動物實驗技術(shù)“玩轉(zhuǎn)”基因的實驗動物基因工程-基因編輯技術(shù)自1972年保羅·伯格構(gòu)建了世界上第一個重組DNA分子,自此掀起了基因工程研究的熱潮。半個世紀(jì)以來，基因工程技術(shù)已獲得了突飛猛進的發(fā)展,取得了許多世人矚目的成就，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)療衛(wèi)生、輕工食品和環(huán)境衛(wèi)生等諸多領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大影響，成為生物學(xué)研究的最前沿學(xué)科。目前以基因工程技術(shù)為主體的生物技術(shù)將成為21世紀(jì)主導(dǎo)技術(shù)之一?；蚬こ?基因編輯技術(shù)美國斯坦福大學(xué)的生物化學(xué)、榮譽教授保羅·伯格1980年諾貝爾化學(xué)獎基因工程技術(shù)為主體的生物技術(shù)已成為21世紀(jì)主導(dǎo)技術(shù)之一專業(yè)基礎(chǔ)課程專業(yè)核心課程動物實驗技術(shù)技術(shù)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)CRISPER/Cas9在動物疾病模型構(gòu)建中的應(yīng)用一、基因編輯技術(shù)對目標(biāo)基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行編輯（定向改造），實現(xiàn)特定DNA片段的加入、刪除，特定DNA堿基的缺失、替換等，以改變目的基因或調(diào)控元件的序列、表達量或功能?！せ蚓庉嫷脑砘驹硎峭ㄟ^序列特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和非特異性的DNA修飾結(jié)構(gòu)域組合而成的序列特異性核酸內(nèi)切酶，識別染色體上的DNA靶位點，進行切割并產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，誘導(dǎo)DNA的損傷修復(fù)，從而實現(xiàn)對指定基因組的定向編輯?；颉澳Ъ簟薄狢RISPER/Cas9“這項基因工具蘊含著強大的力量，影響著我們所有人。它不僅徹底改變了基礎(chǔ)科學(xué)，而且推動了創(chuàng)新作物的誕生，未來還將會為突破性的新醫(yī)學(xué)療法指明方向”

——諾貝爾化學(xué)委員會主席

ClaesGustafsson二、認(rèn)識CRISPR-Cas9系統(tǒng)CRISPR-Cas9是繼ZFN、TALENs等基因編輯技術(shù)推出后的第三代基因編輯技術(shù)，短短幾年內(nèi),CRISPR-Cas9技術(shù)風(fēng)靡全球。操作簡單花費少耗時短基因功能研究遺傳疾病治療構(gòu)建動物模型培育家畜新品種基因“魔剪”——CRISPER/Cas9什么是CRISPER/Cas9？CRISPR（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）是一系列重復(fù)的DNA序列，它們之間由獨特的間隔序列分隔。這些間隔序列是細(xì)菌在以前遭受病毒侵襲時獲得的病毒DNA片段。CRISPR-Cas9系統(tǒng)最初是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種免疫機制，用于抵御外來的病毒和質(zhì)粒。Cas9（CRISPR-associatedprotein9）是一種核酸酶，能夠在特定的DNA序列上切割雙鏈DNA?；颉澳Ъ簟薄狢RISPER/Cas9CRISPER/Cas9系統(tǒng)的組成其中，crRNA和tracrRNA通過局部堿基配對組成gRNA(guideRNA)，gRNA與Cas9蛋白結(jié)合后引導(dǎo)Cas9蛋白識別和切割目標(biāo)DNA序列。Cas9核酸酶crRNAtracrRNA為了方便實驗設(shè)計以及提高gRNA的穩(wěn)定性，JenniferDoudna和EmmanuelleCharpentier將crRNA和tracrRNA融合成一條RNA，并把其稱為sgRNA(single-guideRNA)。基因“魔剪”——CRISPER/Cas9在基因編輯中，研究人員設(shè)計了一個與目標(biāo)DNA序列互補的單鏈RNA引導(dǎo)分子（sgRNA），將其與Cas9蛋白復(fù)合體一起導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞。sgRNA引導(dǎo)Cas9定位到目標(biāo)DNA序列，并促使Cas9在該位置切割DNA雙鏈。細(xì)胞修復(fù)切割產(chǎn)生的DNA斷裂時，可以引入突變，從而實現(xiàn)基因的敲除、插入或替換?；颉澳Ъ簟薄狢RISPER/Cas9基因編輯的原理在基因編輯中，研究人員設(shè)計了一個與目標(biāo)DNA序列互補的單鏈RNA引導(dǎo)分子（sgRNA），將其與Cas9蛋白復(fù)合體一起導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞。sgRNA引導(dǎo)Cas9定位到目標(biāo)DNA序列，并促使Cas9在該位置切割DNA雙鏈。細(xì)胞修復(fù)切割產(chǎn)生的DNA斷裂時，可以引入突變，從而實現(xiàn)基因的敲除、插入或替換。新技術(shù)應(yīng)用推動了對于人類疾病的認(rèn)知CRISPR-Cas9應(yīng)用方式(2）基因敲入（Knock-in）當(dāng)DNA雙鏈斷裂后，如果有DNA修復(fù)模板進入到細(xì)胞中，基因組斷裂部分會依據(jù)修復(fù)模板進行同源重組修復(fù)（HDR），從而實現(xiàn)基因敲入。(3）基因抑制、基因激活（RepressionorActivation）（4）多重編輯（MultiplexEditing）將多個sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中，可同時對多個基因進行編輯，具有基因組功能篩選作用。（1）基因敲除（Knock-out）Cas9可以對靶基因組進行剪切，形成DNA的雙鏈斷裂（5）功能基因組篩選利用CRISPR-Cas9進行基因編輯可以產(chǎn)生大量的基因突變細(xì)胞，因此利用這些突變細(xì)胞可以確認(rèn)表型的變化是否是由基因或者遺傳因素導(dǎo)致的。新技術(shù)應(yīng)用推動了對于人類疾病的認(rèn)知CRISPR-Cas9應(yīng)用方式基礎(chǔ)研究：用于研究基因功能、基因表達調(diào)控、遺傳疾病機制等。01醫(yī)學(xué)應(yīng)用：用于治療遺傳性疾病、癌癥、傳染病等，通過修復(fù)或改變致病基因來治療疾病。02農(nóng)業(yè)應(yīng)用：用于培育抗病蟲害、高產(chǎn)量或特定性狀的作物。03生物技術(shù)：用于微生物工程、合成生物學(xué)等領(lǐng)域，開發(fā)新的生物制品和生產(chǎn)過程。04CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用動物疾病模型可以模擬人類疾病的生物學(xué)和病理特征，在疾病發(fā)生機理和藥物篩選等基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

編輯效率高

操作簡單

適用范圍廣神經(jīng)退行性疾病腫瘤白化病神經(jīng)退行性疾病相關(guān)基因編輯動物模型YanS,TuZ,LiuZ,FanN,YangH,YangS,YangW,ZhaoY,OuyangZ,LaiC,YangH,LiL,LiuQ,ShiH,XuG,ZhaoH,WeiH,PeiZ,LiS,LaiL,LiXJ.AHuntingtinKnockinPigModelRecapitulatesFeaturesofSelectiveNeurodegenerationinHuntington'sDisease.Cell.2018May3;173(4):989-1002.e13.doi:10.1016/j.cell.2018.03.005.Epub2018Mar29.PMID:29606351;PMCID:PMC5935586.亨廷頓病(Huntington’sdisease，HD)是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)退行性疾病，由編碼亨廷頓蛋白(Huntingtin，HTT)的基因突變引起。神經(jīng)退行性疾病相關(guān)基因編輯動物模型ZhouXQ,XinJG,FanNN,etal.GenerationofCRISPR/Cas9-mediatedgene-targetedpigsviasomaticcellnucleartransfer.CellMolLifeSci,2015,72(6):1175–1184.帕金森癥(Parkinson’sdisease，PD)是一種常見的運動性疾病，常發(fā)于中老年期，其病理特征是黑質(zhì)紋狀體通路中多巴胺能神經(jīng)元的變性缺失，從而引起肌肉僵硬、運動遲緩和靜止性震顫等癥狀。癌癥基因編輯動物模型NgSR,RideoutIIIWM,Akama-GarrenEH,etal.CRISPR-mediatedmodelingandfunctionalvalidationofcandidatetumorsuppressorgenesinsmallcelllungcancer.ProcNatlAcadSciUSA,2020,117(1):513-521.小細(xì)胞肺癌(Smallcelllungcancer，SCLC)是一種高度侵襲性的神經(jīng)內(nèi)分泌肺癌，約占所有肺癌病例的13%–15%。SCLC生長速度快、易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。癌癥基因編輯動物模型XueW,ChenSD,YinH,etal.CRISPR-mediateddirectmutationofcancergenesinthemouseliver.Nature,2014,514(7522):380-384肝癌是指發(fā)生于肝臟細(xì)胞的惡性腫瘤，分為原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌。手術(shù)切除和放化療仍是臨床治療的主要手段，但易造成復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，使得肝癌患者預(yù)后很差，5年生存率僅為14.1%。神經(jīng)退行性疾病相關(guān)基因編輯動物模型亨廷頓病(Huntington’sdisease，HD)是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)退行性疾病，由編碼亨廷頓蛋白(Huntingtin，HTT)的基因突變引起。YanS,TuZ,LiuZ,FanN,YangH,YangS,YangW,ZhaoY,OuyangZ,LaiC,YangH,LiL,LiuQ,ShiH,XuG,ZhaoH,WeiH,PeiZ,LiS,LaiL,LiXJ.AHuntingtinKnockinPigModelRecapitulatesFeaturesofSelectiveNeurodegenerationinHuntington'sDisease.Cell.2018May3;173(4):989-1002.e13.doi:10.1016/j.cell.2018.03.005.Epub2018Mar29.PMID:29606351;PMCID:PMC5935586.神經(jīng)退行性疾病相關(guān)基因編輯動物模型帕金森癥(Parkinson’sdisease，PD)是一種常見的運動性疾病，常發(fā)于中老年期，其病理特征是黑質(zhì)紋狀體通路中多巴胺能神經(jīng)元的變性缺失，從而引起肌肉僵硬、運動遲緩和靜止性震顫等癥狀。ZhouXQ,XinJG,FanNN,etal.GenerationofCRISPR/Cas9-mediatedgene-targetedpigsviasomaticcellnucleartransfer.CellMolLifeSci,2015,72(6):1175–1184.癌癥基因編輯動物模型小細(xì)胞肺癌(Smallcelllungcancer，SCLC)是一種高度侵襲性的神經(jīng)內(nèi)分泌肺癌，約占所有肺癌病例的13%–15%。SCLC生長速度快、易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。NgSR,RideoutIIIWM,Akama-GarrenEH,etal.CRISPR-mediatedmodelingandfunctionalvalidationofcandidatetumorsuppressorgenesinsmallcelllungcancer.ProcNatlAcadSciUSA,2020,117(1):513-521.癌癥基因編輯動物模型肝癌是指發(fā)生于肝臟細(xì)胞的惡性腫瘤，分為原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌。手術(shù)切除和放化療仍是臨床治療的主要手段，但易造成復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，使得肝癌患者預(yù)后很差，5年生存率僅為14.1%。XueW,ChenSD,YinH,etal.CRISPR-mediateddirectmutationofcancergenesinthemouseliver.Nature,2014,514(7522):380-384免疫缺陷類疾病基因編輯動物模型獲得性免疫缺陷綜合征(Acqiredimmredeficiencysyndrome，AIDS)病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒，被定名為人類免疫缺陷病毒(HIV)，主要攻擊并大量破壞人體免疫系統(tǒng)中最重要的CD4+T淋巴細(xì)胞，使得機體細(xì)胞免疫功能顯著降低，最終導(dǎo)致機體感染病原體的機會增加或產(chǎn)生惡性腫瘤而死亡。CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)可能從多個HIV儲存庫中清除或破壞HIV整合基因組或HIV感染細(xì)胞，這為將來完全治愈AIDS提供了技術(shù)支持。代謝性疾病基因編輯動物模型家族性高膽固醇血癥(Familialhypercholesterolemia，F(xiàn)H)是一種造成人體脂代謝紊亂的遺傳性疾病，突變的低密度脂蛋白受體會引發(fā)低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、黃瘤和嚴(yán)重的動脈粥樣硬化性血管等臨床癥狀。HuangZ,TomitakaA,RaymondA,etal.CurrentapplicationofCRISPR/Cas9gene-editingtechniquetoeradicationofHIV/AIDS.GeneTher,2017,24(7):377–384.代謝性疾病基因編輯動物模型糖尿病是一種終生代謝性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康。大鼠和小鼠動物模型越來越多地被用來闡明類型1和類型2糖尿病機制以及識別和提煉新的治療方法總結(jié)目前利用CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成功構(gòu)建了多種動物模型,基因敲除或敲入模型的構(gòu)建為探究相關(guān)基因功能及作用機制奠定了理論基礎(chǔ)。疾病模型的構(gòu)建為相關(guān)疾