發(fā)酵工程

—構(gòu)建酵母菌純培養(yǎng)過程模型，

總結(jié)菌種的選育和培養(yǎng)方法核心素養(yǎng)考察：理解各菌種用于發(fā)酵的原理分析培養(yǎng)基的成分及作用，比較微生物純培養(yǎng)兩種方法的異同設(shè)計實驗探究微生物培養(yǎng)的條件，培養(yǎng)實驗探究能力概述發(fā)酵工程，舉例說明發(fā)酵工程在生產(chǎn)上有重要的應(yīng)用價值（2022年山東高考20）.啤酒的工業(yè)化生產(chǎn)中，大麥經(jīng)發(fā)芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、發(fā)酵、消毒等工序后，最終過濾、調(diào)節(jié)、分裝。下列說法正確的是（）A.用赤霉素處理大麥，可使大麥種子無須發(fā)芽就能產(chǎn)生α-淀粉酶B.焙烤是為了利用高溫殺死大麥種子胚并進(jìn)行滅菌C.糖漿經(jīng)蒸煮、冷卻后需接種酵母菌進(jìn)行發(fā)酵D.通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可減少啤酒酵母雙乙酰的生成，縮短啤酒的發(fā)酵周期【學(xué)習(xí)目標(biāo)】1.構(gòu)建思維導(dǎo)圖，厘清發(fā)酵工程的發(fā)展脈絡(luò)，歸納傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)和發(fā)酵工程的區(qū)別和聯(lián)系。2.構(gòu)建酵母菌純培養(yǎng)過程模型，總結(jié)微生物的獲取、純培養(yǎng)及計數(shù)的一般方法及步驟，說明微生物培養(yǎng)技術(shù)是發(fā)酵工程發(fā)展的基礎(chǔ)。3.舉例說明發(fā)酵工程在食品工、醫(yī)藥工、農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用。先創(chuàng)造條件讓毛霉生長再加鹽控制毛霉的生長控制毛霉的生長，同時增加風(fēng)味和口感前期發(fā)酵后期發(fā)酵讓豆腐上長出毛霉加鹽腌制加鹵湯裝瓶密封腌制（一）腐乳制作流程制作原理:蛋白質(zhì)蛋白酶小分子的肽+氨基酸脂肪脂肪酶甘油+脂肪酸一.傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)食鹽的作用：（1）析出豆腐水分（2）調(diào)味（3）食鹽又能防止毛霉繼續(xù)生長和污染的雜菌繁殖鹵湯中的酒可抑制微生物的生長（二）制作泡菜1.菌種：乳酸菌（原核生物）

來源：植物體表面2.發(fā)酵原理：在無氧的情況下能將葡萄糖分解成乳酸3.制作流程及注意事項C6H12O62C3H6O3（乳酸）+能量酶煮沸（除氧；殺滅鹽水中其他細(xì)菌），冷卻待用八成滿（初期酵母菌較活躍，產(chǎn)物有CO2，裝滿容易使發(fā)酵液溢出）封壇（壇蓋邊沿水槽中注滿水，保證壇內(nèi)乳酸菌的發(fā)酵所需的無氧環(huán)境）腌制條件:溫度不能過高食鹽含量不能過低腌制時間不能過短細(xì)菌污染大量繁殖后，亞硝酸鹽含量增加腌制過程中，亞硝酸鹽含量先增多，后減少。制作泡菜的注意事項思考：為什么含有抗生素的牛奶不能發(fā)酵為酸奶？牛奶發(fā)酵為酸奶主要依靠乳酸菌的發(fā)酵作用，而抗生素能夠殺死或抑制乳酸菌。認(rèn)識亞硝酸鹽測定亞硝酸鹽的含量1、測定方法：比色法2、測定原理：在鹽酸酸化條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)后，反應(yīng)產(chǎn)物再與N-1－萘基乙二胺鹽酸鹽結(jié)合生成玫瑰紅溶液。將經(jīng)過反應(yīng)顯色后的待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)液比色，即可計算出樣品中的亞硝酸鹽含量。（23年山東）12.以下是以泡菜壇為容器制作泡菜時的4個處理：①沸鹽水冷卻后再倒入壇中；②鹽水需要浸沒全部菜料；③蓋好壇蓋后，向壇蓋邊沿的水槽中注滿水；④檢測泡菜中亞硝酸鹽的含量。下列說法正確的是（）A.①主要是為了防止菜料表面的醋酸桿菌被殺死B.②的主要目的是用鹽水殺死菜料表面的雜菌C.③是為了使氣體只能從泡菜壇排出而不能進(jìn)入D.④可檢測到完整發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量逐漸降低【答案】C【分析】泡菜的制作原理：泡菜的制作離不開乳酸菌。在無氧條件下，乳酸菌將葡萄糖分解成乳酸。（1）泡菜的制作流程是：選擇原料、配置鹽水、調(diào)味裝壇、密封發(fā)酵。（2）選用火候好、無裂紋、無砂眼、壇沿深、蓋子吻合好的泡菜壇。（3）原料加工：將新鮮蔬菜修整、洗滌、晾曬、切分成條狀或片狀。（4）配制鹽水：按照比例配制鹽水，并煮沸冷卻。原因是為了殺滅雜菌，冷卻之后使用是為了保證乳酸菌等微生物的生命活動不受影響。（5）泡菜的制作：將經(jīng)過預(yù)處理的新鮮蔬菜混合均勻，裝入泡菜壇內(nèi)，裝至半壇時，放入蒜瓣、生姜及其他香辛料，繼續(xù)裝至八成滿，再徐徐注入配制好的鹽水，使鹽水沒過全部菜料，蓋好壇蓋。在壇蓋邊沿的水槽中注滿水，以保證壇內(nèi)乳酸菌發(fā)酵所需的無氧環(huán)境。在發(fā)酵過程中要注意經(jīng)常補充水槽中的水?！驹斀狻緼、鹽水煮沸是為了殺滅雜菌，冷卻之后使用是為了保證乳酸菌等微生物的生命活動不受影響，A錯誤；B、②鹽水需要浸沒全部菜料，造成無氧環(huán)境，有利于乳酸菌無氧呼吸，B錯誤；C、③蓋好壇蓋后，向壇蓋邊沿的水槽中注滿水，是排氣減壓、隔絕空氣、防止雜菌污染等，C正確；D、④檢測泡菜中亞硝酸鹽的含量，腌制泡菜過程中亞硝酸鹽的含量先增多后減少，D錯誤。C（三）果酒和果醋的制作1.制作原理1、酵母菌：真核、出芽生殖、異養(yǎng)兼性厭氧、28℃出芽生殖2、原理：C6H12O6→2C2H5OH+2CO2+能量酶果酒果醋1、醋酸菌：原核、分裂生殖（二分裂）異養(yǎng)好氧、30-35℃二分裂生殖2、原理：氧氣、糖源充足時酶

C6H12O6+2O2

→2CH3COOH（醋酸）+2H2O+2CO2+能量氧氣充足、糖源不充足時C2H5OH+O2

→CH3COOH（醋酸）+H2O+能量酶醋酸菌將乙醇變?yōu)橐胰?，再將乙醛變?yōu)榇姿崞骶呦?/p>

體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒沖洗

先清洗后去除枝梗和腐爛的籽粒，從而避免除去枝梗時，引起葡萄

損壞，增加被雜菌感染的機(jī)會。榨汁裝瓶

留大約1/3的空間：①有利于酵母菌有氧呼吸，快速繁殖

②防止產(chǎn)生的CO2使發(fā)酵液溢出

③防止瓶內(nèi)壓強(qiáng)過大導(dǎo)致發(fā)酵瓶炸裂酒精發(fā)酵

18-30℃；每隔12h左右將瓶蓋擰松一次（排氣）此后再擰緊瓶蓋乙酸發(fā)酵

30-35℃；打開瓶蓋，蓋上一層紗布（提供氧氣）2.制作流程及注意事項思考：制作果酒時除了酵母菌是否還有其他微生物生長，如果有，如何避免它們對果酒發(fā)酵的影響？制作果醋時，酵母菌是否還會持續(xù)發(fā)酵？發(fā)酵技術(shù)果酒發(fā)酵果醋發(fā)酵腐乳發(fā)酵泡菜發(fā)酵所用菌種酵母菌醋酸菌主要為毛霉乳酸菌生物學(xué)分類真核生物原核生物真核生物原核生物代謝類型異養(yǎng)兼性厭氧異養(yǎng)需氧異養(yǎng)需氧異養(yǎng)厭氧適宜溫度18～30℃30～35℃15～18℃室溫主要生殖方式出芽生殖二分裂生殖孢子生殖二分裂生殖主要用途釀酒、發(fā)面釀醋制作腐乳制作酸奶、泡菜幾種傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)所用菌種比較

(23年山東)20.果酒的家庭制作與啤酒的工業(yè)化生產(chǎn)相比，共同點有（）A.都利用了酵母菌無氧呼吸產(chǎn)生酒精的原理

B.都需要一定的有氧環(huán)境供發(fā)酵菌種繁殖C.發(fā)酵前都需要對原料進(jìn)行滅菌

D.發(fā)酵結(jié)束后都必須進(jìn)行消毒以延長保存期【答案】AB【分析】果酒與啤酒的發(fā)酵原理均是酵母菌在無氧條件下進(jìn)行無氧呼吸產(chǎn)生酒精。【詳解】A、二者均利用了酵母菌進(jìn)行無氧呼吸產(chǎn)生酒精的原理，A正確；B、發(fā)酵前期，均需要一定的有氧環(huán)境，使酵母菌大量繁殖，B正確；C、果酒的家庭制作不需對原料進(jìn)行滅菌，C錯誤；D、果酒的家庭制作不需要進(jìn)行消毒，D錯誤。AB（一）、培養(yǎng)基的類型劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點用途物理性質(zhì)液體培養(yǎng)基不加凝固劑工業(yè)生產(chǎn)固體培養(yǎng)基加凝固劑，如瓊脂微生物分離、鑒定、活菌計數(shù)、保藏菌種二、微生物的培養(yǎng)技術(shù)劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點用途化學(xué)成分天然培養(yǎng)基含化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)（如：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基）工業(yè)生產(chǎn)合成培養(yǎng)基培養(yǎng)基成分明確(如查氏培養(yǎng)基)分類、鑒別劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點用途及幾種常見培養(yǎng)基用途基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他微生物生長培養(yǎng)、分離出特定微生物，如培養(yǎng)酵母菌和霉菌（加入青霉素），培養(yǎng)金黃色葡萄球菌（加入高濃度食鹽），以尿素作為唯一氮源，培養(yǎng)分解尿素的細(xì)菌，不添加氮源，培養(yǎng)固氮微生物鑒別培養(yǎng)基根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品鑒別不同種類的微生物，如用伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基鑒別大腸桿菌(帶有金屬光澤的紫黑色菌落)，用剛果紅培養(yǎng)基鑒別纖維素分解菌（透明圈）培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成（一）碳源①無機(jī)碳源：②有機(jī)碳源：CO2、HCO3-等，適于自養(yǎng)生物。葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等，適于異養(yǎng)生物。（二）氮源①無機(jī)氮源：②有機(jī)氮源：N2、NH4＋、NH3、NO3-等，適于固氮微生物牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等（三）無機(jī)鹽KH2PO4、K2HPO4、（NH4）2SO4、MgSO4、CaCl2、Ca(NO3)2、NaCl、FeSO4等。（四）水（五）pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣等培養(yǎng)的微生物需要滿足的其他要求乳酸桿菌培養(yǎng)基中添加維生素霉菌將pH調(diào)至酸性細(xì)菌將pH調(diào)至中性或微堿性厭氧微生物需要提供無氧條件

消毒：較為溫和理化生方法，殺死物體表面或內(nèi)部部分微生物

滅菌：強(qiáng)烈的理化方法，殺死物體內(nèi)外所有微生物（包括芽孢、孢子）（二）、無菌技術(shù)1.煮沸100℃煮沸5～6min可以殺死微生物細(xì)胞和部分芽孢

3.化學(xué)藥物

酒精擦拭雙手；氯氣消毒水源；石炭酸、煤酚皂溶液等2.巴氏消毒法62～65℃消毒30min或80～90℃處理30s-1min；適用于不耐高溫的液體，如牛奶、啤酒。

4.紫外線消毒

適用于空氣及物體表面消毒方法160～170℃、2～3h；適用于耐高溫、需保持干燥的物品（吸管、培養(yǎng)皿）和金屬用具等2.干熱滅菌1.濕熱滅菌（高壓蒸汽滅菌效果最好）100KPa、121℃、15～30min；適用于培養(yǎng)基滅菌。注意：①滅菌開始前排凈鍋內(nèi)冷空氣，否則鍋內(nèi)溫度達(dá)不到121℃②壓力降到0時才能打開，否則培養(yǎng)基會沖出錐形瓶，造成污染滅菌方法3.灼燒滅菌在酒精燈火焰充分燃燒層上灼燒，適用于接種環(huán)、接種針、接種鉤等金屬用具以及試管口、三角瓶口滅菌。三、酵母菌的純培養(yǎng)

分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部繁殖形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體就是菌落。菌落具有大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等基本特征，是鑒定菌種的重要依據(jù)。純培養(yǎng)的方法：平板劃線法、稀釋涂布平板法（1）配置培養(yǎng)基馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200g，葡萄糖（或蔗糖）20g，瓊脂15~20g，水1000mL（2）滅菌培養(yǎng)基裝入錐形瓶，加棉塞（防止污染和揮發(fā)），包上牛皮紙扎緊（滅菌時避免水蒸氣浸濕棉塞，取出培養(yǎng)基時，隔絕空氣中雜菌），高壓蒸汽滅菌；培養(yǎng)皿5～8套一包，放入干熱滅菌箱內(nèi)滅菌1.制備培養(yǎng)基（一）方法步驟（3）倒平板培養(yǎng)基冷卻至約50℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板

②瓶口灼燒滅菌①拔出棉塞③倒入培養(yǎng)基蓋上皿蓋④冷卻倒置（減少水分蒸發(fā)；防止形成水滴落到培養(yǎng)基上）2.接種和分離酵母菌對照組：未接種的培養(yǎng)基（用于檢驗培養(yǎng)基的滅菌是否成功）平板劃線問題討論（1）、為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？①操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物②殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時，菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到由單個細(xì)菌形成的菌落。③及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。

（2）、在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？避免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。（3）.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，這樣能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。

一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；存留在劃破處的單個細(xì)胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。（4）.平板劃線時不能劃破培養(yǎng)基的原因？3.培養(yǎng)酵母菌平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48h。

探究學(xué)習(xí)1.稀釋涂布平板法（1）稀釋涂布平板法的操作步驟是什么？（2）操作過程中的注意事項有哪些？2.微生物的數(shù)量測定（1）微生物的數(shù)量測定有哪些方法？（2）為了保證結(jié)果更為準(zhǔn)確有哪些注意事項？（3）統(tǒng)計結(jié)果是否有誤差？3.土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)

（1）選擇培養(yǎng)基的配方與一般培養(yǎng)基有什么不同？（2）如何設(shè)置對照組證明培養(yǎng)基的制備是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用？實驗過程設(shè)計2.培養(yǎng)基制備（配制、滅菌、倒平板）分別制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（幾乎適應(yīng)所有微生物）。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)

對照組：（1）未接種的選擇培養(yǎng)基（用于檢驗選擇培養(yǎng)基的滅菌是否成功）

（2）接種牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于對比證明選擇培養(yǎng)基的選擇作用）1.土壤取樣（取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的信封等用具在使用前都要滅菌，鏟去表層土）（二）微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)3.土樣稀釋（稀釋范圍選取寬泛1×103~1×107倍，每一次從試管中吸取稀釋液前都要充分搖勻）4.平板涂布（每個稀釋濃度要涂布至少3個選擇培養(yǎng)基和1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，實驗時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記，注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。）101102103104105106稀釋涂布平板法：先將菌液進(jìn)行系列梯度稀釋后涂布平板，在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細(xì)胞，從而在培養(yǎng)基表面形成單菌落，實現(xiàn)菌種的純培養(yǎng)。稀釋涂布平板法將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布6.菌落計數(shù)稀釋涂布平板法：選用菌落數(shù)30-300的平板（數(shù)值偏小，因為當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時，平板上觀察到一個菌落）顯微鏡直接計數(shù)：細(xì)菌計數(shù)板或血細(xì)胞計數(shù)板（數(shù)值偏大，因為死菌也被計數(shù)）5.微生物培養(yǎng)與觀察（每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果）7.實驗結(jié)果分析鑒別：酚紅指示劑，變紅的是尿素分解菌剛果紅鑒別纖維素分解菌，有透明圈的是纖維素分解菌拓展——分解尿素細(xì)菌的進(jìn)一步鑒定1.原理細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解為氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高，因此可以通過檢測培養(yǎng)基pH的變化來判斷是否發(fā)生了該化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而判斷該菌是否為尿素分解細(xì)菌；2.方法在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指示劑將變紅：

*液體培養(yǎng)基可以直接看液體的變色情況；

*固體培養(yǎng)基上可以觀察菌落周圍是否出現(xiàn)紅色環(huán)帶；

*紅色環(huán)帶直徑與菌落直徑比值越大，說明分解能力越強(qiáng)CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH31.纖維素酶（1）組成：纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包含三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。（2）作用：C1酶

葡萄糖苷酶CX酶

2.纖維素分解菌的篩選（1）培養(yǎng)基：富含纖維素的培養(yǎng)基

（2）篩選原理：剛果紅

纖維素分解纖維素的微生物的分離纖維素葡萄糖纖維二糖紅色復(fù)合物纖維分解菌纖維素酶出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈（23年山東）15.平板接種常用在微生物培養(yǎng)中。下列說法正確的是（）A.不含氮源的平板不能用于微生物培養(yǎng)B.平板涂布時涂布器使用前必須進(jìn)行消毒C.接種后未長出菌落的培養(yǎng)基可以直接丟棄D.利用以尿素為唯一氮源的平板能分離出合成脲酶的微生物【答案】D【詳解】A、不含氮源的平板可用于固氮菌的培養(yǎng)，A錯誤；B、平板涂布時涂布器使用前必須浸在酒精中，然后在火焰上灼燒滅菌，這種操作屬于滅菌，不屬于消毒，B錯誤；C、使用后的培養(yǎng)基即使未長出菌落也要在丟棄前進(jìn)行滅菌處理，不能直接丟棄，以免污染環(huán)境，C錯誤；D、脲酶可以催化尿素分解，在以尿素為唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素獲得氮源而進(jìn)行生長繁殖，但是不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而無法生長，因此以尿素為唯一氮源的平板能分離出合成脲酶的微生物，D正確。D四、發(fā)酵工程的基本環(huán)節(jié)一般包括：菌種的選育，

擴(kuò)大培養(yǎng)，

培養(yǎng)基的配制、滅菌，

接種、發(fā)酵，

產(chǎn)品的分離、提純等方面。發(fā)酵工程的基本環(huán)節(jié)選育菌種:可以從自然界中篩選,也可通過誘變育種或基因工程獲得擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵:發(fā)酵工程的中心環(huán)節(jié)。在了解發(fā)酵進(jìn)程的同時,還要控制發(fā)酵條件。如環(huán)境條件不僅會影響微生物的生長繁殖,而且會影響微生物代謝物的形成接種滅菌:不能有雜菌污染。如在青霉素生產(chǎn)過程中如果污