ICS65.150CCSB50DB12DB12/T1359—2024水產(chǎn)養(yǎng)殖用非規(guī)范藥品中喹諾酮類、磺胺類酰胺醇類抗生素殘留的測(cè)定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法Determinationofquinolones,sulfonamidesandamidolantibioticresiduesinnon-standarddrugsforaquaculturebyliquidchromatography-tandemmassspectrometry2024-11-27發(fā)布2025-01-01實(shí)施天津市市場(chǎng)監(jiān)督管理委員會(huì)發(fā)布1DB12/T1359—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由天津市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委提出并歸口。本文件起草單位：天津市農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心、山東省科學(xué)院海洋儀器儀表研本文件主要起草人：陳永平、成振華、王輝、韓現(xiàn)芹、時(shí)文博、史艷艷、高麗娜、王愿寧、高麗、李灝、曹建新、易偉、蘇夢(mèng)寒。DB12/T1359—20242水產(chǎn)養(yǎng)殖用非規(guī)范藥品中喹諾酮類、磺胺類、酰胺醇類抗生素殘留的測(cè)定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法本文件規(guī)定了水產(chǎn)養(yǎng)殖用非規(guī)范藥品中喹諾酮類、磺胺類、酰胺醇類抗生素留量測(cè)定的原理、試劑和材料、儀器、分析步驟、結(jié)果計(jì)算、正確度與精密度。本文件適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖用非規(guī)范藥品中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺多辛、磺胺喹噁啉、磺胺異噁唑、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考共17種抗生素殘留量檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1非規(guī)范藥品non-standarddrugs水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中用來(lái)凈化水質(zhì)、改良地質(zhì)、除雜等的非藥品，包括水質(zhì)改良劑、底質(zhì)改良劑、微生態(tài)制劑、除雜劑及促生長(zhǎng)劑等。非規(guī)范藥品中喹諾酮類、磺胺類、酰胺醇類抗生素，先加水溶解或稀釋，再用酸化乙腈萃取，經(jīng)固相萃取柱凈化，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。5試劑材料除非另有說(shuō)明，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1.1甲醇(CH?OH,CAS號(hào)：67-56-1):色譜純。5.1.2乙腈(CH?CN,CAS號(hào)：75-05-8):色譜純。5.1.3甲酸(HCOOH,CAS號(hào)：64-18-6):色譜純。3DB12/T1359—20245.1.4二氯甲烷(CH?Cl?,CAS號(hào)：75-09-2):分析純。5.1.5乙酸乙酯(C4H?O?,CAS號(hào)：141-78-6):分析純。5.1.6氯化鈉(NaCl,CAS號(hào)：7647-14-5):分析純。5.1.7乙酸銨(CH?COONH?,CAS號(hào)：631-61-8):分析純。5.2溶液配制5.2.1乙酸銨(2.0mmoL/L)-甲酸溶液(0.1%):稱取0.077g無(wú)水乙酸銨，用0.1%甲酸水溶液溶解并稀釋至500mL。5.2.2甲醇-水溶液(15+85,體積比):量取甲醇15mL加入85mL水中，混勻。5.2.3甲酸-乙腈(0.1+99.9,體積比):量取甲酸0.5mL,加乙腈稀釋至500mL,混勻。5.3標(biāo)準(zhǔn)品17種抗生素類標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)符合附錄A,純度≥95%。5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制5.4.1標(biāo)準(zhǔn)貯備液100μg/mL。取諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺多辛、磺胺喹惡啉、磺胺異噁唑、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考各適量(相當(dāng)于各活性成分10mg),精密稱定，于各自容量瓶中，喹諾酮類需加0.2mL甲酸，均用甲醇溶解后并稀釋定容至100mL,配制成濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。避光-18℃以下保存，有效期1年。5.4.2氘代同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液500μg/mL。取氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶、氘代磺胺間二甲氧嘧啶、氘代諾氟沙星、氘代環(huán)丙沙星、氘代恩諾沙星、氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)各適量(相當(dāng)于各活性成分5mg),精密稱定，于各自容量瓶中，用甲醇溶解稀釋定容至10mL。配制成濃度為500μg/mL同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光-18℃以下保存，有效期1年。5.4.3喹諾酮類與磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)工作液準(zhǔn)確吸取各喹諾酮類和磺胺類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(5.4.1)適量，用甲醇稀釋制成1.0μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，避光4℃冷藏保存，有效期1個(gè)月。5.4.4酰胺醇類混合標(biāo)準(zhǔn)工作液準(zhǔn)確吸取各酰胺醇類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(5.4.1)適量，用甲醇稀釋制成氯霉素、氟苯尼考0.1μg/mL,甲砜霉素0.5μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，避光4℃冷藏保存，有效期1個(gè)月。5.4.5磺胺類與喹諾酮類混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取各磺胺類和喹諾酮類內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(5.4.2)適量，用甲醇稀釋制成10.0μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，避光4℃冷藏保存，有效期1個(gè)月。5.4.6酰胺醇類混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液準(zhǔn)確吸取各酰胺醇類內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(5.4.2)適量，用甲醇稀釋制成1.0μg/mL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，避光4℃冷藏保存，有效期1個(gè)月。4DB12/T1359—20245.5材料通過(guò)式固相萃取柱，200mg/6mL,或性能相當(dāng)者。6儀器6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧(ESI)離子源。6.2分析天平：感量0.01g、0.01mg。6.3高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速大于10000r/min。6.4超聲波震蕩儀。6.5渦旋振蕩器。6.6氮吹儀。6.7粉碎裝置：如杵或研缽。6.8篩：篩孔為1mm金屬網(wǎng)。7試樣制備7.1試樣制備7.1.1固態(tài)非規(guī)范藥品按GB/T20195的規(guī)定制備試樣，至少100g,粉碎使其全部通過(guò)1.0mm孔徑的分析篩，裝入密閉容器中備用。7.1.2液態(tài)非規(guī)范藥品將樣液過(guò)0.45μm濾膜，收集樣液體積20mL,于密閉容器中保存。7.2試樣保存將試樣于4℃及以下條件下保存。8分析步驟8.1樣品處理稱取非規(guī)范藥品0.1g(準(zhǔn)確至0.01g),用水稀釋至100mL,渦旋1min,超聲波超聲5min,取5mL置于50mL離心管中，加入50μL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液(5.4.5、5.4.6),加入2.0gNaCl,再加入10mL酸化乙腈，渦旋1min,超聲波超聲5min,8000r/min離心3min,取上清液過(guò)固相萃取柱于20mL玻璃離心管中，再加入5mL酸化乙腈，重復(fù)上述操作，2mL乙腈淋洗固相萃取柱，合并收集液于40℃條件下，氮?dú)獯抵两?，殘留物加入甲醇溶?5.2.2)1mL,充分渦旋混勻，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，20000r/min離心5min,取上清液過(guò)0.2μm有機(jī)相濾膜后，取100μL濾液，用甲醇溶液(5.2.2)定容至10.0mL,上機(jī)測(cè)定。8.2測(cè)定8.2.1磺胺類與喹諾酮類58.2.1.1色譜條件8.2.1.1.1色譜柱：Ci8色譜柱，1.7μm,100mm×2.1mm(內(nèi)徑),或性能相當(dāng)。8.2.1.1.2柱溫：35℃。8.2.1.1.3流速：0.25mL/min。8.2.1.1.5流動(dòng)相：甲醇-(乙酸銨-甲酸溶液，5.2.1);洗脫程序見表1。表1流動(dòng)相梯度洗脫程序時(shí)間(min)V./%V/%190640606.1908908.190908.2.1.2質(zhì)譜條件8.2.1.2.1離子化模式：電噴霧離子源(ESI+),多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。8.2.1.2.2噴霧電壓：5500v。8.2.1.2.3氣簾氣壓力：0.24MPa。8.2.1.2.4碰撞氣壓力：0.02MPa。8.2.1.2.5離子源溫度：550℃。8.2.1.2.6碰撞室入口電壓：10v。8.2.1.2.7碰撞室出口電壓：10v。8.2.1.2.8駐留時(shí)間：50ms。8.2.1.2.9離子源Gasl:0.6MPa。8.2.1.2.10離子源Gas2:0.2MPa。8.2.1.2.11多反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子、解簇電壓和碰撞能量見表2。表2多反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子、解簇電壓和碰撞能量目標(biāo)化合物母離子m/z子離子m/z解簇電壓V碰撞能量磺胺噻唑2568585磺胺嘧啶2518585磺胺甲基異噁唑2548585磺胺二甲嘧啶2798585磺胺甲基嘧啶26585856DB12/T1359—2024磺胺多辛8585磺胺喹噁啉8585磺胺異噁唑2688585諾氟沙星320.3233.485276.3*85環(huán)丙沙星332.2245.385288.3*85恩諾沙星360.2245.2*90316.390氧氟沙星26185318*85培氟沙星29085316*85洛美沙星26585308*85氘代諾氟沙星325.3307.285氘代環(huán)丙沙星340.3322.385氘代恩諾沙星365.3321.394氘代磺胺間二甲氧嘧啶85氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶85注：*為定量碎片離子8.2.1.3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，甲醇溶液(5.2.1)定容至1mL,喹諾酮類與磺胺類稀釋成質(zhì)量濃度為5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL、200ng/mL,內(nèi)標(biāo)液濃度均為50ng/mL。8.2.2酰胺醇類測(cè)定8.2.2.1色譜條件8.2.2.1.1色譜柱：C18色譜柱，1.7μm,100mm×2.1mm(內(nèi)徑),或性能相當(dāng)。8.2.2.1.2柱溫：35℃。8.2.2.1.3流動(dòng)相：甲醇-水；流動(dòng)相洗脫程序見表3。8.2.2.1.4流速：0.3mL/min。表3流動(dòng)相梯度洗脫程序7DB12/T1359—2024時(shí)間(min)V./%V%1906406.1908908.190908.2.2.2質(zhì)譜條件8.2.2.2.1離子化模式：電噴霧離子源(ESI-),多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。8.2.2.2.2噴霧電壓：-5500v。8.2.2.2.3氣簾氣壓力：0.24MPa。8.2.2.2.4碰撞氣壓力：0.02MPa。8.2.2.2.5離子源溫度：550℃。8.2.2.2.6碰撞室入口電壓：10v。8.2.2.2.7碰撞室出口電壓：10v。8.2.2.2.8駐留時(shí)間：100ms。8.2.2.2.9離子源Gasl:0.6MPa。8.2.2.2.10離子源Gas2:0.2MPa。8.2.2.2.11多反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子、解簇電壓和碰撞能量見表4。表4多反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子、解簇電壓和碰撞能量目標(biāo)化合物母離子m/z子離子m/z解簇電壓V碰撞能量氯霉素-55-24257-55-18甲砜霉素290-55-18-55-27氟苯尼考-55-14336*-55-27氘代氯霉素334.1318.1*-55-26注：*為定量碎片離子8.2.2.3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，甲醇溶液(5.2.1)定容至1mL,氯霉素、氟苯尼考稀釋至0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL,甲砜霉素稀釋至2.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、25.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL,內(nèi)標(biāo)液濃度均為5.0ng/mL,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。8離子豐度比(%)允許相對(duì)偏差(%)試樣中各藥物殘留量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w計(jì)，單位為毫克每千克(mgkg),按公式(1)或公式(2)計(jì)…@——試樣中被測(cè)物殘留量的數(shù)值，單位為毫克每千克(mg/kg);9DB12/T1359—2024P?——標(biāo)準(zhǔn)工作液中被測(cè)物的質(zhì)量濃度數(shù)值，單位為毫克每升(mg/L);P?——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中得到的試樣溶液中被測(cè)物的質(zhì)量濃度數(shù)值，單位為毫克每升(mg/L);A——試樣溶液中被測(cè)物的質(zhì)量色譜圖峰面積；As——標(biāo)準(zhǔn)工作液中被測(cè)物的質(zhì)量色譜圖峰面積；A,——試樣溶液中內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量色譜圖峰面積；Ais——標(biāo)準(zhǔn)工作液中內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量色譜圖峰面積；V——提取液體積的數(shù)值，單位為毫升(mL);m——試樣質(zhì)量數(shù)值，單位為(g).計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的2次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，保留2位有效數(shù)字，含量超1mg/kg時(shí)保留3位有效數(shù)字。10正確度和精密度10.1正確度磺胺類、喹諾酮類、酰胺醇類測(cè)定回收率為70%~110%。10.2精密度本方法的批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%,批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%。11其他本實(shí)驗(yàn)條件下非規(guī)范藥品中喹諾酮類、磺胺類定量限為1.0mg/kg;氯霉素、氟苯尼考定量限為0.1mg/kg,氟苯尼考定量限為0.5mg/kg。DB12/T1359—2024(規(guī)范性)17種抗生素中英文對(duì)照索引17種抗生素中英文對(duì)照索引，見表A.1。表A.117種抗生素中英文對(duì)照索引序號(hào)藥物中文名藥物英文名CAS號(hào)分子式1諾氟沙星Norfloxacin70458-96-7C??H?FN?O?2環(huán)丙沙星Ciprofloxacin85721-33-1C??H?FN?O?3恩諾沙星Enrofloxacin93106-60-6C??H??FN?O?4氧氟沙星Ofloxacin82419-36-1C??H?FN?O?5培氟沙星Pefloxacin70458-92-3C??H?FN?O?6洛美沙星Lomefloxacin98079-51-7C??Hi?F?N?O?7磺胺噻唑Sulfathiazole72-14-0C?H?N?O?S?8磺胺嘧啶Sulfadiazine68-35-9C?H?N?O?S9磺胺甲基異噁唑Sulfamethoxazole723-46-6C?H?N?O?S磺胺二甲嘧啶Sulfamethazine57-68-1C??H?N?O?S磺胺甲基嘧啶Sulfamerazine127-79-7C?H?N?O?S磺胺多辛Sulfadoxine2447-57-6C??H?N?O?S磺胺喹噁啉Sulfaquinoxaline59-40-5C?H?N?O?S磺胺異噁唑Sulfisoxazole127-69-5C?H?N?O?S氯霉素Chloramphenicol56-75-7CnH??Cl?N?O?甲砜霉素Thiamphenicol15318-45-3C??H??Cl?NO?S氟苯尼考Florfenicol73231-34-2C??H??Cl?FNO?S1.00e6XIC-of+MRM(33pairs):256.000/156.3.02磺胺噻唑XICof+MRM(33pairs):254.000/156.000DaID:jiaezuo2fromSample118(50)ofD…5.0e5■XICof+MRM(33pairs):251.000/156.000Da1.00e6■XICof+MRM(33pairs):311.001/156.000DaID:liner■XICof+MRM(33pairs);301.000/156.0xICof+MRM(33pairs):279.0/156.000pairs):268.000/156.0pairs):268.000/156.02.0e5一