備案號(hào)：19167-2006DB北京市地方標(biāo)準(zhǔn)DB11/T376—2006養(yǎng)殖魚(yú)類病害防疫檢疫技術(shù)規(guī)范Rulesofepidemicquarantiningandpreventionforfamiliardiseaseofculturedfish2006-07-25發(fā)布2006-10-01實(shí)施北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB11/T376—2006本標(biāo)準(zhǔn)為常見(jiàn)魚(yú)病防疫檢疫技術(shù)操作規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)由北京市農(nóng)業(yè)局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：北京市農(nóng)業(yè)局水產(chǎn)辦公室。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：李繼勛、楊華蓮。1DB11/T376—2006養(yǎng)殖魚(yú)類病害防疫檢疫技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了常見(jiàn)養(yǎng)殖魚(yú)類的病害防疫檢疫技術(shù)操作規(guī)范。本標(biāo)準(zhǔn)適用于北京地區(qū)淡水養(yǎng)殖魚(yú)類疾病的防疫檢疫和管理。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GBll607漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB/T15805.1-1995淡水魚(yú)類檢疫方法第一部分GB/T18407.4-2001農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量無(wú)公害水產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境要求NY5070-2002無(wú)公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量NY5072-2002無(wú)公害食品漁用配合飼料安全限量NY5171-2002無(wú)公害食品漁用藥物使用準(zhǔn)則DB11/T196-2003常見(jiàn)魚(yú)病防治技術(shù)操作規(guī)程3防疫調(diào)查3.1養(yǎng)殖的環(huán)境調(diào)查3.1.1周圍環(huán)境根據(jù)GB/T18407.4要求的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行調(diào)查。3.1.2養(yǎng)殖水源調(diào)查養(yǎng)殖用水來(lái)源和進(jìn)排水。根據(jù)GB11607各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)調(diào)查水質(zhì)的情況。3.1.3養(yǎng)殖水體調(diào)查養(yǎng)殖水體形狀、面積、水深、底質(zhì)及水化因子情況。3.2養(yǎng)魚(yú)史調(diào)查調(diào)查養(yǎng)殖魚(yú)類發(fā)生魚(yú)病的病原類型、發(fā)生頻率、藥物的使用情況（包括藥物種類、成分、用量和施調(diào)查放養(yǎng)魚(yú)苗、魚(yú)種產(chǎn)地病史、檢疫和藥物使用情況。3.3水質(zhì)監(jiān)測(cè)3.3.1氣溫和水溫采用水銀溫度計(jì)、酒精攝氏溫度計(jì)、電子儀器測(cè)量，測(cè)量時(shí)要注明當(dāng)天的氣象情況。3.3.2水色和透明度透明度采用透明度板進(jìn)行測(cè)量，通過(guò)目測(cè)觀察養(yǎng)殖水體的水色以判斷浮游生物的種類和數(shù)量。3.3.3水體pH值采用PH試紙、比色測(cè)定計(jì)、電子酸度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。3.3.4溶氧使用碘量法測(cè)定養(yǎng)殖水體的溶氧量。3.4化學(xué)物質(zhì)測(cè)定根據(jù)GB11607要求的水質(zhì)指標(biāo)和方法進(jìn)行分析。3.5池塘清整方法3.5.1清塘方法2DB11/T376—2006調(diào)查清塘消毒方法（是干塘清塘消毒法或帶水清塘消毒法）和清塘程度，包括淤泥的清理程度、排水、除雜以及塘基修復(fù)情況。3.5.2清塘消毒藥物根據(jù)NY5171提供的藥物進(jìn)行清塘。調(diào)查內(nèi)容包括清塘消毒時(shí)間、各種藥劑名稱、用量、效果及消毒時(shí)的操作方法的調(diào)查。3.6飼養(yǎng)管理情況調(diào)查包括餌料來(lái)源、種類、投喂方法、水質(zhì)管理和平時(shí)疾病預(yù)防方法等內(nèi)容。4病原體的檢查首先確定檢測(cè)的魚(yú)品種名，檢測(cè)器官部位、病變程度，所取標(biāo)本的情況，再通過(guò)目檢、顯微鏡檢查、病毒學(xué)檢測(cè)、細(xì)菌學(xué)檢測(cè)檢查發(fā)病原因和初步確定病原體的種類。4.1檢測(cè)及分類4.1.1目檢根據(jù)癥狀通過(guò)目檢法初步判斷病因和原病種類。主要有寄生蟲(chóng)病、水霉、原生動(dòng)物、蠕蟲(chóng)等；根據(jù)病魚(yú)的外表反應(yīng)初步判斷和辨別病毒和細(xì)菌性病原體。4.1.2鏡檢采用放大鏡、解剖鏡、光學(xué)顯微鏡等檢查法。4.1.3分離、培純以及感染試驗(yàn)采用鏡檢方法對(duì)微生物性病原、病毒、細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，如對(duì)微生物性病原、病毒、細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)、培養(yǎng)特征、生理生化反應(yīng)等進(jìn)行觀察、測(cè)定，需要進(jìn)一步進(jìn)行分離、培純以及感染試驗(yàn)。4.2寄生蟲(chóng)類病原體檢查對(duì)比較大的寄生蟲(chóng)性病原體，宜用放大倍數(shù)低的顯微鏡或雙筒解剖鏡檢查。4.2.1玻片下觀察把從器官或組織上分離出的較大的寄生蟲(chóng)直接放在小玻璃皿或玻片上觀察，對(duì)較小的寄生蟲(chóng)要把寄主的器官組織或內(nèi)含物壓成薄層后進(jìn)行觀察。4.2.2鏡檢4.2.2.1檢鰓從每一側(cè)鰓的第一片鰓片接近兩端的位置取鰓組織。4.2.2.2檢口腔先用目檢方法觀察魚(yú)體表面確定有無(wú)吸蟲(chóng)的大胞囊、錨頭藻等，再用鑷子刮取上下頜少許粘液進(jìn)行4.2.2.3檢體腔將魚(yú)腹剖開(kāi)，將器官暴露，觀察脂肪組織、肝、膽囊、脾等有無(wú)肉眼可見(jiàn)的病原體。如發(fā)現(xiàn)有白點(diǎn)，可能是粘孢子蟲(chóng)或微孢子蟲(chóng)。還可發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng)、絳蟲(chóng)、棘頭蟲(chóng)等成蟲(chóng)和囊蚴。目檢完畢后，把腹腔液用吸管吸出，置于培養(yǎng)皿里進(jìn)行檢查。4.2.2.4檢脂肪組織通過(guò)目檢胃腸外壁的脂肪組織，如果發(fā)現(xiàn)白點(diǎn)，肉眼無(wú)法判斷時(shí)，可用鑷子取出，壓片進(jìn)行鏡檢。4.2.2.5檢胃腸先把腸外壁的脂肪組織剔凈，然后在前腸(胃)、中腸和后腸三段上各取少許，滴上生理鹽水進(jìn)行鏡檢。對(duì)寄生部位比較固定的寄生蟲(chóng)，如通常寄生在后腸近肛門(mén)的位置的六鞭毛蟲(chóng)、變形蟲(chóng)、腸袋蟲(chóng)等，通常寄生在前腸(胃)或中腸的復(fù)殖吸蟲(chóng)、絳蟲(chóng)、線蟲(chóng)和棘頭蟲(chóng)等。4.2.2.6檢肝和脾先目檢肝、脾外表顏色和病灶，有無(wú)潰爛、病變、白點(diǎn)和腫瘤等。如有白點(diǎn)，可能是粘袍子蟲(chóng)或者微袍子蟲(chóng)、球蟲(chóng)。然后用鑷子從肝、脾上取少許組織壓片鏡檢。3DB11/T376—20064.2.2.7檢膽囊把膽囊完整取出后，放入培養(yǎng)皿中，先通過(guò)目檢觀察外表顏色和可疑的疾病癥狀，然后剪開(kāi)，放出膽汁，取一部分膽囊壁放在載玻片上壓片進(jìn)行鏡檢。4.2.2.8檢心臟用小剪刀剪開(kāi)胸腔，取下心臟，并將心臟剪開(kāi)，取一滴內(nèi)含物，進(jìn)行鏡檢，檢查是否有錐體蟲(chóng)、隱鞭蟲(chóng)等。同時(shí)取心臟組織少許用玻片壓展法進(jìn)行鏡檢。4.2.2.9檢鰾取魚(yú)鰾時(shí)保持鰾的完整，觀察其外表，然后剪開(kāi)，檢查有無(wú)復(fù)殖吸蟲(chóng)、線蟲(chóng)。同時(shí)取鰾組織少許用玻片壓展法進(jìn)行鏡檢。4.2.2.10檢腎臟把整個(gè)腎臟完整地取出。檢查方法同4.2.2.6。檢查有無(wú)粘孢子蟲(chóng)、球蟲(chóng)、錐體蟲(chóng)、隱鞭蟲(chóng)，復(fù)殖吸蟲(chóng)、線蟲(chóng)等幼蟲(chóng)。4.2.2.11檢性腺和膀胱將左右兩個(gè)性腺完整取出，進(jìn)行目檢。沒(méi)有膀胱的魚(yú)，則檢查輸尿管。4.2.2.12檢眼把完整的魚(yú)眼睛放在玻皿或玻片上，剖開(kāi)鞏膜，放出玻璃體和水晶體，進(jìn)行鏡檢，檢查寄生在眼睛的吸蟲(chóng)幼蟲(chóng)。嚴(yán)重感染吸蟲(chóng)時(shí)，水晶體變白色，混濁不透明，致使魚(yú)眼失明。4.2.2.13檢腦按水平方向，從后向前，在后腦和眼睛之間剪開(kāi)頭蓋骨上壁，即見(jiàn)到充滿著淡灰色泡沫狀的油脂物質(zhì)，用吸管把它吸出，放在玻皿里，以備檢查。吸凈油脂物質(zhì)后，灰白色的腦即顯露出來(lái)，用剪刀把它完整地取出來(lái)檢查。4.2.2.14檢脊髓從頭部與軀干交接處把脊柱骨剪斷，再把身體的尾部與軀干交接處的脊柱骨也剪斷，用鑷子從前端的斷口插入脊髓腔，把脊髓夾住，慢慢地把脊髓整條拉出來(lái)，然后檢查。4.2.2.15檢肌肉從身體的一側(cè)面剖開(kāi)一部分皮膚，用鑷子把皮膚剝?nèi)?，或用小棍?玻棒或竹棒)，象卷紙筒一樣，慢慢地把皮膚卷剝。剝?nèi)テつw后，肌肉即露出來(lái)，經(jīng)目檢后，再進(jìn)行鏡檢。4.3原生動(dòng)物病原體的計(jì)數(shù)原生動(dòng)物不同種類個(gè)體大小差異大，除纖毛蟲(chóng)、毛管蟲(chóng)以顯微鏡低倍視野為單位之外，其他種類如鞭毛蟲(chóng)、變形蟲(chóng)、孢子蟲(chóng)均以顯微鏡的高倍視野為單位。寄生蟲(chóng)或病原體數(shù)量用“十”號(hào)表示，“十”表示有；“++”表示多；“+++”表示很多。必要時(shí)可用文字描述。具體表示法:在一個(gè)視野里，有（1-20）個(gè)蟲(chóng)體記“十”21-50）個(gè)蟲(chóng)體記“++”，51個(gè)蟲(chóng)體以上記“+++”。關(guān)于胞囊的計(jì)數(shù)則用文字說(shuō)明。4.4單殖吸蟲(chóng)、線蟲(chóng)、絳蟲(chóng)、棘頭蟲(chóng)、甲殼動(dòng)物和軟體動(dòng)物幼蟲(chóng)的計(jì)數(shù)在50個(gè)以下均以數(shù)字說(shuō)明，50個(gè)以上則說(shuō)明估計(jì)數(shù)字或者部分器官里的蟲(chóng)體數(shù)。4.5檢查時(shí)所用的顯微鏡的倍數(shù)顯微鏡倍數(shù)都應(yīng)注明，低倍顯微鏡為10倍；高倍顯微鏡為10倍～40倍。微型病原體數(shù)量的計(jì)算，是以同一玻片中觀察的平均數(shù)為準(zhǔn)。5病原體的收集操作對(duì)需要通過(guò)詳細(xì)觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)才能鑒定和需要進(jìn)一步研究的病原體，應(yīng)做好其標(biāo)本的收集、固定和保存。5.1病毒4DB11/T376—2006收集病毒性病原體標(biāo)本，應(yīng)在無(wú)菌操作下收集發(fā)病早期的病魚(yú)帶毒最多的組織器官，保證病毒不致滅活。5.1.1病毒材料的收集取出病變的器官組織置于無(wú)菌器皿中，然后置于50%的磷酸緩沖甘油中。注明收集地點(diǎn)、日期和寄主種類。實(shí)驗(yàn)室距現(xiàn)場(chǎng)較近，可以直接檢測(cè)，若實(shí)驗(yàn)室距現(xiàn)場(chǎng)較遠(yuǎn)，需把病魚(yú)或病魚(yú)器官組織放入有冰塊的保溫瓶中，快速運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室。保存溫度在-2O℃~50℃。5.1.2病毒的分離培養(yǎng)由于病毒只能在活的組織細(xì)胞中繁殖，魚(yú)類病毒分離培養(yǎng)應(yīng)通過(guò)組織培養(yǎng)。5.1.3病原懸液的制備將保存在50%緩沖甘油的標(biāo)本(樣品)，用無(wú)菌生理鹽水沖洗3次，如是新鮮收集的器官組織材料，測(cè)量重量后，用剪刀剪碎，按樣品重量加入適當(dāng)比例的緩沖生理鹽水(比例為1:10至1:20)，用勻漿器或乳缽將樣品研成乳狀，以3000轉(zhuǎn)/min速度離心20min，吸取上清液，按體積1ml加入青霉素800國(guó)際單位、鏈霉素800μg，在30℃左右處理2h，然后于5℃保存?zhèn)溆?。將離心后的上清液，經(jīng)濾器過(guò)濾除菌，濾液保存?zhèn)溆谩?.1.4魚(yú)體造病感染采用注射或浸泡兩種方法，同時(shí)設(shè)對(duì)照組觀察。5.1.4.1注射感染將病原懸液配成一定濃度，從魚(yú)體腹鰭基部進(jìn)行腹腔注射，用量視魚(yú)體的大小而定，通常每尾注射0.2ml～0.4ml。注射后放入水族箱中飼養(yǎng)，維持發(fā)病水溫，觀察發(fā)病情況。5.1.4.2浸泡感染將病原懸液和無(wú)氯自來(lái)水稀釋成一定濃度，將健康魚(yú)放入其中浸泡30min后，移至水族箱中飼養(yǎng)，維持發(fā)病水溫，連續(xù)觀察魚(yú)的發(fā)病情況。5.1.5細(xì)胞培養(yǎng)與感染采取組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行病毒的分離、培養(yǎng)，制備純凈的病毒抗原，通過(guò)血清學(xué)試驗(yàn)(如中和試驗(yàn))與感染細(xì)胞的特異變化來(lái)進(jìn)行病毒的鑒定和抗血清效價(jià)的滴定等。5.1.6原代細(xì)胞培養(yǎng)選擇健康魚(yú)，在無(wú)菌操作下解剖，取出組織，置于盛有EarIe氏平衡鹽溶液的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用鑷子小心除去附著的組織和血塊，然后移入瓶中，用Earle氏液洗滌2次，將組織剪碎，成為約lmm大小的組織塊，再用Earle氏液洗1次，加入相當(dāng)于組織量10倍(約1份組織加入9份胰酶)的25%的胰酶，在25℃消化20min～30min，消化完畢，棄去胰酶液，用Earle氏液清洗2次，然后加入Eagle's生長(zhǎng)液(Eagle's液加入10%小牛血清、青霉素100單位/ml、鏈霉素100μg/ml，用5%NaHCO3，調(diào)節(jié)pH7.2～7.4)，用吸管反復(fù)吸吹，以助細(xì)胞分散，靜置片刻，讓沒(méi)有分散的大顆粒沉下，然后吸取上層的細(xì)胞懸液，稀釋成100萬(wàn)單位/ml的濃度，接種入培養(yǎng)瓶(若采用青霉素瓶作培養(yǎng)瓶，則每瓶分裝1毫升即可)，蓋緊瓶塞，置溫箱內(nèi)(溫水性魚(yú)類可在22℃~28℃)培養(yǎng)。每隔3d～4d更換培養(yǎng)液1次，逐日在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。Earle氏溶液配方見(jiàn)附錄A。5.1.7病毒接種選取生長(zhǎng)均勻的單層細(xì)胞培養(yǎng)物，在無(wú)菌操作下，吸出細(xì)胞瓶?jī)?nèi)舊的培養(yǎng)液，以Earle氏液清洗細(xì)胞1次，然后接種入上述制備好的病原懸液(青霉素瓶可接種0.2ml～0.4ml)，在28℃吸附30min~60min，然后棄去瓶?jī)?nèi)的病原懸液，加入與原來(lái)培養(yǎng)液等體積的維持液(即Eagle液含2%～6%小牛血清、青霉素100單位/ml、鏈霉素100μg/ml，pH7.2～7.4)，置于28℃的條件下培養(yǎng)，在顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞病變。不同病毒應(yīng)按照不同的病毒接種方法進(jìn)行。5.1.8病毒株的保存5.1.8.1低溫冷凍保存5DB11/T376—2006若在短期內(nèi)使用,應(yīng)將含有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液或含有病毒的組織器官暫時(shí)保存于-20℃~-80℃的低溫冰箱或液氮中。材料應(yīng)貼好標(biāo)簽，注明毒株名稱、代數(shù)及日期。5.1.8.2真空干燥保存長(zhǎng)期保存病毒活力可采用真空干燥方法。但應(yīng)使用適宜的保護(hù)劑制備病毒的懸液，保護(hù)劑有正常滅活血清、卵白和卵黃、蔗糖飽和液等。5.2細(xì)菌5.2.1細(xì)菌類病原體標(biāo)本的收集取得病魚(yú)標(biāo)本后，應(yīng)立即送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。在野外調(diào)查的流動(dòng)條件下，或離實(shí)驗(yàn)室較遠(yuǎn)，可采用如下方法將病魚(yú)標(biāo)本暫時(shí)保存?！鶋K法將病魚(yú)(要取未死或剛死的病魚(yú))放入盛有冰塊的瓶里，然后送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分——棉拭子法如果是血液或分泌物等，宜采用棉花團(tuán)擦抹患病的部位，然后將抹有病患部位含有物的棉拭子送往實(shí)驗(yàn)室。5.2.2分離培養(yǎng)用浸過(guò)70%酒精的紗布覆蓋病魚(yú)體表，進(jìn)行魚(yú)體表面消毒后，取少許病灶部位組織，接種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基使之生長(zhǎng)，或直接在固體平板培養(yǎng)基中劃線分離。分離后挑選單個(gè)菌落進(jìn)行培養(yǎng)。5.2.2.1分離內(nèi)部器官如腸、肝、腎等則用無(wú)菌手術(shù)法剖開(kāi)腹部后，用灼熱鐵片燙后再用接種環(huán)取出進(jìn)行材料分離。5.2.3采心血在心房處燙過(guò)的部位，以無(wú)菌接種針刺入，然后接種在培養(yǎng)基上進(jìn)行分離。5.2.4人工感染試驗(yàn)人工感染的接種方法有浸泡、口服、注射、涂抹等。例如魚(yú)體表面的病癥可采用浸泡、口服、注射等方法。多次反復(fù)試驗(yàn)(包括再分離再感染)后，根據(jù)其出現(xiàn)的病癥，判斷所分離的細(xì)菌是否具有致病性，并根據(jù)菌落形態(tài)和培養(yǎng)特征、生理生化反應(yīng)測(cè)定病菌的分類位置和名稱。5.3水生真菌對(duì)真菌菌絲體外部形態(tài)特征進(jìn)行目檢，初步判斷真菌病原體種類。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，鑒定其種類。5.3.1培養(yǎng)方法采用培養(yǎng)基，通過(guò)水生真菌的無(wú)性繁殖，使它的孢子以及菌絲在培養(yǎng)基上長(zhǎng)成新的菌絲體。5.3.1.1大麻子仁或大麥等制作培養(yǎng)基:將大麻子仁煮沸消毒后，選取吸水飽滿的大麻子仁2?！?粒，放入盛有無(wú)菌水的培養(yǎng)皿里，并使每粒大麻子仁互相間隔有一定距離，以利菌絲充分生長(zhǎng)。如果沒(méi)有大麻子仁，可用大麥、小麥或糯谷代替。5.3.1.2雞蛋黃制作培養(yǎng)基將雞蛋煮熟后，取蛋黃，放入已消毒的燒杯中，蓋上蓋子，取米粒大小的蛋黃粒，置于盛有無(wú)菌水的培養(yǎng)皿里。5.3.1.3動(dòng)物尸體制作培養(yǎng)基將動(dòng)物尸體用蒸餾水沖洗數(shù)次后，在解剖鏡下選取所需要的部位，置于盛有無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中。如蒼蠅以及各種水生昆蟲(chóng)的腹部和附肢，都可作為培養(yǎng)基。5.3.1.4魚(yú)卵制作培養(yǎng)基取各種魚(yú)卵，用60℃~80℃的熱水浸泡10min，使魚(yú)卵失去活力，然后取出放入盛有無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中備用。消毒處理后可作為水生真菌的培養(yǎng)基。5.3.2接種法按生物學(xué)規(guī)定的接種法進(jìn)行操作。6病原體標(biāo)本的保存操作6DB11/T376—20066.1培養(yǎng)基保存法在菌種較少又經(jīng)常使用時(shí)，保持其條件不變者可采用此法。由于培養(yǎng)基的物理化學(xué)性質(zhì)因細(xì)菌的代謝而發(fā)生變化，影響細(xì)菌的性狀，而且操作麻煩，需要不斷地多次傳代。因此，此法不作為長(zhǎng)期保存之6.2冷凍真空干燥保存法在各種保存菌種的方法中，以冷凍干燥法最為理想。在冷凍狀態(tài)下干燥和在真空狀態(tài)下封閉保存，使菌種失去代謝所必需的水分，構(gòu)成保持細(xì)菌長(zhǎng)久不變的良好條件，可避免保存過(guò)程中影響菌種的性狀和因操作造成的污染和變異。此法可長(zhǎng)期保存菌種。6.3水生真菌類的保存6.3.1水霉從感染水霉的病魚(yú)病灶上取下水霉的部分菌絲，用5%的福爾馬林保存。6.3.2鰓霉用蓋片涂抹法涂片，用5%福爾馬林保存患鰓霉病的部分鰓組織。6.4原生動(dòng)物的保存6.4.1涂片法——蓋片涂抹法:適用于所有的微小寄生蟲(chóng)?！赏科蜐裢糠ǎ哼m用于體液中或血液中的原生動(dòng)物?！和科ǎ河梦⑽芪∫恍〉窝海糜诩s占載玻片長(zhǎng)度3/4的位置上，右手握著同樣大小的另一塊載玻片，一端與放有血滴的載玻片上的血滴前面接觸，而與平置桌面上的載血玻片約成40度角傾斜，然后將血滴向前輕輕地推移?！善苽浞ǎ翰煌ㄟ^(guò)固定液固定，讓材料在空氣中干燥后，再進(jìn)行染色。采用硝酸銀法染色后，可觀察斜管蟲(chóng)的腹部纖毛線，小瓜蟲(chóng)、腸袋蟲(chóng)等的纖毛線，車輪蟲(chóng)的齒環(huán)等結(jié)構(gòu)。6.4.270%酒精或4%福爾馬林浸泡法用濃度為70%酒精或濃度為4%福爾馬林浸泡固定魚(yú)體病變器官或組織。6.5蠕蟲(chóng)類蠕蟲(chóng)類包括單殖吸蟲(chóng)、復(fù)殖吸蟲(chóng)、絳蟲(chóng)、線蟲(chóng)、棘頭蟲(chóng)、環(huán)節(jié)動(dòng)物等類群。6.5.1單殖吸蟲(chóng)用2根解剖針(最好竹針)，在解剖鏡下將粘附在鰓片上的蟲(chóng)體挑出，再用吸管吸取，置于盛有清水的玻皿里，用甘油、4%福爾馬林或聚乙烯醇把蟲(chóng)體封固。6.5.2復(fù)殖吸蟲(chóng)復(fù)殖吸蟲(chóng)的成蟲(chóng)，大多數(shù)寄生在魚(yú)體的消化道內(nèi)。收集標(biāo)本時(shí)，將魚(yú)的消化道剪開(kāi)，用解剖刀輕輕刮下腸壁的內(nèi)含物及腸粘液，放入培養(yǎng)皿，加入生理鹽水進(jìn)行攪拌后，用吸管吸去混濁的水，再重新加入新水，連續(xù)更換數(shù)次，直至澄清，然后在解剖鏡下檢查，逐一把蟲(chóng)體吸出。標(biāo)本固定前，應(yīng)把粘附在蟲(chóng)體上的粘液和組織碎片沖洗干凈。用吸管沖洗時(shí)，防止吸管把寄生蟲(chóng)帶到另一個(gè)培養(yǎng)皿中去。復(fù)殖吸蟲(chóng)的固定，應(yīng)使蟲(chóng)體盡量伸展而又不致蟲(chóng)體破裂。6.5.3絳蟲(chóng)首先把蟲(chóng)體從組織或器官中取出。固定前，應(yīng)把蟲(chóng)體置于水里，待蟲(chóng)體充分伸展時(shí)，再把蟲(chóng)體壓在兩塊玻片之間，保存在70%的酒精里。6.5.4線蟲(chóng)將收集到的線蟲(chóng)標(biāo)本放在盛有生理鹽水的玻璃試管中適當(dāng)?shù)負(fù)u動(dòng)，將蟲(chóng)體上的污物洗凈后再行固6.5.5棘頭蟲(chóng)棘頭蟲(chóng)的固定和保存方法與復(fù)殖吸蟲(chóng)相似。應(yīng)使吻部伸出后進(jìn)行固定。7DB11/T376—20066.6軟體動(dòng)物(鉤介幼蟲(chóng))和甲殼動(dòng)物類6.6.1鉤介幼蟲(chóng)宜用70%酒精固定保存。6.6.2甲殼動(dòng)物寄生在魚(yú)的體表，蟲(chóng)體較大?？捎?0%酒精或3%～4%的福爾馬林溶液固定，保存在70%酒精中。組織切片標(biāo)本則用葡翁氏液固定。葡翁氏液配方見(jiàn)附錄B。6.6.3藻類等水生植物水生植物中的藻類，如青泥苔、水網(wǎng)藻等，可放入盛有4%福爾馬林的標(biāo)本瓶里固定保存。采集到的水生植物和水草標(biāo)本，可以選擇較完整(有花、果實(shí)和枝葉)的植株，用草紙或適當(dāng)?shù)奈垑褐瞥筛蓸?biāo)本保存。植物體盡可能按照它的生活狀態(tài)，擺在壓制紙上，上面再蓋上壓制紙，夾在壓制板內(nèi)。6.6.4水生昆蟲(chóng)及較大的水生敵害動(dòng)物等用10%福爾馬林固定和保存。7病原體的鑒定7.1病毒7.1.1用光學(xué)顯微鏡檢查鑒定制成涂片、壓片、或石蠟切片等進(jìn)行檢查。包括用吉姆薩（Giemsa）染色法等染色檢查。7.1.2電子顯微鏡法檢查鑒定染色方法與細(xì)胞學(xué)的染色方法相同。染色后采用電子顯微鏡檢查，用微觀照相或攝像對(duì)檢查過(guò)程進(jìn)行拍照。7.1.3利用血清學(xué)診斷鑒定采用中和試驗(yàn)對(duì)魚(yú)類病毒傳染病進(jìn)行血清學(xué)診斷。在培養(yǎng)的組織細(xì)胞或魚(yú)體中，將毒懸液與抗血清按比例混合中和，然后將病毒、血清混合接種于寄主系統(tǒng)，測(cè)定病毒的感染力和抗血清的效價(jià)。7.1.4利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)診斷鑒定PCR技術(shù)具有高度敏感性和特異性，能將微量的特定DNA片段在數(shù)小時(shí)內(nèi)特異地快速擴(kuò)增至數(shù)百萬(wàn)倍，快速省時(shí)，廣泛應(yīng)用于DNA和RNA檢測(cè)，在病毒感染的診斷中，PCR技術(shù)可檢測(cè)出正在增殖和潛伏的病毒，也可診斷不能或難于在體外培養(yǎng)的病毒。具體操作按照儀器用法指導(dǎo)進(jìn)行。7.1.5利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）診斷鑒定ELISA方法是在酶的催化作用下使原來(lái)的底物發(fā)生水解、氧化或其它反應(yīng)，生成有色產(chǎn)物，可進(jìn)行定性或半定量分析?；蛴梅止夤舛扔?jì)進(jìn)行進(jìn)一步分析。7.1.6瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)7.1.6.1雙相瓊脂擴(kuò)散法置室溫下作用24h，觀察結(jié)果。如抗原抗體兩孔出現(xiàn)清晰的白色沉淀線，則為陽(yáng)性反應(yīng)，無(wú)沉淀線為陰性反應(yīng)。7.1.6.2單相瓊脂擴(kuò)散法配成3%瓊脂，再與等量的抗血清混合，即成1.5%瓊脂。然后打孔，孔距5到10mm，向孔內(nèi)加入較濃的抗原液，也可做不同稀釋度，抗原量使之與瓊脂板相平即可。然后平置室溫5min-15min，觀察結(jié)果?？字車霈F(xiàn)乳白色沉淀環(huán)的為陽(yáng)性。7.1.7熒光抗體技術(shù)預(yù)先制備好熒光抗體，可以在24h內(nèi)獲得診斷結(jié)果，具體準(zhǔn)備工作和操作方法按照有關(guān)指導(dǎo)進(jìn)行。熒光抗體活性測(cè)定方法按一般血清學(xué)方法，如抗球蛋白熒光抗體可用環(huán)狀沉淀試驗(yàn)測(cè)其效價(jià)；抗病毒熒光抗體可用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)測(cè)其效價(jià)；抗細(xì)菌熒光抗體可用凝集試驗(yàn)測(cè)其效價(jià)。7.2細(xì)菌8DB11/T376—2006在顯微鏡下觀察細(xì)菌的大小、形狀、細(xì)胞排列、有無(wú)莢膜和芽孢、有無(wú)鞭毛、鞭毛的數(shù)目及排列、革蘭氏染色反應(yīng)、培養(yǎng)和菌落的特征等，初步鑒定細(xì)菌的類型。根據(jù)細(xì)菌的具體類型，按照細(xì)菌檢測(cè)的指導(dǎo)方法，進(jìn)一步鑒定其具體種類。7.3水生真菌類通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察其活體的形態(tài)結(jié)構(gòu)或經(jīng)福爾馬林(或酒精)等溶液浸泡保存的標(biāo)本，可鑒定其種根據(jù)動(dòng)孢子囊的產(chǎn)生方式、形狀、位置，以及產(chǎn)生的動(dòng)孢子數(shù)量、形狀、鞭毛著生和發(fā)育情況等，可以區(qū)分出各個(gè)屬。7.4藻類及寄生蟲(chóng)除觀察其活體標(biāo)本外，其余應(yīng)采用固定劑固定和染色后，在顯微鏡下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，確定其屬、8病原體標(biāo)本材料的記錄、標(biāo)簽和整理制好的標(biāo)本，都應(yīng)有詳細(xì)的記錄和標(biāo)簽。標(biāo)簽上應(yīng)注明編號(hào)、當(dāng)?shù)孛Q、采集時(shí)間、采集地點(diǎn)、病原體在當(dāng)?shù)氐奈：η闆r、寄主生物的情況、病原體的流行情況等。8.1材料的記錄和標(biāo)簽8.1.