從基因到蛋白的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程功能蛋白組裝什么是基因工程什么是重組蛋白重組蛋白是指將一種或多種生物體〔供體〕的基因?qū)肓硪环N生物體〔受體〕內(nèi)，使之按照人們的意愿遺傳并表達(dá)出的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。重組蛋白生產(chǎn)根本流程圖TheDNAcontainingthegenemustbeisolatedawayfromitsgenomiccontextThatshouldbesimple–buttherearebigproblemsGeneofinterestCloningcansupplylargequantitiesofrecombinantDNASinglebacteriumtransformedwithsinglecopyofplasmidwhichissubsequentlyreplicatedGrowthtoacolonyProvidesseveralmgofrecombinantDNAProvidesseveralmgofrecombinantDNAInoculateintoliquidbroth重組蛋白表達(dá)的典型穿梭載體。MCS=多克隆位點(diǎn)；Op=細(xì)菌復(fù)制起始位點(diǎn)；Mp=細(xì)菌中的選擇性基因；ME=真核生物中的選擇性基因；OE=真核復(fù)制起始位點(diǎn)；PE=真核啟動(dòng)子；TE=真核中止子；hG=表達(dá)的外源基因。重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)所謂重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，是指生產(chǎn)重組蛋白的基因工程宿主菌或宿主細(xì)胞。目前常用的表達(dá)系統(tǒng)宿主要有原核的細(xì)菌〔主要是大腸桿菌，E.Coli.〕和真核的酵母菌、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞系以及近年開展起來(lái)的盤基網(wǎng)柄菌系統(tǒng)。1、原核生物表達(dá)系統(tǒng)細(xì)菌(E.coli.)2、真核生物表達(dá)系統(tǒng)酵母菌(Yeast)3、動(dòng)物細(xì)胞4、昆蟲細(xì)胞4、新型真核表達(dá)系統(tǒng)盤基網(wǎng)柄菌盤基網(wǎng)柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)屬于真菌界的粘菌亞界的聚粘霉綱(Acrasiomzcetes)。1869年真菌學(xué)家OskarBrefeld首次描述了盤基網(wǎng)柄菌。盤基網(wǎng)柄菌屬D.discoideum由Raper1935年發(fā)現(xiàn)。在自然界中D.discoideum通過(guò)吞噬土壤外表的細(xì)菌攝取營(yíng)養(yǎng)和繁殖。盤基網(wǎng)柄菌的生命周期生長(zhǎng)階段發(fā)育階段—細(xì)胞聚集—細(xì)胞分化—移動(dòng)—到達(dá)頂點(diǎn)—植物體生長(zhǎng)階段(growthphase)吞噬細(xì)胞胞飲無(wú)菌培養(yǎng)基(AX2,AX3

和AX4)絲足偽足吞噬細(xì)胞(Phagocytosis〕細(xì)胞聚集(Aggregation)細(xì)胞分化(Celldifferentiation)移動(dòng)階段(Migrationphase)假原質(zhì)團(tuán)(Pseudoplasmodium)Prestalkcells(15%)Presporescells(75%)固體外表頂點(diǎn)〔Culmination〕植物體形成不同表達(dá)系統(tǒng)的比較重組基因工程菌的高密度培養(yǎng)下游策略培養(yǎng)基組成的優(yōu)化碳源種類的選擇下游：培養(yǎng)基組成的優(yōu)化流加培養(yǎng)基因工程菌的固定化培養(yǎng)將基因工程菌固定在多孔載體上，可提高菌體密度，實(shí)現(xiàn)連續(xù)發(fā)酵，為利用其生產(chǎn)異源蛋白提供了有效途徑。多孔載體：多孔陶瓷、浮石、片狀硅膠泡沫和柱狀硅膠泡沫等。CeramTec(1.5-2.5mm）Pumice（(1.5-2.5mm）ImmobasilFS(0.8D,0.2H)ImmobasilR(4O.D/2I.D,4L)固定化培養(yǎng)基因工程菌細(xì)胞載體外表和內(nèi)部的細(xì)胞固定化電鏡掃描照片多孔陶瓷浮石生物微膠囊固定化利用微過(guò)濾實(shí)現(xiàn)工程菌高密度培養(yǎng)動(dòng)、植物組織、體液等胞外產(chǎn)物提取發(fā)酵液→預(yù)處理→c別離→c破碎→碎片別離→初步純化→精制→制成品培養(yǎng)液加熱沉淀勻化離心沉淀分子篩無(wú)菌過(guò)濾酶反響調(diào)pH離心超聲萃取吸附離子超濾絮凝過(guò)濾胞溶過(guò)濾萃取親和凍干錯(cuò)流過(guò)濾研磨錯(cuò)流過(guò)濾超濾吸附噴干憎水結(jié)晶電泳固相析出別離法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法