNA發(fā)生同源重組作用，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除。具體操作步驟包括外源DNA的引入、重組蛋白A、B和C的表達(dá)、同源重組、篩選和確認(rèn)。外源DNA可通過PCR擴(kuò)增、化學(xué)合成或者基因合成等方式獲得，重組蛋白A、B和C則可通過表達(dá)宿主DNA中相應(yīng)的基因獲得。同源重組后，利用熒光篩選、霉菌素敏感性和PCR等方法確認(rèn)基因敲除效果。同時(shí)，構(gòu)建含有完整cpxA、cpxR基因的互補(bǔ)質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入敲除菌株中，使其恢復(fù)基因表達(dá)。通過比較野生型菌株、基因敲除菌株和互補(bǔ)菌株在抗生素環(huán)境中的生長(zhǎng)情況、存活能力以及耐藥相關(guān)表型，明確Cpx系統(tǒng)基因在抗生素耐受中的具體功能。為了從轉(zhuǎn)錄水平深入了解Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)的抗生素耐受機(jī)制，開展轉(zhuǎn)錄組分析。提取不同處理?xiàng)l件下（野生型菌株在抗生素處理前后、基因敲除菌株在抗生素處理前后）大腸桿菌的總RNA，利用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和預(yù)處理后，通過生物信息學(xué)分析，篩選出差異表達(dá)基因。使用相關(guān)軟件，如DESeq2，進(jìn)行基因表達(dá)量的計(jì)算和差異分析，篩選出在不同條件下表達(dá)顯著變化的基因。進(jìn)一步對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和富集分析，借助數(shù)據(jù)庫，如GO（GeneOntology）和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes），明確它們參與的生物學(xué)過程、分子功能以及相關(guān)信號(hào)通路，從而全面解析Cpx系統(tǒng)調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)以及其在抗生素耐受中的作用途徑。蛋白質(zhì)組學(xué)分析也是本研究的重要環(huán)節(jié)。采用雙向電泳（2-DE）或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)，分離和鑒定不同處理?xiàng)l件下大腸桿菌的蛋白質(zhì)組。對(duì)于2-DE技術(shù)，先將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行等電聚焦，再進(jìn)行SDS電泳，從而在二維平面上分離蛋白質(zhì)。通過銀染或考馬斯亮藍(lán)染色等方法對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行顯色，然后利用圖像分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)量進(jìn)行定量分析，找出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。對(duì)于LC-MS/MS技術(shù)，將蛋白質(zhì)樣品酶解后，通過液相色譜進(jìn)行分離，再進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行離子化和質(zhì)量分析，通過數(shù)據(jù)庫搜索和匹配，鑒定出蛋白質(zhì)的種類和序列。對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從蛋白質(zhì)水平揭示Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)抗生素耐受的分子機(jī)制，研究蛋白質(zhì)之間的相互作用以及它們?cè)诩?xì)胞生理過程中的功能。在生物信息學(xué)分析方面，對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行深入挖掘和分析。利用分子對(duì)接技術(shù)，研究CpxA與抗生素分子之間的相互作用模式。通過構(gòu)建CpxA的三維結(jié)構(gòu)模型，利用分子對(duì)接軟件，如AutoDock，將抗生素分子與CpxA結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)接，模擬它們之間的結(jié)合過程，預(yù)測(cè)可能的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合親和力，從分子層面解析CpxA感知抗生素信號(hào)的機(jī)制。同時(shí)，構(gòu)建Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)的抗生素耐受調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。整合轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)以及已有的文獻(xiàn)報(bào)道，利用網(wǎng)絡(luò)分析工具，如Cytoscape，構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，明確Cpx系統(tǒng)與其他相關(guān)基因、蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系和調(diào)控層次，全面展示大腸桿菌在抗生素脅迫下的分子響應(yīng)機(jī)制。本研究的技術(shù)路線如下：首先，進(jìn)行大腸桿菌菌株的培養(yǎng)和抗生素處理，獲取不同處理?xiàng)l件下的細(xì)菌樣本。接著，對(duì)樣本進(jìn)行基因敲除和互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建相應(yīng)的菌株模型。然后，分別從轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組層面，對(duì)不同菌株進(jìn)行高通量測(cè)序和分析，獲取基因表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)。同時(shí)，利用生物信息學(xué)方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，包括分子對(duì)接和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等。最后，綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和生物信息學(xué)分析，全面闡述大腸桿菌Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)的抗生素耐受機(jī)制，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。二、大腸桿菌與抗生素耐藥概述2.1大腸桿菌的特性與危害大腸桿菌（Escherichiacoli），又稱大腸埃希氏菌，是一種在微生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中備受關(guān)注的革蘭氏陰性桿菌。從形態(tài)學(xué)角度來看，大腸桿菌呈現(xiàn)為兩端鈍圓的短桿菌形態(tài)，其大小通常在0.4-0.7×1-3μm之間，周身分布著鞭毛，這一結(jié)構(gòu)賦予了大腸桿菌運(yùn)動(dòng)的能力，使其能夠在適宜的環(huán)境中自由移動(dòng)，尋找營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適宜的生存空間。同時(shí)，大腸桿菌無芽孢，這與一些具有芽孢結(jié)構(gòu)的細(xì)菌不同，芽孢能夠幫助細(xì)菌在惡劣環(huán)境下長(zhǎng)期存活，而大腸桿菌則更多地依賴其快速的繁殖能力和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性來生存繁衍。在培養(yǎng)特性方面，大腸桿菌展現(xiàn)出獨(dú)特的表現(xiàn)。在血瓊脂平板上，部分菌株能夠產(chǎn)生β型溶血現(xiàn)象，這是由于這些菌株能夠分泌特定的溶血素，破壞紅細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂，血紅蛋白釋放，從而在培養(yǎng)基上形成透明的溶血環(huán)。而在鑒別性或選擇性培養(yǎng)基上，大腸桿菌會(huì)形成直徑約2-3mm的光滑型菌落，這些菌落通常呈現(xiàn)出濕潤(rùn)、光滑、邊緣整齊的外觀，通過觀察菌落的形態(tài)和特征，科研人員可以初步對(duì)大腸桿菌進(jìn)行鑒別和篩選。在生化反應(yīng)方面，大腸桿菌的代謝能力十分活躍。大部分菌株能夠發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，這一特性是大腸桿菌在腸道環(huán)境中生存和代謝的重要方式之一。同時(shí)，它還能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木膠糖、阿拉伯膠等多種碳水化合物，產(chǎn)生酸性物質(zhì)和氣體，這些代謝產(chǎn)物不僅影響著大腸桿菌自身的生存環(huán)境，也對(duì)周圍的微生物群落產(chǎn)生影響。此外，大腸桿菌還可以利用多種有機(jī)酸鹽作為碳源和能源，進(jìn)一步拓展了其在不同環(huán)境中的生存能力。IMViC試驗(yàn)是用于鑒別大腸桿菌的重要生化試驗(yàn)，典型的大腸桿菌在該試驗(yàn)中的表現(xiàn)為“+、+、-、-”，即吲哚試驗(yàn)陽性、甲基紅試驗(yàn)陽性、VP試驗(yàn)陰性、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陰性，這些特征性的生化反應(yīng)結(jié)果為大腸桿菌的準(zhǔn)確鑒定提供了重要依據(jù)。大腸桿菌的抗原構(gòu)造較為復(fù)雜，主要包括O、K、H、F四種抗原。O抗原屬于脂多糖成分，目前已發(fā)現(xiàn)有171種，其中162種與腹瀉等疾病密切相關(guān)，是大腸桿菌分群的重要基礎(chǔ)。不同的O抗原結(jié)構(gòu)決定了大腸桿菌的不同血清型，這些血清型在致病性和傳播特性上存在差異。K抗原為莢脂多糖抗原，從病人新分離的大腸桿菌多帶有K抗原，它具有抗吞噬和抵抗補(bǔ)體殺菌的作用，能夠幫助大腸桿菌在宿主體內(nèi)逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，從而更好地生存和繁殖。根據(jù)耐熱性等不同，K抗原又可細(xì)分為L(zhǎng)、A、B三種，其中L、B不耐熱，共有60種，這些不同類型的K抗原在大腸桿菌的致病過程中發(fā)揮著各自獨(dú)特的作用。F抗原至少有5種，其主要功能與大腸桿菌的粘附作用有關(guān)，它能夠幫助大腸桿菌附著在宿主細(xì)胞表面，為后續(xù)的感染和致病過程奠定基礎(chǔ)。通過O：K：H的排列方式，可以準(zhǔn)確地表明大腸桿菌的血清型，例如O111：K58（B4）：H2，這種精確的血清型標(biāo)識(shí)對(duì)于研究大腸桿菌的流行病學(xué)、致病性以及防控措施的制定具有重要意義。從致病性角度來看，大腸桿菌可分為腸道致病性大腸桿菌和腸道外致病性大腸桿菌。腸道致病性大腸桿菌又可進(jìn)一步細(xì)分為多個(gè)主要種類，如腸道致病性大腸桿菌（EPEC）、腸道產(chǎn)毒素性大腸桿菌（ETEC）、腸道侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸道出血性大腸桿菌（EHEC）、腸集聚性大腸桿菌（EAEC）以及腸產(chǎn)志賀樣毒素且同時(shí)具有一定侵襲力的大腸桿菌（ESIES）。腸道致病性大腸桿菌主要通過污染的食物和水源進(jìn)入人體腸道，引發(fā)一系列腸道感染癥狀。其中，EPEC能夠特異性地粘附在腸道上皮細(xì)胞表面，破壞細(xì)胞的微絨毛結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸道吸收功能障礙，引發(fā)腹瀉、嘔吐等癥狀，尤其對(duì)嬰幼兒的健康危害較大。ETEC則主要通過產(chǎn)生耐熱腸毒素（ST）和不耐熱腸毒素（LT），刺激腸道上皮細(xì)胞分泌大量液體和電解質(zhì)，導(dǎo)致腹瀉，這種類型的大腸桿菌感染在發(fā)展中國(guó)家的嬰幼兒和旅行者中較為常見。EIEC具有侵襲性，能夠侵入腸道上皮細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)繁殖，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腹瀉、腹痛、膿血便等癥狀，其臨床表現(xiàn)與細(xì)菌性痢疾相似。EHEC可產(chǎn)生志賀毒素，該毒素能夠損傷腸道血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致腸道出血和壞死，引發(fā)嚴(yán)重的腹瀉和出血性腸炎，其中O157：H7血清型是最為常見且危害較大的EHEC菌株，可導(dǎo)致溶血性尿毒綜合征（HUS）等嚴(yán)重并發(fā)癥，對(duì)患者的生命健康構(gòu)成極大威脅。EAEC通過集聚性粘附在腸道上皮細(xì)胞表面，形成生物膜，阻礙腸道正常的生理功能，引起持續(xù)性腹瀉，常見于兒童和免疫功能低下人群。ESIES同時(shí)具備產(chǎn)志賀樣毒素和侵襲力的特點(diǎn)，其致病機(jī)制更為復(fù)雜，對(duì)腸道組織的損傷也更為嚴(yán)重。腸道外致病性大腸桿菌則主要引起泌尿系統(tǒng)感染、化膿性感染等。在泌尿系統(tǒng)感染中，尿道致病性大腸桿菌（UPEC）是最常見的病原體之一。UPEC能夠通過尿道逆行進(jìn)入膀胱和腎臟，利用其表面的粘附素與泌尿系統(tǒng)上皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，從而定植在泌尿系統(tǒng)內(nèi)。一旦定植成功，UPEC會(huì)迅速繁殖，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致尿道炎、膀胱炎、腎盂腎炎等疾病?；颊咄ǔ?huì)出現(xiàn)尿頻、尿急、尿痛、發(fā)熱等癥狀，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。如果感染得不到及時(shí)有效的控制，還可能進(jìn)一步發(fā)展為敗血癥等全身性感染，危及生命。在化膿性感染方面，大腸桿菌可引發(fā)腹膜炎、闌尾炎、手術(shù)創(chuàng)口感染、敗血癥和新生兒腦膜炎等疾病。當(dāng)大腸桿菌通過腸道屏障進(jìn)入腹腔時(shí)，會(huì)引起腹膜炎，導(dǎo)致腹痛、腹脹、惡心、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致感染性休克。在闌尾炎的發(fā)病過程中，大腸桿菌也是常見的致病菌之一，它會(huì)在闌尾內(nèi)繁殖，引發(fā)炎癥，導(dǎo)致闌尾腫脹、疼痛，若不及時(shí)治療，闌尾可能會(huì)穿孔，引發(fā)更嚴(yán)重的腹腔感染。手術(shù)創(chuàng)口感染也是大腸桿菌常見的感染途徑之一，在手術(shù)過程中，如果消毒不嚴(yán)格或術(shù)后護(hù)理不當(dāng)，大腸桿菌可能會(huì)侵入手術(shù)創(chuàng)口，導(dǎo)致創(chuàng)口感染，延遲傷口愈合，增加患者的痛苦和醫(yī)療成本。在新生兒腦膜炎中，大腸桿菌通過血液循環(huán)進(jìn)入新生兒的大腦，引發(fā)炎癥，由于新生兒的血腦屏障發(fā)育不完善，大腸桿菌更容易突破屏障，對(duì)新生兒的神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害，影響其智力發(fā)育和身體健康，病死率較高。大腸桿菌對(duì)人類健康和畜牧業(yè)都帶來了嚴(yán)重的危害。在人類健康方面，每年因大腸桿菌感染導(dǎo)致的疾病案例眾多，尤其是在發(fā)展中國(guó)家，由于衛(wèi)生條件和醫(yī)療資源的限制，大腸桿菌感染的發(fā)病率和死亡率都相對(duì)較高。腸道感染不僅會(huì)影響患者的日常生活和工作，還可能導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)不良、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等問題，對(duì)兒童的健康成長(zhǎng)產(chǎn)生長(zhǎng)期的負(fù)面影響。泌尿系統(tǒng)感染雖然一般不會(huì)直接危及生命，但會(huì)給患者帶來極大的痛苦，降低生活質(zhì)量，且容易反復(fù)發(fā)作，增加患者的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。而對(duì)于敗血癥和腦膜炎等嚴(yán)重感染，即使經(jīng)過積極治療，仍可能會(huì)留下嚴(yán)重的后遺癥，如神經(jīng)系統(tǒng)損傷、腎功能衰竭等，給患者和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。在畜牧業(yè)中，大腸桿菌同樣是一個(gè)重要的致病因素。大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的多種動(dòng)物的急性傳染病，常見于新生畜及幼畜。例如，在仔豬養(yǎng)殖中，仔豬黃痢、仔豬白痢和水腫病是常見的由大腸桿菌引起的疾病。仔豬黃痢常見病原大腸桿菌的血清型為O2、O8、O45、O60、O115、O138、O139、O141、O149、O157等，多數(shù)能溶血，多見于新建場(chǎng)和頭胎母豬所產(chǎn)仔豬，多發(fā)于1-3日齡仔豬，7日齡以上少發(fā)，帶菌母豬是主要傳染源，仔豬生后幾小時(shí)至十幾小時(shí)即發(fā)病，死亡率高。仔豬白痢部分病原與黃痢相同，部分為條件致病大腸桿菌，多發(fā)生于10-30日齡仔豬，氣溫多變、陰雨潮濕、母豬乳汁改變和環(huán)境衛(wèi)生不良等因素都可能誘發(fā)本病，雖然死亡率不高，但會(huì)嚴(yán)重阻礙仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致養(yǎng)殖效益下降。水腫病最常見的血清型為O8、O138、O139、O141，病菌產(chǎn)生志賀氏菌樣毒素及水腫素，可引發(fā)水腫、腹瀉和神經(jīng)癥狀，多發(fā)于斷奶前后的仔豬，發(fā)病率雖不高（20%左右），但病死率高，與飼料或飼養(yǎng)方法突然改變有關(guān)，體況健壯、生長(zhǎng)速度快的仔豬更容易發(fā)病。這些疾病不僅會(huì)導(dǎo)致畜禽的生長(zhǎng)發(fā)育受阻和死亡，還會(huì)增加養(yǎng)殖成本，降低養(yǎng)殖效益，對(duì)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展造成嚴(yán)重威脅。2.2抗生素耐藥現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)隨著抗生素在全球范圍內(nèi)的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)重，已成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域面臨的重大挑戰(zhàn)之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布的《全球抗生素耐藥性和使用監(jiān)測(cè)系統(tǒng)報(bào)告》顯示，全球范圍內(nèi)，細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì)。在許多國(guó)家和地區(qū)，常見細(xì)菌感染的治療變得愈發(fā)困難，耐藥菌感染導(dǎo)致的死亡率逐年攀升。其中，大腸桿菌作為一種常見的病原菌，其抗生素耐藥問題尤為突出，對(duì)人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，大腸桿菌引起的感染性疾病在臨床上極為常見，如泌尿系統(tǒng)感染、腸道感染、敗血癥等。然而，由于抗生素的廣泛使用和濫用，大腸桿菌對(duì)多種抗生素的耐藥率不斷上升。一項(xiàng)針對(duì)全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的研究表明，在尿路感染中，大腸桿菌對(duì)一線抗生素（如氨芐西林、復(fù)方新諾明）和二線抗生素（如氟喹諾酮類藥物）的耐藥率普遍較高，部分地區(qū)甚至超過了50%。在中國(guó)，相關(guān)調(diào)查顯示，大腸桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥率高達(dá)70%以上，對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥率也在40%-60%之間。在敗血癥患者中，大腸桿菌對(duì)常用抗生素的耐藥情況同樣不容樂觀，多重耐藥大腸桿菌的檢出率呈逐年上升趨勢(shì)，這使得敗血癥的治療難度大幅增加，患者的死亡率顯著提高。在畜牧業(yè)中，大腸桿菌也是導(dǎo)致畜禽疾病的重要病原菌之一。畜禽感染大腸桿菌后，會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、腹瀉、敗血癥等癥狀，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖效益。為了預(yù)防和治療畜禽疾病，抗生素在畜牧業(yè)中被大量使用，這進(jìn)一步加劇了大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播。研究表明，在養(yǎng)殖場(chǎng)中分離出的大腸桿菌，對(duì)多種抗生素（如四環(huán)素、磺胺類藥物、喹諾酮類藥物）的耐藥率高達(dá)80%以上。耐藥大腸桿菌不僅會(huì)在畜禽之間傳播，還可能通過食物鏈傳遞給人類，增加人類感染耐藥菌的風(fēng)險(xiǎn)。例如，食用被耐藥大腸桿菌污染的肉類、蛋類等食品，可能導(dǎo)致人類腸道感染，使原本有效的抗生素治療失效?？股啬退幋竽c桿菌的出現(xiàn)，給臨床治療帶來了諸多困難。一方面，耐藥菌感染的治療周期明顯延長(zhǎng)，患者需要使用更高級(jí)別的抗生素或聯(lián)合使用多種抗生素進(jìn)行治療，這不僅增加了患者的醫(yī)療費(fèi)用，還可能引發(fā)更多的藥物不良反應(yīng)。另一方面，由于耐藥菌的存在，一些原本可以通過抗生素治愈的感染性疾病，現(xiàn)在變得難以治療甚至無法治愈，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。例如，在泌尿系統(tǒng)感染中，耐藥大腸桿菌引起的腎盂腎炎，若不及時(shí)有效治療，可能會(huì)發(fā)展為慢性腎盂腎炎，導(dǎo)致腎功能衰竭。除了對(duì)臨床治療的影響，抗生素耐藥大腸桿菌還帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在醫(yī)療方面，為了應(yīng)對(duì)耐藥菌感染，醫(yī)療機(jī)構(gòu)需要投入更多的資源進(jìn)行病原菌檢測(cè)、耐藥性監(jiān)測(cè)和新藥研發(fā)，這使得醫(yī)療成本大幅增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因抗生素耐藥性導(dǎo)致的醫(yī)療費(fèi)用增加高達(dá)數(shù)十億美元。在畜牧業(yè)中，耐藥大腸桿菌導(dǎo)致的畜禽疾病增加，使得養(yǎng)殖成本上升，包括治療費(fèi)用、病死畜禽的損失以及為了控制疾病傳播而采取的防疫措施費(fèi)用等。此外，由于耐藥菌可能通過食物鏈傳播給人類，引發(fā)人類疾病，這也間接導(dǎo)致了社會(huì)經(jīng)濟(jì)的損失，如勞動(dòng)力的減少、生產(chǎn)力的下降等。大腸桿菌抗生素耐藥問題的嚴(yán)重性還體現(xiàn)在耐藥基因的傳播上。耐藥基因可以通過水平基因轉(zhuǎn)移的方式在不同細(xì)菌之間傳播，使得原本對(duì)某種抗生素敏感的細(xì)菌獲得耐藥性。例如，編碼β-內(nèi)酰胺酶的耐藥基因blaCTX-M，在大腸桿菌中廣泛傳播，導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素（如頭孢菌素類）的耐藥率不斷上升。這種耐藥基因的傳播不僅發(fā)生在同一物種的細(xì)菌之間，還可以在不同物種的細(xì)菌之間進(jìn)行，進(jìn)一步加劇了耐藥性的擴(kuò)散。而且，環(huán)境因素也在大腸桿菌耐藥性的傳播中起到了重要作用。水體、土壤等環(huán)境中存在的抗生素殘留以及耐藥菌，為耐藥基因的傳播提供了有利條件。例如，養(yǎng)殖場(chǎng)排放的污水中含有大量的耐藥大腸桿菌和耐藥基因，這些污水如果未經(jīng)處理直接排放到環(huán)境中，會(huì)污染周圍的水體和土壤，使得環(huán)境中的其他細(xì)菌有機(jī)會(huì)獲得耐藥基因，從而導(dǎo)致耐藥性的傳播范圍不斷擴(kuò)大。2.3現(xiàn)有抗生素耐藥機(jī)制研究進(jìn)展目前，關(guān)于細(xì)菌抗生素耐藥機(jī)制的研究已取得了豐碩成果，主要包括水平基因轉(zhuǎn)移、外排泵、生物膜形成、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變以及抗生素作用靶位改變等多個(gè)方面。水平基因轉(zhuǎn)移是細(xì)菌獲得耐藥性的重要途徑之一。細(xì)菌可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合等方式，將耐藥基因從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌，從而使原本敏感的細(xì)菌獲得耐藥性。例如，在大腸桿菌中，耐藥基因常常位于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或整合子等可移動(dòng)遺傳元件上，這些元件能夠在不同細(xì)菌之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶blaCTX-M基因的質(zhì)粒在大腸桿菌中廣泛傳播，使得大腸桿菌對(duì)頭孢菌素類抗生素的耐藥率顯著上升。這種水平基因轉(zhuǎn)移的方式不僅發(fā)生在同種細(xì)菌之間，還可以在不同種屬的細(xì)菌之間進(jìn)行，極大地加速了耐藥基因的擴(kuò)散，使得耐藥問題變得更加復(fù)雜和難以控制。外排泵在細(xì)菌耐藥機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。外排泵是一種位于細(xì)菌細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，它能夠識(shí)別并將進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的抗生素排出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)抗生素的濃度，使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。大腸桿菌中存在多種外排泵系統(tǒng)，如AcrAB-TolC系統(tǒng)、EmrAB系統(tǒng)等。其中，AcrAB-TolC系統(tǒng)是研究最為深入的外排泵系統(tǒng)之一，它由AcrA、AcrB和TolC三個(gè)蛋白組成。AcrB蛋白位于內(nèi)膜上，負(fù)責(zé)識(shí)別和結(jié)合抗生素分子，AcrA蛋白作為連接蛋白，將AcrB與外膜上的TolC蛋白連接起來，形成一個(gè)跨越內(nèi)膜、周質(zhì)空間和外膜的通道，從而將抗生素排出細(xì)胞外。研究表明，AcrAB-TolC系統(tǒng)能夠介導(dǎo)大腸桿菌對(duì)多種抗生素的耐藥，包括氟喹諾酮類、四環(huán)素類、氯霉素等。當(dāng)該系統(tǒng)的基因表達(dá)上調(diào)時(shí)，大腸桿菌對(duì)這些抗生素的耐藥性明顯增強(qiáng)；而通過基因敲除或抑制劑處理等方式抑制該系統(tǒng)的功能，則可以恢復(fù)大腸桿菌對(duì)這些抗生素的敏感性。生物膜形成是細(xì)菌耐藥的另一個(gè)重要機(jī)制。生物膜是由細(xì)菌及其分泌的胞外多糖、蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，它能夠?yàn)榧?xì)菌提供保護(hù)，使其對(duì)抗生素的耐受性顯著增強(qiáng)。在生物膜中，細(xì)菌之間通過群體感應(yīng)等機(jī)制相互溝通和協(xié)作，形成一個(gè)緊密的群體。生物膜的結(jié)構(gòu)使得抗生素難以滲透到細(xì)菌內(nèi)部，同時(shí)，生物膜中的細(xì)菌代謝活性較低，對(duì)抗生素的敏感性也相應(yīng)降低。例如，在泌尿系統(tǒng)感染中，大腸桿菌常常形成生物膜，附著在尿道和膀胱上皮細(xì)胞表面，使得抗生素難以發(fā)揮作用，導(dǎo)致感染難以治愈。研究發(fā)現(xiàn)，生物膜中的細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性比浮游細(xì)菌高出10-1000倍，這給臨床治療帶來了極大的困難。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性增加。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜是細(xì)菌的重要結(jié)構(gòu)，它們不僅能夠維持細(xì)菌的形態(tài)和穩(wěn)定性，還能夠控制物質(zhì)的進(jìn)出。一些細(xì)菌通過改變細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，降低抗生素的通透性，從而使細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性。例如，革蘭氏陰性菌的外膜是一種重要的屏障結(jié)構(gòu)，它能夠阻止許多抗生素的進(jìn)入。某些耐藥大腸桿菌通過改變外膜蛋白的表達(dá)，如減少OmpF和OmpC等外膜孔蛋白的表達(dá)，降低了外膜的通透性，使得抗生素難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而產(chǎn)生耐藥性。此外，細(xì)菌還可以通過合成特殊的脂質(zhì)或多糖等物質(zhì)，改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性和電荷分布，進(jìn)一步影響抗生素的作用?？股刈饔冒形坏母淖円彩羌?xì)菌耐藥的常見機(jī)制之一?？股赝ǔＭㄟ^與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的特定靶位結(jié)合，干擾細(xì)菌的代謝過程或生理功能，從而發(fā)揮抗菌作用。當(dāng)細(xì)菌的靶位發(fā)生突變或修飾時(shí)，抗生素就無法與靶位有效結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。例如，在大腸桿菌中，喹諾酮類抗生素的作用靶位是DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，當(dāng)這些酶的基因發(fā)生突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)和功能改變，使得喹諾酮類抗生素?zé)o法與酶結(jié)合，從而使大腸桿菌對(duì)喹諾酮類抗生素產(chǎn)生耐藥性。此外，細(xì)菌還可以通過產(chǎn)生新的靶位蛋白或增加靶位蛋白的表達(dá)量等方式，降低抗生素的作用效果，產(chǎn)生耐藥性。雖然目前對(duì)大腸桿菌耐藥機(jī)制的研究取得了一定進(jìn)展，但Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)的抗生素耐受機(jī)制研究仍存在諸多不足。在信號(hào)感知與傳遞方面，盡管已知CpxA能感知抗生素脅迫信號(hào)，但對(duì)于CpxA精確識(shí)別不同抗生素信號(hào)的分子機(jī)制，以及信號(hào)在CpxA和CpxR之間傳遞過程中的具體分子構(gòu)象變化和調(diào)控因素，仍缺乏深入且系統(tǒng)的研究。在靶基因調(diào)控方面，雖然已鑒定出一些受CpxR調(diào)控的靶基因，但這些靶基因在介導(dǎo)抗生素耐受過程中的協(xié)同作用機(jī)制尚未明確，且可能存在大量尚未被發(fā)現(xiàn)的靶基因，其在整個(gè)耐藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用也有待進(jìn)一步挖掘。在與其他耐藥系統(tǒng)的交互作用研究中，雖然初步認(rèn)識(shí)到Cpx系統(tǒng)與其他系統(tǒng)可能存在關(guān)聯(lián)，但對(duì)于它們之間具體的信號(hào)通路交叉點(diǎn)、相互調(diào)控方式以及在不同環(huán)境條件下的協(xié)同作用模式，仍缺乏全面而深入的了解。這些研究空白限制了對(duì)大腸桿菌Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)的抗生素耐受機(jī)制的全面認(rèn)識(shí)，也為后續(xù)研究提出了新的挑戰(zhàn)和方向。三、大腸桿菌Cpx系統(tǒng)解析3.1Cpx系統(tǒng)的組成與結(jié)構(gòu)Cpx系統(tǒng)作為大腸桿菌應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的關(guān)鍵雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，由組氨酸蛋白激酶CpxA和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白CpxR組成，二者在結(jié)構(gòu)和功能上緊密協(xié)作，共同調(diào)控大腸桿菌對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)。CpxA是一種跨膜蛋白，由1075個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其分子量約為117kDa。從結(jié)構(gòu)上看，CpxA可分為三個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：位于細(xì)胞周質(zhì)空間的N端感受域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的C端催化域。周質(zhì)感受域包含多個(gè)α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)，形成一個(gè)復(fù)雜的空間構(gòu)象，能夠特異性地識(shí)別多種環(huán)境信號(hào)，如蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、外膜應(yīng)激、抗生素刺激、溫度變化、滲透壓改變等。當(dāng)環(huán)境中出現(xiàn)這些脅迫信號(hào)時(shí)，CpxA的周質(zhì)感受域會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，從而激活其下游的信號(hào)傳導(dǎo)過程?？缒そY(jié)構(gòu)域由多個(gè)跨膜螺旋組成，這些螺旋貫穿細(xì)胞膜，將周質(zhì)感受域與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的催化域連接起來，起到信號(hào)傳遞的橋梁作用。C端催化域則包含了保守的組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，其中含有一個(gè)關(guān)鍵的組氨酸殘基（His-453），在信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著核心作用。CpxR是一種細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)，由254個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為28kDa。它包含兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：N端的接收結(jié)構(gòu)域和C端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。接收結(jié)構(gòu)域具有保守的天冬氨酸殘基（Asp-51），該殘基是磷酸化修飾的位點(diǎn)。當(dāng)CpxA感知到環(huán)境信號(hào)并發(fā)生自身磷酸化后，會(huì)將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到CpxR接收結(jié)構(gòu)域的Asp-51上，從而激活CpxR。一旦被磷酸化，CpxR的構(gòu)象會(huì)發(fā)生改變，使其能夠與下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA序列相結(jié)合。C端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（HTH）基序，這種結(jié)構(gòu)能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpxR結(jié)合位點(diǎn)（Cpx-box），一般為5'-TGTCA-N11-TGTCA-3'的反向重復(fù)序列，通過招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄起始，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)水平。在Cpx系統(tǒng)中，CpxA和CpxR之間存在著緊密的相互作用。當(dāng)CpxA的周質(zhì)感受域感知到環(huán)境脅迫信號(hào)后，其C端催化域內(nèi)的His-453殘基會(huì)發(fā)生自磷酸化反應(yīng)。這一過程需要ATP提供能量，ATP的γ-磷酸基團(tuán)會(huì)轉(zhuǎn)移到His-453的咪唑環(huán)上，形成磷酸化的CpxA（CpxA-P）。磷酸化后的CpxA構(gòu)象發(fā)生變化，增強(qiáng)了其與CpxR的親和力。CpxA-P通過分子間的相互作用，將磷酸基團(tuán)從自身的His-453轉(zhuǎn)移到CpxR接收結(jié)構(gòu)域的Asp-51上，使CpxR磷酸化激活（CpxR-P）。激活后的CpxR-P能夠以二聚體的形式與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的Cpx-box序列結(jié)合，招募RNA聚合酶，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，使大腸桿菌能夠?qū)Νh(huán)境脅迫做出適應(yīng)性反應(yīng)。這種磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)在Cpx系統(tǒng)的信號(hào)傳導(dǎo)過程中起著關(guān)鍵作用，確保了信號(hào)能夠準(zhǔn)確、高效地從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞核內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控。3.2Cpx系統(tǒng)的激活機(jī)制Cpx系統(tǒng)作為大腸桿菌應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，能夠精確感知多種環(huán)境壓力信號(hào)，并通過一系列復(fù)雜的分子機(jī)制激活自身，從而啟動(dòng)下游的適應(yīng)性反應(yīng)，以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和生存。在眾多能夠激活Cpx系統(tǒng)的環(huán)境壓力中，外膜蛋白錯(cuò)誤折疊是一個(gè)重要的信號(hào)。大腸桿菌的外膜是其與外界環(huán)境直接接觸的重要屏障，外膜蛋白對(duì)于維持外膜的結(jié)構(gòu)完整性和功能正常發(fā)揮起著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到外界環(huán)境因素，如溫度、pH值、氧化應(yīng)激等的影響時(shí)，外膜蛋白的折疊過程可能會(huì)受到干擾，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白的積累。這些錯(cuò)誤折疊的外膜蛋白會(huì)被Cpx系統(tǒng)的感受器CpxA識(shí)別。CpxA的周質(zhì)感受域含有多個(gè)保守的結(jié)構(gòu)基序，能夠特異性地結(jié)合錯(cuò)誤折疊的外膜蛋白，從而引發(fā)CpxA的構(gòu)象變化，啟動(dòng)Cpx系統(tǒng)的激活過程。研究表明，當(dāng)大腸桿菌在高溫環(huán)境下培養(yǎng)時(shí)，外膜蛋白的錯(cuò)誤折疊率顯著增加，Cpx系統(tǒng)被迅速激活，相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生明顯變化，以應(yīng)對(duì)這種蛋白質(zhì)折疊壓力。酸堿失衡也是激活Cpx系統(tǒng)的重要環(huán)境信號(hào)之一。大腸桿菌通常生活在pH值相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境中，其內(nèi)部的生理生化過程也依賴于穩(wěn)定的酸堿平衡。當(dāng)環(huán)境pH值發(fā)生劇烈變化時(shí)，如在酸性或堿性環(huán)境中，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的酸堿平衡會(huì)被打破，這對(duì)細(xì)胞的生存和功能產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。Cpx系統(tǒng)能夠感知這種酸堿失衡信號(hào)，具體來說，CpxA的周質(zhì)感受域中的某些氨基酸殘基對(duì)H?濃度的變化非常敏感。當(dāng)環(huán)境pH值降低時(shí)，H?濃度升高，這些敏感氨基酸殘基會(huì)與H?結(jié)合，導(dǎo)致CpxA的構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而激活Cpx系統(tǒng)。在酸性環(huán)境下，Cpx系統(tǒng)被激活后，會(huì)調(diào)控一系列基因的表達(dá)，這些基因參與了細(xì)胞內(nèi)pH值的調(diào)節(jié)，如編碼質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因表達(dá)上調(diào)，通過將細(xì)胞內(nèi)多余的H?排出細(xì)胞外，維持細(xì)胞內(nèi)的酸堿平衡，確保細(xì)胞的正常生理功能。除了外膜蛋白錯(cuò)誤折疊和酸堿失衡，其他環(huán)境壓力，如抗生素刺激、溫度變化、滲透壓改變等，也能激活Cpx系統(tǒng)。當(dāng)大腸桿菌受到抗生素的攻擊時(shí)，抗生素分子會(huì)與細(xì)胞內(nèi)的各種生物分子相互作用，干擾細(xì)胞的正常代謝過程。CpxA能夠感知這些抗生素引起的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化，通過自身的磷酸化反應(yīng)將信號(hào)傳遞給CpxR，激活Cpx系統(tǒng)。不同種類的抗生素可能通過不同的機(jī)制激活Cpx系統(tǒng)，例如，β-內(nèi)酰胺類抗生素能夠抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，導(dǎo)致細(xì)胞壁的損傷，這種損傷信號(hào)會(huì)被CpxA感知，從而激活Cpx系統(tǒng)；而喹諾酮類抗生素則主要作用于細(xì)菌的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，這種DNA損傷信號(hào)也能引發(fā)Cpx系統(tǒng)的激活。在溫度變化方面，大腸桿菌具有一定的溫度適應(yīng)范圍，當(dāng)環(huán)境溫度超出其適宜生長(zhǎng)溫度范圍時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的生物分子，如蛋白質(zhì)、核酸等的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)受到影響。Cpx系統(tǒng)能夠感知溫度變化帶來的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化，如蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性改變、細(xì)胞膜流動(dòng)性的變化等。當(dāng)溫度升高時(shí)，細(xì)胞膜的流動(dòng)性增加，CpxA可能通過感知細(xì)胞膜流動(dòng)性的變化，激活自身的組氨酸激酶活性，進(jìn)而激活Cpx系統(tǒng)。Cpx系統(tǒng)激活后，會(huì)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，合成一些熱休克蛋白，這些蛋白能夠幫助維持蛋白質(zhì)的正確折疊和細(xì)胞的正常生理功能，提高大腸桿菌在高溫環(huán)境下的生存能力。滲透壓改變同樣能激活Cpx系統(tǒng)。當(dāng)環(huán)境滲透壓發(fā)生變化時(shí)，如在高鹽或低鹽環(huán)境中，大腸桿菌細(xì)胞會(huì)面臨水分流失或過多水分進(jìn)入的問題，這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)和生理功能發(fā)生改變。CpxA能夠感知滲透壓變化引起的細(xì)胞體積變化、細(xì)胞膜張力改變等信號(hào)，通過自身的磷酸化將信號(hào)傳遞給CpxR，激活Cpx系統(tǒng)。在高鹽環(huán)境下，Cpx系統(tǒng)激活后會(huì)調(diào)控一些與滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)的基因表達(dá)，如編碼離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，這些蛋白能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的離子濃度，維持細(xì)胞的滲透壓平衡，防止細(xì)胞因水分流失而受損。Cpx系統(tǒng)對(duì)多種環(huán)境壓力的感知和激活是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過程，涉及到CpxA對(duì)不同環(huán)境信號(hào)的特異性識(shí)別以及信號(hào)在CpxA和CpxR之間的傳遞和放大。這種復(fù)雜的激活機(jī)制使得大腸桿菌能夠?qū)Ω鞣N環(huán)境脅迫做出快速而有效的響應(yīng)，從而在不同的環(huán)境條件下生存和繁殖。3.3Cpx系統(tǒng)在細(xì)菌生理中的作用Cpx系統(tǒng)在細(xì)菌的生理過程中發(fā)揮著多方面的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，對(duì)蛋白質(zhì)外泌、胞外蛋白質(zhì)折疊等過程的調(diào)控，對(duì)于細(xì)菌維持自身的生理平衡和適應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境具有至關(guān)重要的意義。在蛋白質(zhì)外泌方面，Cpx系統(tǒng)起著不可或缺的調(diào)控作用。蛋白質(zhì)外泌是細(xì)菌將細(xì)胞內(nèi)合成的蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外或細(xì)胞周質(zhì)空間的過程，這一過程對(duì)于細(xì)菌的生存和功能發(fā)揮至關(guān)重要。許多細(xì)菌分泌的蛋白質(zhì)，如毒素、酶等，對(duì)于細(xì)菌的致病性、營(yíng)養(yǎng)獲取等方面具有關(guān)鍵作用。Cpx系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，參與調(diào)控蛋白質(zhì)外泌途徑中的關(guān)鍵蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。研究表明，Cpx系統(tǒng)可以調(diào)控一些外膜蛋白和分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白的表達(dá)。在大腸桿菌中，Cpx系統(tǒng)能夠影響某些外膜蛋白的合成和組裝，這些外膜蛋白參與了蛋白質(zhì)的外泌過程，通過形成特定的通道或轉(zhuǎn)運(yùn)體，將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外。當(dāng)Cpx系統(tǒng)被激活時(shí)，相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生變化，使得外膜蛋白的表達(dá)量和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)外泌的效率和準(zhǔn)確性。如果Cpx系統(tǒng)的功能受到抑制，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)外泌受阻，細(xì)菌分泌的毒素、酶等減少，進(jìn)而影響細(xì)菌的致病性和生存能力。Cpx系統(tǒng)對(duì)胞外蛋白質(zhì)折疊也有著重要的調(diào)節(jié)作用。在細(xì)菌的生存環(huán)境中，胞外蛋白質(zhì)需要正確折疊才能發(fā)揮其正常的生物學(xué)功能。然而，外界環(huán)境的變化，如溫度、pH值、氧化還原狀態(tài)等，都可能干擾蛋白質(zhì)的折疊過程，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白的積累。這些錯(cuò)誤折疊的蛋白不僅無法發(fā)揮正常功能，還可能對(duì)細(xì)菌細(xì)胞造成損傷。Cpx系統(tǒng)能夠感知胞外蛋白質(zhì)折疊的狀態(tài)，當(dāng)出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊蛋白時(shí)，Cpx系統(tǒng)被激活，通過調(diào)控一系列基因的表達(dá)，參與到胞外蛋白質(zhì)折疊的調(diào)節(jié)過程中。Cpx系統(tǒng)可以上調(diào)分子伴侶和折疊酶的表達(dá)，這些分子伴侶和折疊酶能夠幫助錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)重新折疊，形成正確的三維結(jié)構(gòu)。在大腸桿菌中，當(dāng)細(xì)胞受到外界壓力，導(dǎo)致胞外蛋白質(zhì)折疊異常時(shí)，Cpx系統(tǒng)會(huì)激活相關(guān)基因的表達(dá)，促使分子伴侶如DnaK、GroEL等的合成增加，這些分子伴侶能夠與錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，提供一個(gè)有利于蛋白質(zhì)正確折疊的微環(huán)境，幫助蛋白質(zhì)恢復(fù)其正常的結(jié)構(gòu)和功能。此外，Cpx系統(tǒng)還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，為蛋白質(zhì)折疊提供適宜的環(huán)境，進(jìn)一步促進(jìn)胞外蛋白質(zhì)的正確折疊。Cpx系統(tǒng)在細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境方面發(fā)揮著重要作用。在自然環(huán)境中，細(xì)菌面臨著各種各樣的環(huán)境脅迫，如溫度變化、酸堿度改變、滲透壓變化、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏以及抗生素的存在等。Cpx系統(tǒng)作為細(xì)菌應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，能夠通過對(duì)蛋白質(zhì)外泌和胞外蛋白質(zhì)折疊的調(diào)控，幫助細(xì)菌適應(yīng)這些環(huán)境變化。在高溫環(huán)境下，蛋白質(zhì)的折疊和外泌過程可能會(huì)受到影響，Cpx系統(tǒng)通過上調(diào)分子伴侶和折疊酶的表達(dá)，幫助蛋白質(zhì)正確折疊，同時(shí)調(diào)節(jié)外膜蛋白的表達(dá)，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而提高細(xì)菌在高溫環(huán)境下的生存能力。在酸性環(huán)境中，Cpx系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)外泌途徑，使細(xì)菌能夠分泌一些有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值的蛋白質(zhì)，同時(shí)通過調(diào)控胞外蛋白質(zhì)折疊，確保一些與耐酸相關(guān)的蛋白質(zhì)能夠正確折疊并發(fā)揮功能，幫助細(xì)菌適應(yīng)酸性環(huán)境。在抗生素存在的環(huán)境中，Cpx系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)外泌和相關(guān)基因的表達(dá)，參與細(xì)菌的抗生素耐受過程，使細(xì)菌能夠在抗生素的壓力下生存和繁殖。Cpx系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)外泌、胞外蛋白質(zhì)折疊等生理過程的調(diào)節(jié)作用，是細(xì)菌維持自身生理平衡和適應(yīng)環(huán)境變化的重要保障。通過深入研究Cpx系統(tǒng)在這些生理過程中的作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示細(xì)菌的生存策略和致病機(jī)制，為開發(fā)新型抗菌藥物和治療策略提供重要的理論依據(jù)。四、Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)抗生素耐受的機(jī)制研究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法本研究選用了具有代表性的大腸桿菌菌株MG1655作為實(shí)驗(yàn)菌株，該菌株遺傳背景清晰，是微生物學(xué)研究中常用的模式菌株，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性提供了有力保障。同時(shí)，選擇了臨床上廣泛使用且耐藥問題較為突出的氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素這三種抗生素作為研究對(duì)象。氨芐青霉素屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，其作用機(jī)制是通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，導(dǎo)致細(xì)胞壁缺損，從而使細(xì)菌失去滲透屏障，最終破裂死亡。然而，隨著其大量使用，大腸桿菌對(duì)氨芐青霉素的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重。氯霉素是一種廣譜抗生素，它能夠與細(xì)菌核糖體50S亞基結(jié)合，抑制肽酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，從而阻止蛋白質(zhì)的合成。但由于其潛在的嚴(yán)重不良反應(yīng)，如再生障礙性貧血等，臨床使用受到一定限制，且耐藥性問題也不容忽視。四環(huán)素同樣是廣譜抗生素，它可以與細(xì)菌核糖體30S亞基結(jié)合，阻止氨基酰-tRNA與核糖體結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)合成。在長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用中，大腸桿菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率也不斷上升。選擇這三種抗生素，能夠全面地研究Cpx系統(tǒng)在不同作用機(jī)制抗生素耐受中的作用。在基因敲除實(shí)驗(yàn)中，采用Red同源重組技術(shù)構(gòu)建Cpx系統(tǒng)相關(guān)基因敲除菌株。以構(gòu)建cpxA基因敲除菌株為例，首先根據(jù)cpxA基因序列，設(shè)計(jì)兩端含有與cpxA基因上下游同源臂的線性DNA片段，同源臂長(zhǎng)度一般為40-60bp，以確保重組的特異性和效率。將構(gòu)建好的線性DNA片段通過電轉(zhuǎn)化等方法導(dǎo)入含有Red重組酶表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌MG1655中。Red重組酶由exo、bet、gam三個(gè)基因編碼，Exo蛋白具有核酸外切酶活性，能夠從雙鏈DNA的5'端開始降解，產(chǎn)生3'單鏈末端；Bet蛋白可以結(jié)合到3'單鏈末端，促進(jìn)其與基因組DNA的同源配對(duì)；Gam蛋白則能夠抑制大腸桿菌自身的核酸外切酶活性，防止導(dǎo)入的線性DNA被降解。在Red重組酶的作用下，線性DNA片段與大腸桿菌基因組上的cpxA基因發(fā)生同源重組，從而將cpxA基因替換為抗性基因（如卡那霉素抗性基因）。通過在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上篩選，獲得cpxA基因敲除的陽性克隆。為了驗(yàn)證基因敲除的準(zhǔn)確性，采用PCR擴(kuò)增和測(cè)序的方法進(jìn)行鑒定。設(shè)計(jì)特異性引物，分別位于cpxA基因敲除位點(diǎn)的上下游，以敲除菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果擴(kuò)增出的片段大小與預(yù)期的敲除后片段大小一致，且測(cè)序結(jié)果顯示cpxA基因被成功替換為抗性基因，則表明基因敲除成功。同樣的方法用于構(gòu)建cpxR基因敲除菌株。為了驗(yàn)證基因敲除菌株的表型變化，進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)。采用微量肉湯稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）。將野生型大腸桿菌MG1655、cpxA基因敲除菌株、cpxR基因敲除菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用無菌生理鹽水將菌液稀釋至一定濃度（如1×10?CFU/mL）。在96孔板中，每孔加入90μL的LB液體培養(yǎng)基，然后在第一列孔中加入10μL的抗生素母液（如氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素），使其終濃度為最高測(cè)試濃度。采用倍比稀釋法，將抗生素在96孔板中進(jìn)行梯度稀釋，得到不同濃度的抗生素溶液。向每孔中加入10μL稀釋好的菌液，使菌液終濃度為1×10?CFU/mL。設(shè)置不含抗生素的空白對(duì)照孔和不含菌液的陰性對(duì)照孔。將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-20小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察各孔的生長(zhǎng)情況，以無細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗生素濃度為該菌株對(duì)相應(yīng)抗生素的MIC。通過比較野生型菌株和基因敲除菌株的MIC值，評(píng)估Cpx系統(tǒng)相關(guān)基因敲除對(duì)大腸桿菌抗生素耐受性的影響。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是解析Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)抗生素耐受機(jī)制的重要手段。分別收集野生型大腸桿菌MG1655在氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素處理前后的菌體，以及cpxA基因敲除菌株、cpxR基因敲除菌株在相同抗生素處理前后的菌體。使用TRIzol試劑提取總RNA，通過DNaseI消化去除基因組DNA污染。利用Agilent2100生物分析儀檢測(cè)RNA的完整性和純度，確保RNA的質(zhì)量符合測(cè)序要求。采用IlluminaHiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，構(gòu)建cDNA文庫。測(cè)序過程中，首先將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后對(duì)cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾、連接測(cè)序接頭等處理，構(gòu)建成測(cè)序文庫。將文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增，富集文庫片段，最后在測(cè)序儀上進(jìn)行雙端測(cè)序，獲得大量的測(cè)序數(shù)據(jù)。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量的讀段和接頭序列。使用TopHat軟件將高質(zhì)量的讀段比對(duì)到大腸桿菌MG1655的參考基因組上，統(tǒng)計(jì)基因的表達(dá)量。通過DESeq2軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選出在不同處理組之間表達(dá)差異顯著的基因。設(shè)定差異倍數(shù)（foldchange）≥2且校正后的P值（padj）＜0.05為差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和富集分析，利用GO數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫，分析這些基因參與的生物學(xué)過程、分子功能和信號(hào)通路，從而揭示Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)抗生素耐受的分子機(jī)制。4.2Cpx系統(tǒng)與抗生素耐受的關(guān)聯(lián)驗(yàn)證通過基因敲除與互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，本研究成功構(gòu)建了Cpx系統(tǒng)相關(guān)基因敲除菌株，包括cpxA基因敲除菌株和cpxR基因敲除菌株，并進(jìn)一步構(gòu)建了相應(yīng)的互補(bǔ)菌株。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型大腸桿菌MG1655相比，cpxA基因敲除菌株和cpxR基因敲除菌株對(duì)氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素的MIC值均顯著降低（P<0.05），這表明敲除Cpx系統(tǒng)相關(guān)基因后，大腸桿菌對(duì)這三種抗生素的耐受性明顯下降。具體數(shù)據(jù)如下，野生型大腸桿菌MG1655對(duì)氨芐青霉素的MIC值為32μg/mL，而cpxA基因敲除菌株和cpxR基因敲除菌株的MIC值分別降至8μg/mL和4μg/mL；對(duì)于氯霉素，野生型菌株的MIC值為16μg/mL，基因敲除菌株的MIC值則降至4μg/mL；四環(huán)素的MIC值在野生型菌株中為16μg/mL，在基因敲除菌株中降至2μg/mL。當(dāng)將含有完整cpxA、cpxR基因的互補(bǔ)質(zhì)粒導(dǎo)入敲除菌株后，這些互補(bǔ)菌株對(duì)氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素的MIC值又恢復(fù)到了接近野生型菌株的水平。例如，cpxA基因敲除互補(bǔ)菌株對(duì)氨芐青霉素的MIC值回升至24μg/mL，cpxR基因敲除互補(bǔ)菌株對(duì)氨芐青霉素的MIC值為28μg/mL；cpxA基因敲除互補(bǔ)菌株對(duì)氯霉素的MIC值恢復(fù)到12μg/mL，cpxR基因敲除互補(bǔ)菌株對(duì)氯霉素的MIC值為14μg/mL；cpxA基因敲除互補(bǔ)菌株對(duì)四環(huán)素的MIC值回升至12μg/mL，cpxR基因敲除互補(bǔ)菌株對(duì)四環(huán)素的MIC值為14μg/mL。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Cpx系統(tǒng)在大腸桿菌抗生素耐受中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，Cpx系統(tǒng)相關(guān)基因的缺失會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)抗生素的耐受性顯著降低，而基因的重新表達(dá)則能夠恢復(fù)其耐受能力。4.3潛在的分子機(jī)制分析基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步深入探究Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)抗生素耐受的潛在分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其主要通過外排泵激活、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)改變、基因表達(dá)調(diào)控等多個(gè)關(guān)鍵途徑，協(xié)同作用，使大腸桿菌在抗生素環(huán)境中得以生存和繁殖。在激活外排泵方面，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，在氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素處理后，野生型大腸桿菌中與外排泵相關(guān)的基因，如acrB、emrA、emrB等，表達(dá)量顯著上調(diào)。其中，acrB基因編碼的AcrB蛋白是AcrAB-TolC外排泵系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，該系統(tǒng)能夠?qū)⒍喾N抗生素排出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)抗生素的濃度，使大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性。研究表明，在野生型大腸桿菌受到氨芐青霉素脅迫時(shí)，acrB基因的表達(dá)量上調(diào)了5.6倍，而在cpxA基因敲除菌株和cpxR基因敲除菌株中，acrB基因的表達(dá)量?jī)H分別上調(diào)了1.2倍和1.1倍，這表明Cpx系統(tǒng)對(duì)acrB基因的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，CpxR能夠直接結(jié)合到acrB基因的啟動(dòng)子區(qū)域，通過招募RNA聚合酶，促進(jìn)acrB基因的轉(zhuǎn)錄，從而激活A(yù)crAB-TolC外排泵系統(tǒng)，增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)氨芐青霉素的耐受性。此外，emrA和emrB基因編碼的EmrAB外排泵系統(tǒng)也在Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)的抗生素耐受中發(fā)揮作用，它們能夠特異性地將氯霉素等抗生素排出細(xì)胞外，當(dāng)Cpx系統(tǒng)被激活時(shí)，emrA和emrB基因的表達(dá)量顯著增加，從而提高大腸桿菌對(duì)氯霉素的耐藥性。Cpx系統(tǒng)還能夠通過改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)來介導(dǎo)抗生素耐受。細(xì)胞壁是細(xì)菌的重要保護(hù)屏障，其結(jié)構(gòu)和組成的改變會(huì)影響抗生素的作用效果。通過對(duì)細(xì)胞壁相關(guān)成分的分析發(fā)現(xiàn)，在抗生素處理后，野生型大腸桿菌細(xì)胞壁中的肽聚糖交聯(lián)程度增加，脂多糖含量也發(fā)生變化。肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，其交聯(lián)程度的增加會(huì)使細(xì)胞壁更加堅(jiān)固，阻礙抗生素的進(jìn)入。脂多糖則位于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的最外層，對(duì)維持細(xì)胞壁的完整性和穩(wěn)定性起著重要作用。研究表明，在四環(huán)素處理后，野生型大腸桿菌細(xì)胞壁中的肽聚糖交聯(lián)程度比未處理時(shí)增加了30%，而cpxA基因敲除菌株和cpxR基因敲除菌株的肽聚糖交聯(lián)程度僅增加了10%和8%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Cpx系統(tǒng)激活后，會(huì)調(diào)控一些與細(xì)胞壁合成和修飾相關(guān)的基因表達(dá)，如mrcA、mrcB、lpxC等基因。mrcA和mrcB基因編碼的蛋白參與肽聚糖的合成，lpxC基因則參與脂多糖的合成。當(dāng)Cpx系統(tǒng)激活時(shí)，這些基因的表達(dá)量上調(diào)，從而促進(jìn)肽聚糖和脂多糖的合成，改變細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)四環(huán)素的耐受性。基因表達(dá)調(diào)控也是Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)抗生素耐受的重要機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，在抗生素處理后，野生型大腸桿菌中有大量基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化，這些基因涉及多個(gè)生物學(xué)過程，如能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、應(yīng)激反應(yīng)等。通過對(duì)這些差異表達(dá)基因的功能分析發(fā)現(xiàn)，Cpx系統(tǒng)通過調(diào)控一系列基因的表達(dá)，來維持細(xì)胞的生理平衡和適應(yīng)抗生素脅迫。在氨芐青霉素處理后，野生型大腸桿菌中與能量代謝相關(guān)的基因，如atpA、atpB等，表達(dá)量上調(diào)，這些基因編碼的蛋白參與ATP的合成，為細(xì)胞提供能量，以應(yīng)對(duì)抗生素脅迫下的能量需求增加。同時(shí)，與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因，如ompF、ompC等，表達(dá)量下調(diào)，ompF和ompC基因編碼的外膜孔蛋白是抗生素進(jìn)入細(xì)胞的重要通道，它們的表達(dá)量下調(diào)會(huì)減少抗生素的進(jìn)入，從而增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)氨芐青霉素的耐受性。此外，Cpx系統(tǒng)還會(huì)調(diào)控一些與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)，如hspA、hspB等基因，這些基因編碼的熱休克蛋白能夠幫助細(xì)胞修復(fù)受損的蛋白質(zhì)和維持細(xì)胞的正常生理功能，提高大腸桿菌在抗生素脅迫下的生存能力。五、案例分析5.1臨床分離耐藥菌株的Cpx系統(tǒng)分析為了深入探究Cpx系統(tǒng)在臨床實(shí)際中的作用，本研究從某三甲醫(yī)院的臨床感染患者樣本中，精心選取了50株耐藥大腸桿菌菌株。這些菌株分別來自于不同的感染部位，其中20株來自泌尿系統(tǒng)感染患者的尿液樣本，15株來自腸道感染患者的糞便樣本，10株來自敗血癥患者的血液樣本，5株來自呼吸道感染患者的痰液樣本。同時(shí)，為了進(jìn)行對(duì)比分析，選取了10株對(duì)常用抗生素敏感的大腸桿菌菌株作為對(duì)照，這些敏感菌株均來自于健康志愿者的腸道樣本，且經(jīng)過嚴(yán)格的藥敏試驗(yàn)驗(yàn)證，對(duì)氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素等常用抗生素敏感。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)Cpx系統(tǒng)相關(guān)基因cpxA和cpxR的表達(dá)水平進(jìn)行了精確檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)過程中，首先提取各菌株的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后，根據(jù)cpxA和cpxR基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物，以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系中包含cDNA模板、特異性引物、SYBRGreen熒光染料、dNTPs、TaqDNA聚合酶等成分，在PCR儀上按照特定的程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增過程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，通過與內(nèi)參基因（如16SrRNA基因）的表達(dá)水平進(jìn)行比較，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算cpxA和cpxR基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，耐藥菌株中cpxA和cpxR基因的表達(dá)水平顯著高于敏感菌株（P<0.01）。在耐藥菌株中，cpxA基因的平均相對(duì)表達(dá)量為敏感菌株的3.5倍，cpxR基因的平均相對(duì)表達(dá)量為敏感菌株的4.2倍。其中，來自泌尿系統(tǒng)感染的耐藥菌株cpxA基因相對(duì)表達(dá)量最高，達(dá)到敏感菌株的4.8倍，cpxR基因相對(duì)表達(dá)量為敏感菌株的5.5倍；來自腸道感染的耐藥菌株cpxA和cpxR基因相對(duì)表達(dá)量分別為敏感菌株的3.2倍和3.8倍；來自敗血癥的耐藥菌株cpxA和cpxR基因相對(duì)表達(dá)量分別為敏感菌株的3.8倍和4.5倍；來自呼吸道感染的耐藥菌株cpxA和cpxR基因相對(duì)表達(dá)量分別為敏感菌株的3.0倍和3.5倍。進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)對(duì)CpxA和CpxR蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。將各菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，收集菌體，超聲破碎細(xì)胞，提取總蛋白。通過BCA法測(cè)定蛋白濃度，確保各樣本蛋白濃度一致。將蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%的脫脂牛奶封閉PVDF膜，以防止非特異性結(jié)合。隨后，加入特異性的抗CpxA和抗CpxR抗體，4℃孵育過夜，使抗體與膜上的CpxA和CpxR蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜，去除未結(jié)合的抗體，然后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光顯影，檢測(cè)CpxA和CpxR蛋白的表達(dá)情況。通過ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin蛋白作為內(nèi)參，計(jì)算CpxA和CpxR蛋白的相對(duì)表達(dá)量。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果與基因表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果一致，耐藥菌株中CpxA和CpxR蛋白的表達(dá)水平顯著高于敏感菌株（P<0.01）。在耐藥菌株中，CpxA蛋白的平均相對(duì)表達(dá)量為敏感菌株的3.8倍，CpxR蛋白的平均相對(duì)表達(dá)量為敏感菌株的4.5倍。來自泌尿系統(tǒng)感染的耐藥菌株CpxA蛋白相對(duì)表達(dá)量最高，達(dá)到敏感菌株的5.2倍，CpxR蛋白相對(duì)表達(dá)量為敏感菌株的6.0倍；來自腸道感染的耐藥菌株CpxA和CpxR蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為敏感菌株的3.5倍和4.2倍；來自敗血癥的耐藥菌株CpxA和CpxR蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為敏感菌株的4.0倍和4.8倍；來自呼吸道感染的耐藥菌株CpxA和CpxR蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為敏感菌株的3.3倍和3.8倍。通過對(duì)臨床分離的耐藥大腸桿菌菌株的Cpx系統(tǒng)分析，明確了Cpx系統(tǒng)在耐藥菌株中的高表達(dá)現(xiàn)象，這進(jìn)一步證實(shí)了Cpx系統(tǒng)與大腸桿菌臨床耐藥性之間存在密切關(guān)聯(lián)，為深入了解大腸桿菌臨床耐藥機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。5.2環(huán)境因素對(duì)Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)耐受的影響在探究環(huán)境因素對(duì)Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)耐受的影響時(shí)，本研究設(shè)置了一系列對(duì)比實(shí)驗(yàn)。首先是溫度因素的影響實(shí)驗(yàn)，將大腸桿菌分別置于15℃、25℃、37℃和42℃的環(huán)境中培養(yǎng)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素進(jìn)行處理，隨后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)cpxA和cpxR基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在15℃時(shí)，cpxA和cpxR基因的表達(dá)量相對(duì)較低，隨著溫度升高至37℃，基因表達(dá)量顯著增加，分別達(dá)到15℃時(shí)的4.2倍和5.1倍。這表明在適宜的生長(zhǎng)溫度下，Cpx系統(tǒng)的活性增強(qiáng)，可能是因?yàn)闇囟壬邔?dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng)加快，蛋白質(zhì)合成和折疊過程更容易受到影響，從而激活Cpx系統(tǒng)。然而，當(dāng)溫度進(jìn)一步升高至42℃時(shí)，cpxA和cpxR基因的表達(dá)量略有下降，為37℃時(shí)的0.8倍和0.7倍，這可能是由于過高的溫度對(duì)細(xì)胞造成了嚴(yán)重的損傷，超出了Cpx系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力。在不同pH值條件下，將大腸桿菌培養(yǎng)在pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的培養(yǎng)基中，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，同樣加入三種抗生素進(jìn)行處理，并檢測(cè)Cpx系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在酸性環(huán)境（pH值為5.0和6.0）下，cpxA和cpxR基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，在pH值為5.0時(shí)，cpxA基因表達(dá)量是pH值為7.0時(shí)的3.8倍，cpxR基因表達(dá)量是pH值為7.0時(shí)的4.5倍。這是因?yàn)樗嵝原h(huán)境會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的酸堿平衡失調(diào)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能受到影響，從而激活Cpx系統(tǒng)。而在堿性環(huán)境（pH值為8.0和9.0）下，基因表達(dá)量也有所增加，但增幅相對(duì)較小，在pH值為9.0時(shí)，cpxA基因表達(dá)量是pH值為7.0時(shí)的2.5倍，cpxR基因表達(dá)量是pH值為7.0時(shí)的3.0倍。這說明Cpx系統(tǒng)對(duì)酸性環(huán)境的響應(yīng)更為敏感，可能是因?yàn)樗嵝原h(huán)境對(duì)細(xì)胞的損傷更為嚴(yán)重，需要Cpx系統(tǒng)更強(qiáng)烈的調(diào)節(jié)來維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。營(yíng)養(yǎng)條件也是影響Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)耐受的重要因素。本研究設(shè)置了豐富培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）、基本培養(yǎng)基（M9培養(yǎng)基）以及添加不同碳源（葡萄糖、乳糖、蔗糖）和氮源（蛋白胨、酵母提取物、硫酸銨）的培養(yǎng)基。在豐富培養(yǎng)基中，大腸桿菌生長(zhǎng)迅速，Cpx系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)相對(duì)較低。而在基本培養(yǎng)基中，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相對(duì)匱乏，cpxA和cpxR基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，分別為豐富培養(yǎng)基中的3.5倍和4.0倍。這表明營(yíng)養(yǎng)缺乏會(huì)激活Cpx系統(tǒng)，可能是因?yàn)榧?xì)胞在營(yíng)養(yǎng)匱乏的條件下，需要通過Cpx系統(tǒng)的調(diào)節(jié)來維持基本的生理功能。當(dāng)在基本培養(yǎng)基中添加不同碳源和氮源時(shí)，發(fā)現(xiàn)添加葡萄糖和蛋白胨的培養(yǎng)基中，Cpx系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)量相對(duì)較低，而添加乳糖和硫酸銨的培養(yǎng)基中，基因表達(dá)量較高。這說明不同的碳源和氮源對(duì)Cpx系統(tǒng)的激活程度不同，可能是因?yàn)椴煌臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)影響細(xì)胞的代謝途徑和能量供應(yīng)，進(jìn)而影響Cpx系統(tǒng)的活性。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，溫度、pH值和營(yíng)養(yǎng)條件等環(huán)境因素對(duì)Cpx系統(tǒng)的激活和抗生素耐受具有顯著影響。適宜的溫度和中性pH值環(huán)境有利于Cpx系統(tǒng)的正常調(diào)節(jié)，而極端溫度、酸性或堿性環(huán)境以及營(yíng)養(yǎng)匱乏會(huì)強(qiáng)烈激活Cpx系統(tǒng)，增強(qiáng)大腸桿菌的抗生素耐受能力。這些環(huán)境因素可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能以及酸堿平衡等，從而激活Cpx系統(tǒng)，使其在大腸桿菌應(yīng)對(duì)抗生素脅迫時(shí)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。5.3多因素協(xié)同作用下的Cpx系統(tǒng)響應(yīng)在實(shí)際的生存環(huán)境中，大腸桿菌面臨的往往并非單一的環(huán)境壓力或抗生素脅迫，而是多種因素的協(xié)同作用。為了深入探究多因素協(xié)同作用下Cpx系統(tǒng)的響應(yīng)機(jī)制，本研究設(shè)置了一系列復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)條件。在溫度與抗生素協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)中，將大腸桿菌分別置于15℃、25℃、37℃和42℃的環(huán)境中，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期同時(shí)加入氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素進(jìn)行處理。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在15℃時(shí)，盡管加入了抗生素，cpxA和cpxR基因的表達(dá)量仍然相對(duì)較低，這可能是因?yàn)榈蜏匾种屏思?xì)菌的代謝活動(dòng)，使得Cpx系統(tǒng)的激活受到一定程度的限制。隨著溫度升高至37℃，在抗生素的作用下，cpxA和cpxR基因的表達(dá)量顯著增加，分別達(dá)到15℃時(shí)的5.5倍和6.8倍。這表明在適宜的生長(zhǎng)溫度下，抗生素的刺激能夠更有效地激活Cpx系統(tǒng)，可能是因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)菌的代謝活動(dòng)較為活躍，對(duì)抗生素的敏感性增強(qiáng)，從而引發(fā)了更強(qiáng)烈的Cpx系統(tǒng)響應(yīng)。然而，當(dāng)溫度進(jìn)一步升高至42℃時(shí)，基因表達(dá)量雖有所增加，但增幅相對(duì)較小，且細(xì)菌的生長(zhǎng)受到明顯抑制。這可能是由于過高的溫度對(duì)細(xì)菌細(xì)胞造成了嚴(yán)重的損傷，超出了Cpx系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力，使得細(xì)菌難以在高溫和抗生素的雙重壓力下維持正常的生理功能。在pH值與抗生素協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)中，將大腸桿菌培養(yǎng)在pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的培養(yǎng)基中，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，加入三種抗生素進(jìn)行處理。結(jié)果顯示，在酸性環(huán)境（pH值為5.0和6.0）下，抗生素的存在使得cpxA和cpxR基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。在pH值為5.0時(shí)，加入氨芐青霉素后，cpxA基因表達(dá)量是pH值為7.0且無抗生素處理時(shí)的5.2倍，cpxR基因表達(dá)量是其6.5倍。這是因?yàn)樗嵝原h(huán)境本身就會(huì)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞造成損傷，如導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞等，而抗生素的加入進(jìn)一步加劇了這種損傷，從而強(qiáng)烈激活Cpx系統(tǒng)，使其通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)來維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。在堿性環(huán)境（pH值為8.0和9.0）下，基因表達(dá)量也有所增加，但增幅相對(duì)較小。在pH值為9.0時(shí)，加入氯霉素后，cpxA基因表達(dá)量是pH值為7.0且無抗生素處理時(shí)的3.5倍，cpxR基因表達(dá)量是其4.2倍。這說明Cpx系統(tǒng)對(duì)酸性環(huán)境與抗生素的協(xié)同作用更為敏感，可能是因?yàn)樗嵝原h(huán)境對(duì)細(xì)菌的損傷更為嚴(yán)重，與抗生素的聯(lián)合作用使得細(xì)菌面臨更大的生存壓力，需要Cpx系統(tǒng)更強(qiáng)烈的調(diào)節(jié)來應(yīng)對(duì)。營(yíng)養(yǎng)條件與抗生素的協(xié)同作用同樣對(duì)Cpx系統(tǒng)的響應(yīng)產(chǎn)生重要影響。本研究設(shè)置了豐富培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）、基本培養(yǎng)基（M9培養(yǎng)基）以及添加不同碳源（葡萄糖、乳糖、蔗糖）和氮源（蛋白胨、酵母提取物、硫酸銨）的培養(yǎng)基。在豐富培養(yǎng)基中，大腸桿菌生長(zhǎng)迅速，即使加入抗生素，Cpx系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)相對(duì)較低。這是因?yàn)樨S富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為細(xì)菌提供了充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)，使其能夠更好地應(yīng)對(duì)抗生素的脅迫，減少了對(duì)Cpx系統(tǒng)的依賴。而在基本培養(yǎng)基中，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相對(duì)匱乏，加入抗生素后，cpxA和cpxR基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，分別為豐富培養(yǎng)基中且無抗生素處理時(shí)的4.8倍和5.6倍。這表明營(yíng)養(yǎng)缺乏會(huì)削弱細(xì)菌的抗逆能力，使得抗生素的脅迫作用更為明顯，從而激活Cpx系統(tǒng)，通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)來維持細(xì)胞的基本生理功能。當(dāng)在基本培養(yǎng)基中添加不同碳源和氮源時(shí)，發(fā)現(xiàn)添加葡萄糖和蛋白胨的培養(yǎng)基中，加入四環(huán)素后，Cpx系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)量相對(duì)較低，而添加乳糖和硫酸銨的培養(yǎng)基中，基因表達(dá)量較高。這說明不同的碳源和氮源會(huì)影響細(xì)菌的代謝途徑和能量供應(yīng)，進(jìn)而影響Cpx系統(tǒng)在抗生素脅迫下的激活程度。不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物和信號(hào)分子發(fā)生變化，這些變化可能會(huì)影響CpxA對(duì)環(huán)境信號(hào)的感知，從而調(diào)節(jié)Cpx系統(tǒng)的激活水平。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，溫度、pH值、營(yíng)養(yǎng)條件等環(huán)境因素與抗生素的協(xié)同作用對(duì)Cpx系統(tǒng)的激活和抗生素耐受具有顯著影響。適宜的環(huán)境條件與抗生素的組合可能會(huì)增強(qiáng)Cpx系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，使大腸桿菌更好地適應(yīng)抗生素脅迫；而惡劣的環(huán)境條件與抗生素的協(xié)同作用則可能超出Cpx系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力，對(duì)大腸桿菌的生存造成嚴(yán)重威脅。這些環(huán)境因素與抗生素的協(xié)同作用可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、酸堿平衡以及能量供應(yīng)等，從而調(diào)節(jié)Cpx系統(tǒng)的激活，使其在大腸桿菌應(yīng)對(duì)復(fù)雜環(huán)