第八章外源化學(xué)物的特殊毒性生殖是使種族延續(xù)的各種生理過程的總稱。生殖過程一般是指從配子形成直到胎兒娩出的整個過程，因此具有廣泛的含義，其中包括精子的發(fā)生、卵的形成、配子的釋放、受精、卵裂和胚泡發(fā)育、著床、胚胎發(fā)生、胎兒發(fā)育、分娩。而胎兒的娩出也并不意味著胎兒發(fā)育成熟的終止，從廣義上說還應(yīng)包括胎兒娩出后的新生兒期、哺乳期、直到性成熟的整個過程。

化學(xué)品對生殖發(fā)育的損害不僅與妊娠母體有關(guān)，帶有致畸因子的雄性也會使胎仔發(fā)生畸形。例如給雄鼠經(jīng)口染毒反應(yīng)停，使之與未染毒的雌鼠交配，引起嚴(yán)重的胎仔畸形。接觸二硫化碳男工的配偶發(fā)生流產(chǎn)，早產(chǎn)或分娩畸胎兒增多。對生殖發(fā)育有害的化學(xué)品不僅能作用于妊娠器官形成期，造成形態(tài)畸形，對妊娠前期的影響還可發(fā)生不育，對胎期的毒效應(yīng)，可在出生后觀察到發(fā)育、行為、代謝功能的障礙或子代腫瘤發(fā)生率增高。所以綜合考慮有害環(huán)境因素對母體和父體的影響，將形態(tài)致畸與行為致畸結(jié)合起來進(jìn)行觀察，將生殖毒性和發(fā)育毒性結(jié)合起來進(jìn)行研究已是發(fā)展的趨勢。第一節(jié)生殖發(fā)育毒性及評價方法一、基本概念1、生殖毒性：

指對雄性和雌性生殖功能或能力的損害和對后代的有害影響。生殖毒性既可發(fā)生于妊娠期，也可發(fā)生于妊前期和哺乳期。表現(xiàn)為外源化學(xué)物對生殖過程的影響，例如生殖器官及內(nèi)分泌系統(tǒng)的變化，對性周期和性行為的影響，以及對生育力和妊娠結(jié)局的影響等。2、發(fā)育毒性

指出生前經(jīng)父體和(或)母體接觸外源性理化因素引起的在子代到達(dá)成體之前出現(xiàn)的有害作用。具體表現(xiàn)可分為:

發(fā)育生物體死亡：指受精卵未發(fā)育即死亡，或胚泡未著床即死亡，或著床后生長發(fā)育到一定階段死亡。早期死亡被吸收或自子宮排出(即自然流產(chǎn))，晚期死亡成為死胎。生長改變：即生長遲緩。能引起胚胎死亡和畸形的毒物多數(shù)能引起生長遲緩。一般認(rèn)為胎兒的生長發(fā)育指標(biāo)比正常對照的均值低2個標(biāo)準(zhǔn)差時，即可定為生長遲緩。胎鼠胸骨及枕骨骨化遲緩及低出生體重等是生長遲緩的較敏感指標(biāo)。生長遲緩造成的局部發(fā)育不全可視為畸形，如腦小畸形和眼小畸形等。功能缺陷：包括器官系統(tǒng)、生化、免疫等功能的變化。功能缺陷往往要在出生后經(jīng)過相當(dāng)時間才能診斷。如聽力或視力異常、行為發(fā)育遲緩等。結(jié)構(gòu)異常：指胎兒形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，即畸形。致畸性是指化學(xué)物在胚胎發(fā)育期間引起永久的結(jié)構(gòu)與功能異常的性質(zhì)。致畸物是指出生前接觸，誘發(fā)永久的結(jié)構(gòu)與功能異常的物質(zhì)。3、畸形、畸胎和致畸物畸形:器官形態(tài)的異常。

畸胎:具有畸形的胚胎或胎仔。

致畸物或致畸原:凡在一定劑量下，能通過母體對胚胎或胎兒正常發(fā)育過程造成干擾，使子代出生后具有畸形的化合物。

致畸試驗:評定外源化學(xué)物是否具有致畸作用的試驗。

胚胎毒性作用

外源化學(xué)物引起的胎仔生長發(fā)育遲緩和功能缺陷不全的損害作用。其中不包括致畸和胚胎致死作用。母體毒性作用

母體毒性作用是指外源化學(xué)物在一定劑量下，對受孕母體產(chǎn)生的損害作用。具體表現(xiàn)包括體重減輕、出現(xiàn)某些臨床癥伏、直至死亡。

母體毒性作用與致畸作用關(guān)系具有致畸作用，但無母體毒性出現(xiàn)。出現(xiàn)致畸作用的同時也表現(xiàn)母體毒性。不具有特定致畸作用機(jī)理，但可破壞母體正常生理穩(wěn)態(tài)。僅具有母體毒性，但不具有致畸作用。在一定劑量下，既不呈現(xiàn)母體毒性，也未見致畸作用。

畸形與變異在胚胎或胎兒出現(xiàn)器官形態(tài)結(jié)構(gòu)異常稱為畸形。機(jī)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)或生理功能，在同一物種的子代與親代之間或子代的個體之間，有時出現(xiàn)不完全相同的現(xiàn)象，即為變異。

二、致畸作用的毒理學(xué)特點器官發(fā)生期的胚胎對致畸物最為敏感劑量與效應(yīng)關(guān)系較為復(fù)雜劑量效應(yīng)關(guān)系復(fù)雜的表現(xiàn)及原因致畸作用的劑量反應(yīng)曲線較為陡峭致畸作用最大無作用劑量問題尚有不同意見

物種差異以及個體差異在致畸作用中較為明顯在不同動物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的類型也不一致。種間差異即同一物種中不同品系之間存在的差異，在致畸作用中也極明顯。

三、致畸作用機(jī)理

Wilsom(1977)提出了畸形發(fā)生的9種機(jī)制，包括突變、染色體斷裂、有絲分裂改變、改變核酸完整性或功能、減少前體或底物的補(bǔ)給、減少能源支持、改變膜特性、滲透壓不平衡和酶抑制作用。近年來在分子水平的研究有很大的進(jìn)展，雖然胚胎有代償機(jī)制彌補(bǔ)外源性化學(xué)物的影響，但是，是否產(chǎn)生畸形依賴于在致病過程中的每個步驟在損傷和修復(fù)之間的平衡。

干擾基因表達(dá)基因突變與染色體畸變損傷細(xì)胞和分子水平的翻譯細(xì)胞調(diào)亡干擾細(xì)胞通過胎盤毒性引起發(fā)育毒性干擾母體穩(wěn)態(tài)內(nèi)分泌干擾作用

四、生殖與發(fā)育毒性的特點及靶器官生殖與發(fā)育過程包括配子(精子與卵子)的發(fā)育與形成、交配、受精、合子形成與植入、胚胎形成與發(fā)育、分娩等階段。生殖與發(fā)育過程的每個階段所涉及的細(xì)胞或器官都可能成為外源化學(xué)物毒作用的靶。1.親性腺作用(性腺毒性)某些化學(xué)物可作用于性腺，影響生殖器官的發(fā)育與性腺成熟，或造成性腺組織病理學(xué)改變。某些化學(xué)物可影響配子的發(fā)生、增殖和成熟，使生殖細(xì)胞數(shù)量減少，功能減退及突變。。生殖細(xì)胞突變造成的畸胎與妊娠期內(nèi)接觸毒物的致畸作用不同，前者突變發(fā)生于父體或母體的性細(xì)胞中，突變誘發(fā)的畸形可傳給后代。后者突變發(fā)生在胚胎的體細(xì)胞中，引起的畸形不具有遺傳性。已知的親性腺毒物有多種，包括固醇類藥物，化療藥物，有機(jī)磷和有機(jī)氯農(nóng)藥，鎘、鉛、汞和二硫化碳等。外源化學(xué)物對生殖與發(fā)育過程的損害主要有以下幾個方面：

2.親胚體作用(胚體毒性embryotoxicity)某些化學(xué)物可作用于妊娠早期(即從受孕到胚體形成階段)，對胚體發(fā)育產(chǎn)生損害作用。某些化學(xué)物可以降低胚體對必需營養(yǎng)素的利用度，如EDTA降低胚體對微量元素的利用度，氨基蝶呤降低胚體對葉酸的利用度。當(dāng)給予母體這些化學(xué)物時，可導(dǎo)致與缺乏這些必需營養(yǎng)素相似的胚體毒性。胚體毒性、胎體毒性(fetotoxicity)和胚胎毒性(embryo-fetaltoxicity)是指由出生前接觸引起對孕體的任何有害影響，包括結(jié)構(gòu)和功能異常，或這種影響在出生后的表現(xiàn)。這些術(shù)語與有害作用誘發(fā)的瞬間／時期有關(guān)，而不考慮檢測的時間。

3.親胎盤作用(胎盤毒性placentaltoxicity)某些化學(xué)物可對胎盤造成損傷，改變胎盤血流量，降低胎盤對營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，特異地干擾胎盤功能(如內(nèi)分泌和代謝功能)。例如5-羥色胺使小鼠動、靜脈狹窄，胎盤血流量減少，胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙，引起死胎和先天畸形；甲基汞改變?nèi)颂ケP滋養(yǎng)層微絨毛對不能代謝的氨基酸的攝取，而致功能致畸，即先天水俁病?；純簢?yán)重神經(jīng)遲鈍，共濟(jì)失調(diào)，步行困難，語言、咀嚼，下咽困難和大發(fā)作性癲癇。除上述外，化學(xué)物還可引起胎期毒性，哺乳期毒性(通過乳汁致嬰兒中毒，如鉛中毒)，和通過對中樞神經(jīng)系統(tǒng)及全身機(jī)能狀態(tài)的毒作用來影響生殖過程。某些化學(xué)物還能經(jīng)胎盤致癌即致癌物由母血經(jīng)胎盤進(jìn)入胚胎，造成胚胎期接觸，引發(fā)后代腫瘤。

化學(xué)物的生殖發(fā)育毒性有兩個顯著的特點：一是生殖過程較機(jī)體的其他系統(tǒng)或功能對某些化學(xué)物的毒作用更為敏感，在成體系統(tǒng)毒性的未觀察到有害作用的水平(NOAEL)胎兒即可受到影響。例如妊娠期接觸過不足以引起腫瘤的低劑量二乙基亞硝胺，仔鼠成年后再次接觸，則腫瘤發(fā)生率增加。二是損害作用不僅表現(xiàn)在接觸化學(xué)物質(zhì)的機(jī)體本身，還可影響其后代。例如母鼠接觸高濃度二硫化碳引起致畸作用，其子一代既使不再接觸二硫化碳，交配后所生的子二代仔鼠也出現(xiàn)與子一代仔鼠幾乎完全相同的畸變類型。環(huán)境流行病學(xué)控制的臨床研究動物生殖與發(fā)育毒性試驗體外篩選試驗01030204生殖與發(fā)育毒性試驗的目的和實驗設(shè)計

生殖與發(fā)育毒性研究的目的是揭示化學(xué)品／藥品對哺乳動物生殖發(fā)育的任何有害影響將研究的結(jié)果與所有可以得到的其他藥理學(xué)和毒理學(xué)資料聯(lián)系起來，以推測對人可能造成的生殖危險研究應(yīng)包括成年動物和從受孕到子代性成熟的各個發(fā)育階段接觸受試物為檢測接觸所致的即發(fā)和遲發(fā)效應(yīng)，應(yīng)連續(xù)通過一個完整的生命周期，即從親代受孕到子一代受孕B階段受孕到著床：檢查成年雌性生殖功能，胚胎著床前發(fā)育、著床。D階段硬腭閉合到妊娠結(jié)束：檢查成年雌性生殖功能、胎體的發(fā)育與生長，器官的發(fā)育與生長。E階段出生到斷乳：檢查成年雌性生殖功能，新生仔對宮外生活的適應(yīng)，斷乳前的發(fā)育與生長。ClicktoaddTextF階段斷乳到性成熟：檢查斷乳后的發(fā)育與生長，對獨立生活的適應(yīng)，達(dá)到完全的性功能。C階段著床到硬腭閉合：檢查成年雌性生殖功能，胎體發(fā)育，主要器官形成。A階段交配前到受孕：檢查成年雄性和雌性生殖功能，配子的發(fā)育與成熟，交配行為，受精。一、實驗設(shè)計1、動物選擇

必須以哺乳動物為實驗對象。一般要求使用與其他毒理學(xué)研究中相同的物種與品系，以免必須進(jìn)行另外的預(yù)試驗。原則上實驗動物對受試物的動力學(xué)、毒效學(xué)及其他有關(guān)參數(shù)應(yīng)與人最接近，如代謝過程與生物轉(zhuǎn)化應(yīng)與人相近、胎盤結(jié)構(gòu)與人相似、健康、生育力強(qiáng)、多產(chǎn)、孕期短、自發(fā)畸形率低、價廉、易得和操作方便。首選嚙齒類中的大鼠，因用大鼠獲得的其他實驗結(jié)果有可比性并積累了大量的背景資料。在胚體——胎體毒性研究中，傳統(tǒng)上要求用第二種哺乳動物進(jìn)行試驗。家兔因其也有較廣泛的背景資料和比大鼠更接近人的代謝類型而作為“非嚙齒類”優(yōu)選使用。但家兔孕期長短不定(32～36天)，有時缺乏毒性資料，對某些抗生素和消化道紊亂有易感性，在其他生殖毒性研究中較少用。1）劑量劑量選擇應(yīng)依據(jù)從所有已進(jìn)行的藥理學(xué)、急性和慢性毒性、以及動力學(xué)研究中得到的資料。高劑量應(yīng)該在母體中產(chǎn)生輕度的毒性，如體重增長減少，體重增長速度改變(與擾亂了內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的機(jī)理有關(guān))、特異的靶器官毒性、藥理學(xué)反應(yīng)增強(qiáng)(如鎮(zhèn)靜、驚厥)、陰道出血、流產(chǎn)等。在研究中，要對所觀察到的效應(yīng)進(jìn)行劑量—反應(yīng)關(guān)系分析時，推薦至少用三個劑量水平和適當(dāng)?shù)膶φ战M。低劑量不應(yīng)有任何可歸因于受試物的有害作用。中劑量組應(yīng)在高、低劑量之間按等比級差定位，應(yīng)引起最小的毒作用。如果對結(jié)果有懷疑，應(yīng)增加第四個劑量組，以免劑量間隔過大。實驗結(jié)果應(yīng)提供最高未觀察到有害作用水平的劑量，否則應(yīng)對該受試物進(jìn)行進(jìn)一步深入的研究。2、染毒原則高劑量進(jìn)行的初步研究中，有明顯的母體毒性的證據(jù)而未顯示對胚胎的有害作用，也沒有必要進(jìn)行其他劑量水平的研究。最高限量劑量為1g(kg·d)假如仍未引起血漿和組織濃度增加時，可略微增加染毒劑量。測試低毒物質(zhì)時，假如劑量達(dá)1g(kg·d)仍不產(chǎn)生胚胎毒性或致畸，則沒有必要進(jìn)行其他劑量水平的研究。2）接觸途徑與頻率3）對照組應(yīng)與人的接觸途徑相同，如果采用其他接觸途徑，必須依據(jù)動力學(xué)的資料。接觸頻率一般是一日一次，每日在相同時間染毒，并按體重調(diào)整染毒劑量。用與試驗組相同的最大容量的賦形劑。當(dāng)賦形劑可能有不良影響(如減少食物的攝取和利用)或影響受試物的作用時，應(yīng)再設(shè)未處理對照組。二、三段試驗方案

用一組試驗研究全部生殖毒性的終點是不可能的，所以在決定適當(dāng)?shù)牟呗院瓦x擇研究設(shè)計時，應(yīng)考慮該受試物和其類似物質(zhì)所有可能得到的藥理學(xué)、動力學(xué)和毒理學(xué)資料。對大多數(shù)醫(yī)藥產(chǎn)品來說，三段生殖毒性試驗設(shè)計通常是適當(dāng)?shù)?。關(guān)鍵因素是各個生殖階段之間不得有間隔，即在三個有關(guān)聯(lián)的階段接觸受試物的時期至少有一天的重迭，并能直接或間接地評價生殖過程的所有階段。三段生殖毒性試驗由生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗，胚體——胎體毒性試驗(致畸試驗)和出生前后發(fā)育毒性試驗(圍產(chǎn)期毒性試驗)三部分組成(下圖)。三段的劃分是按有害作用誘發(fā)的時期，而不考慮檢測的時間。Ⅰ生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗Ⅱ胚體——胎體毒性試驗(致畸試驗)Ⅲ出生前后發(fā)育毒性試驗1、生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗1）研究目的評價化學(xué)物對配子成熟、交配行為、生育力、胚胎著床前和著床的影響(包括前述生殖發(fā)育過程A和B階段的評價)。雌性對動情期、輸卵管運(yùn)輸、著床和胚胎著床前階段發(fā)育的影響。雄性檢測對功能的影響(例如性欲、附睪的精子成熟等)。1、生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗2）動物至少一種，首選大鼠。每組性別、每組的動物數(shù)應(yīng)足以對數(shù)據(jù)進(jìn)行有意義的解釋。建議每組性別各半、每組16~20只。1、生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗3）給藥期應(yīng)說明交配前染毒時間的長度并提供依據(jù)。一般采取雄性交配前四周開始重復(fù)染毒，直至交配成功。若要保證雌性受孕成功，雄性也可繼續(xù)染毒，仍同籠至處死。雌性交配前兩周開始染毒(可覆蓋至少兩個完整的動情期)直至著床。4）交配及受孕檢查雄大鼠給藥4周，雌大鼠給藥2周后開始同籠。交配期2~3周，交配比例1∶1。實驗程序應(yīng)能識別出各窩的2個親本，以避免不正確結(jié)果的分析和解釋。1、生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗5）終末處死雌性一般在孕中期第13-15天終止妊娠。雄性在證實交配并受孕成功后處死檢查。

1、生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗6）觀察項目染毒期間觀察雌、雄親代體征和死亡(至少1次／日)，體重和體重改變(至少2次／周)，攝食量(1次／周)，鏡檢雌性陰道涂片(交配期間1次／天)和其他毒性研究中見到的靶效應(yīng)。1、生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗7）結(jié)果評定綜合對F0代觀察的各項指標(biāo)和參數(shù)，用合適的統(tǒng)計方法分析和評價。在分析對胎體(子一代)的影響時，應(yīng)考慮下述參數(shù)：各組受影響的窩數(shù)比；每窩受影響的胎體的組平均百分率；受影響胎體總數(shù)比。

1、生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗2、胚體—胎體毒性試驗(致畸試驗)1）研究目的評價母體自胚泡著床到硬腭閉合期間接觸受試物對妊娠雌性和對胚體—胎體發(fā)育的有害影響，即前述生殖發(fā)育過程中的C和D階段，主要包括增強(qiáng)了與非妊娠雌性有關(guān)的毒性，胚體—胎體死亡、生長改變與結(jié)構(gòu)異常。2、胚體—胎體毒性試驗(致畸試驗)2）動物通常用兩種，一種是嚙齒類，首選大鼠，另一種是非嚙齒類，最好是兔。若僅用一種動物，需提出正當(dāng)理由。每組動物數(shù)應(yīng)足以對數(shù)據(jù)進(jìn)行有意義的解釋。建議每組16~20只。雌性宜用性成熟的，未交配過的動物。2、胚體—胎體毒性試驗(致畸試驗)3）給藥期從著床期到硬腭閉合，即器官形成期，大、小鼠孕期的第6~15天，兔孕期的6~18天。4）終末處死與標(biāo)本制作在分娩前一天處死懷孕母體，以防止自然分娩后，母體吞食畸形子。剖腹檢查親代受孕情況和胎體發(fā)育。除逐個檢查所有胎體的存活和畸形外，尚需分別檢查軟組織和骨骼的異常。將每窩50％胎仔經(jīng)茜素紅染色后，做骨骼檢查。另外50％胎仔經(jīng)Bouin’s固定后，作內(nèi)臟檢查。當(dāng)使用新鮮標(biāo)本的顯微解剖技術(shù)檢查軟組織改變時(對家兔胎體檢查的最好方法)，100％的家兔胎體均作軟組織和骨骼檢查。2、胚體—胎體毒性試驗(致畸試驗)5）觀察項目染毒期觀察妊娠動物的體征和死亡(1次／日)，體重和體重改變(2次／周)，攝食量(1次／周)和在其他毒性研究中已證實的重要靶效應(yīng)。有流產(chǎn)和早產(chǎn)征兆者處死并進(jìn)行肉眼檢查。處死時對所有妊娠動物進(jìn)行尸體解剖和肉眼檢查任何結(jié)構(gòu)異?；虿±砀淖儭１４嫒庋郯l(fā)現(xiàn)有改變的臟器，以便進(jìn)行組織學(xué)評價，亦保存足夠的對照組的相應(yīng)臟器，以供比較。取出子宮，稱帶有胎體的子宮重，以得出妊娠雌性動物的凈增重。計數(shù)黃體數(shù)，吸收胎數(shù)，活胎數(shù)與死胎數(shù)及著床點，稱胎盤重并作肉眼評價，必要時可作組織學(xué)檢查。稱活胎體重，檢查胎體性別，以及外觀、內(nèi)臟和骨骼畸形。2、胚體—胎體毒性試驗(致畸試驗)6）結(jié)果評定致畸研究的發(fā)現(xiàn)應(yīng)根據(jù)觀察到的效應(yīng)和產(chǎn)生效應(yīng)的劑量水平進(jìn)行評價。有必要考慮所用試驗動物的物種／品系的歷史的致畸性資料。致畸研究進(jìn)行適當(dāng)，應(yīng)提供一個符合要求的NOAEL(未觀察到有害作用水平)的估計。雖然將實驗結(jié)果外推到人的可靠性有限，然而NOAEL的建立，使得能以采取適當(dāng)?shù)陌踩禂?shù)。對母體的終點評價指標(biāo)包括：體重、體重變化、食物消耗量和母體毒性體征及母體畸胎出現(xiàn)率等。對胎體影響的評價應(yīng)包括：受影響的窩數(shù)比、每窩受影響胎體數(shù)的組間均數(shù)、受影響的胎體總數(shù)比、畸胎率和某單項畸胎率等。2、胚體—胎體毒性試驗(致畸試驗)7）影響致畸作用的因素致畸作用受多種因素影響，主要包括敏感期、遺傳類型、劑量和母體毒性等。2、胚體—胎體毒性試驗(致畸試驗)8）母體毒性與致畸的關(guān)系母體毒性是指對懷孕母體的特異的(直接的作用)或非特異的(間接的作用)的有害影響。在致畸試驗中，劑量選擇應(yīng)避免用誘發(fā)母體毒性的劑量，因為若懷孕母體中毒，而不能正常進(jìn)食，由營養(yǎng)缺乏對胎兒產(chǎn)生的影響可能比化學(xué)物本身的影響還大。

9）致畸物及發(fā)育毒物的危險度評定由于致畸作用的機(jī)理尚未充分闡明，所以致畸物危險度評定方法也沒有完全統(tǒng)一。已知的人類致畸物電離輻射：放射治療，放射性碘，原子武器。感染：風(fēng)疹，巨細(xì)胞病毒感染，單純性皰疹，梅毒，弓形體病。代謝失調(diào)：克汀病，糖尿病，苯丙酮酸尿，男性化腫瘤，高溫。藥物和化學(xué)品：反應(yīng)停，酒精，氨基蝶呤，雄性激素，麻醉劑，抗甲狀腺藥物，白消安，咖啡因，氯代聯(lián)苯類，香豆素抗凝劑，環(huán)磷酰胺，二已基乙烯雌酚，敵螨普，三氟氯溴乙烷，異維A酸，鋰，甲巰咪唑，有機(jī)汞化合物，有機(jī)溶劑類，苯妥因，腐霉利，四環(huán)素，三甲惡唑烷二酮，丙(基)戊酸。3、出生前和出生后發(fā)育毒性試驗(圍生期毒性試驗)1）研究目的評價母體自著床至斷乳期間接觸化學(xué)物對妊娠／哺乳母體和對孕體及代發(fā)育直至成熟的有害影響(前述生殖過程的C-F階段)。在此期間引起的毒性反應(yīng)會延遲發(fā)生，故觀察應(yīng)繼續(xù)到性成熟。有害影響主要包括增加與未妊娠雌性有關(guān)的毒性，子代出生前和出生后死亡，生長與發(fā)育的改變，子代中的功能缺陷(包括行為，青春期性成熟)和生殖(Fl代)。3、出生前和出生后發(fā)育毒性試驗(圍生期毒性試驗)2）動物至少一種，首選大鼠。每性別、每組動物數(shù)應(yīng)足以對數(shù)據(jù)進(jìn)行有意義的解釋。建議每組16-20窩。3、出生前和出生后發(fā)育毒性試驗(圍生期毒性試驗)3）染毒期雌性從著床至哺乳期終止。3、出生前和出生后發(fā)育毒性試驗(圍生期毒性試驗)4）實驗程序及終末處死允許分娩和撫養(yǎng)子代到斷乳。子代出生當(dāng)天被定為出生后0天。在斷乳時，每窩可選出部分雄性和雌性子代撫育到成熟并交配。有些實驗室將親代(F0)動物分組，分別或聯(lián)合進(jìn)行行為試驗和生殖功能評價。5）觀察項目染毒期間觀察親代體征和死亡(至少1次／日)、體重、體重增長(至少2次／周)和在以前毒性研究中見到的有評價價值的靶效應(yīng)、妊娠的長度、分娩。6）結(jié)果評定綜合親代和子代各項指標(biāo)觀察的結(jié)果，對圍產(chǎn)期給藥的毒性及影響程度做出綜合評價。發(fā)育毒物預(yù)篩試驗一、體內(nèi)預(yù)篩試驗“生殖／發(fā)育毒性篩選試驗”是1990年在倫敦的一次專家會上討論和取得一致意見的，以后逐年完善，1995年正式在OECD化學(xué)品試驗準(zhǔn)則中確定下來。本法的依據(jù)是大多數(shù)出生前受到的損傷將在出生后表現(xiàn)為存活力下降和／或生長障礙。因此于仔鼠出生后，觀察其外觀畸形，胚胎致死，生長遲緩等發(fā)育毒性表現(xiàn)，而不進(jìn)行傳統(tǒng)常規(guī)試驗中內(nèi)臟和骨骼的檢查，就可達(dá)到篩選的目的。本法所用動物少，檢測終點少，實驗周期短，但能提供有關(guān)化學(xué)物對生殖和／或發(fā)育可能發(fā)生影響的初步信息，是一種比較滿意的發(fā)育毒物體內(nèi)預(yù)測試驗，并已有效地用于現(xiàn)有化學(xué)物的初篩。實驗程序：動物用性成熟大鼠，每性別每組至少10只，以期提供8只孕鼠和足夠的子代。一般至少用三個試驗組和一個劑量組，劑量間隔2～4倍。至少在交配前2周，兩性別同時開始染毒，雄鼠持續(xù)染毒4周(包括交配前、交配期、直至處死)。由于雄鼠在交配前染毒期限有限，且生育力觀察可能不是睪丸毒性的特別敏感的指標(biāo)，因此必須進(jìn)行雄性生殖器官仔細(xì)的組織學(xué)檢查，以了解對雄性生育力和對精子發(fā)生的影響。雌鼠在整個研究期間染毒，包括交配前期、受孕、孕期和到分娩后4天，．以交配期滿14天計，共54天。經(jīng)口染毒。交配通常為1∶1，雌、雄鼠固定搭配。雄鼠一般在染毒4周后處死，母鼠和仔鼠在分娩后4天處死，未孕雌鼠在最后一次交配后24～26天處死。生殖/發(fā)育毒性篩選試驗圖解觀察項目：雌、雄親代應(yīng)于染毒第一天以后，每周一次和終末處死前稱重，仔鼠在出生0天，出生后1天和4天稱重。測定交配前至哺乳期間的食物消耗量，當(dāng)受試物經(jīng)飲水給予時，還應(yīng)測定此期間的飲水量。在染毒期每天觀察毒性體征，研究期間死亡或終末處死的成年動物，應(yīng)肉眼檢查、稱重并保存卵巢、睪丸、附睪和其他附件以及所有顯示肉眼可見損傷的器官，Bouin’s固定，作組織病理學(xué)檢查。仔鼠出生后，記錄窩重、仔鼠數(shù)、性別、活產(chǎn)、死產(chǎn)、小仔，觀察外觀顯著異常，以及親代和子代的任何行為異常。結(jié)果評定：根據(jù)觀察到的毒性效應(yīng)，尸檢、肉眼和組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)，評價受試物的劑量與異常的發(fā)生和嚴(yán)重性之間的關(guān)系。包括大的損傷、證實靶器官、不育、畸形、對生殖和仔鼠行為的影響、體重改變和死亡率等。由于本試驗的動物少，終點選擇少和周期短，只能用作初篩。篩選結(jié)果即使是陰性的，也不表示對生殖／發(fā)育的絕對安全，雖然當(dāng)實際接觸劑量明顯低于NOAEL劑量時，能提供可能安全的信息。而當(dāng)結(jié)果是陽性的而又缺乏其它的生殖／發(fā)育毒性資料時，則有助于決定是否有必要進(jìn)一步試驗。二、體外預(yù)篩試驗1.大鼠全胚培養(yǎng)(wholeembryoculture)取9.5日齡大鼠胚胎，剝?nèi)eichert膜，在培養(yǎng)液中接觸受試物，在孵箱中通氣旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)48小時后，觀察心臟搏動和卵黃囊循環(huán)、軸向正常旋轉(zhuǎn)在背凸位、尿囊和絨毛膜融合、眼囊和耳囊、前肢芽和三個腮弓、前后神經(jīng)管閉合及體節(jié)數(shù)目等胚胎發(fā)育情況，記錄胚胎存活。二、體外預(yù)篩試驗2.器官培養(yǎng)(organculture)利用胚胎肢芽，腭板、后腎、肺、肝、正常發(fā)育的牙齒和其他器官進(jìn)行。以肢芽為例，取12日齡小鼠胚胎，在體視顯微鏡下選用52～55體節(jié)數(shù)的胚胎，取下前肢，置于含受試物的培養(yǎng)液中，連續(xù)通氣浸沒旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)3天，Bouin's固定，阿利新蘭染色，制作肢體壓片，檢查肢體中軟骨原基的發(fā)育與分化。3.胚胎細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)(micmmassculture)從11日齡大鼠胚胎取得原代中腦細(xì)胞微團(tuán)(CNS)，肢芽區(qū)或其他區(qū)細(xì)胞微團(tuán)，置于含有不同濃度受試物的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)5天，用中性紅判斷細(xì)胞存活，用蘇木精判斷CNS分化數(shù)量，用阿利新蘭判斷肢芽軟骨細(xì)胞的分化數(shù)量。外源化學(xué)物的致突變作用及評價方法基本概念化學(xué)毒物致突變的類型致突變作用機(jī)制和后果機(jī)體對致突變作用的影響觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法遺傳：地球上的生物都能通過各種繁殖方式來保證其物種以相對穩(wěn)定的生命形式和狀態(tài)存在于自然界，這個過程是遺傳。變異:

在物種的親代之間或子代個體之間出現(xiàn)的不同程度的差異?；靖拍钔蛔?mutation)

基于染色體和基因的變異可遺傳，稱為突變。

自發(fā)突變(spontaneousmutation)

由于自然界中誘變劑的作用或由于偶然的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)時的堿基配對錯誤所產(chǎn)生的突變。誘發(fā)突變(inducedmutation)

人為造成或受某種化學(xué)、物理、生物等因素誘發(fā)產(chǎn)生的突變，簡稱誘變。

本章所用的遺傳毒性和致突變性兩個術(shù)語既有聯(lián)系又有區(qū)別。致突變性和致癌性都是精確的概念，在一個實驗群體中的突變率和癌發(fā)生率可以定量檢測。遺傳毒性是泛指對基因組的毒性，對基因組的毒作用可引起致突變性及其他各種不同的效應(yīng)，如染色體畸變、噬菌體引起細(xì)菌死亡、DNA鏈斷裂及細(xì)胞分裂抑制等。這些效應(yīng)都可作為評價遺傳毒性的終點。根據(jù)DNA改變牽涉范圍的大小，在遺傳毒理學(xué)中可將遺傳損傷分為兩類：基因突變?nèi)旧w畸變基因突變

指在基因中DNA序列的改變。基因突變是分子水平的變化，在光學(xué)顯微鏡下無法看見，一般是以表型(如生長、生化、形態(tài)等)的改變?yōu)榛A(chǔ)進(jìn)行檢測，也可通過核酸雜交技術(shù)、DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)分析及DNA測序等方法檢測DNA序列的改變來確定。基因突變可分為以下幾種基本的類型：堿基置換移碼突變大片段損傷基因突變1．堿基置換指DNA序列上的某個堿基被其他堿基所取代。堿基置換又可分為轉(zhuǎn)換和顛換兩種。

轉(zhuǎn)換：指嘌呤與嘌呤堿基、嘧啶與嘧啶堿基之間的置換(包括G：C→C：G)

顛換：指嘌吟與嘧啶堿基之間的置換(包括G：C→T：A，A：T→C：G)?；蛲蛔兓蛲蛔冝D(zhuǎn)換和顛換發(fā)生后的后果取決于是否在蛋白質(zhì)合成過程中引起編碼氨基酸的錯誤。錯義突變：如果堿基置換導(dǎo)致了編碼氨基酸信息的改變，在基因產(chǎn)物中，一個氨基酸被其它的氨基酸所取代，稱為錯義突變。錯義突變有可能使基因產(chǎn)物失活，也可能僅對基因產(chǎn)物的功能產(chǎn)生一定的影響或無影響，這取決于置換的氨基酸及其在蛋白質(zhì)中的位置和作用。基因突變2．移碼突變

指改變從mRNA到蛋白質(zhì)翻譯過程中遺傳密碼子讀碼順序的突變，通常涉及在基因中增加或缺失一個或兩個堿基對。DNA鏈堿基排列及密碼的閱讀是連續(xù)的，在基因中一處發(fā)生移碼突變，會使其以后的三聯(lián)密碼子都發(fā)生改變，有時還會出現(xiàn)終止密碼，所以，移碼突變往往會使基因產(chǎn)物發(fā)生大的改變，引起明顯的表型效應(yīng)，常出現(xiàn)致死性突變。基因突變基因突變

3.大片段損傷密碼子的插入或缺失，指在DNA鏈中增加或減少的堿基對為一個或幾個密碼子，此時基因產(chǎn)物多肽鏈中會增加或減少一個或幾個氨基酸，此部位之后的氨基酸序列無改變。染色體和染色質(zhì)染色質(zhì)：

真核細(xì)胞間期細(xì)胞核內(nèi)伸展開的DNA蛋白質(zhì)纖維。染色體：

真核細(xì)胞有絲分裂期高度螺旋化的DNA蛋白質(zhì)纖維，是間期染色質(zhì)進(jìn)一步緊密盤繞折疊的結(jié)果。染色質(zhì)和染色體是真核細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)DNA分子的存在形式；這種結(jié)構(gòu)形式對遺傳信息的穩(wěn)定、傳遞和表達(dá)都有極為重要的影響。染色體畸變?nèi)梭w內(nèi)每個細(xì)胞內(nèi)有23對染色體。包括22對常染色體和一對性染色體.。性染色體包括：X染色體和Y染色體。含有一對X染色體的受精卵發(fā)育成女性，而具有一條X染色體和一條Y染色體者則發(fā)育成男性。染色體在形態(tài)結(jié)構(gòu)或數(shù)量上的異常被稱為染色體異常，由染色體異常引起的疾病為染色體病?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的染色體病有100余種，染色體病在臨床上?？稍斐闪鳟a(chǎn)、先天愚型、先天性多發(fā)性畸形、以及癌癥等。染色體畸變?nèi)旧w畸變?nèi)祟怷染色體(左)和Y染色體(右)指染色體的結(jié)構(gòu)改變，染色體畸變牽涉的遺傳物質(zhì)改變的范圍比較大，一般可通過在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞有絲分裂中期來檢測。染色體結(jié)構(gòu)改變的基礎(chǔ)是DNA鏈的斷裂，所以把能引起染色體畸變的外源化學(xué)物稱為斷裂劑。

染色單體型畸變組成染色體的兩條染色單體中僅一條受損染色體型畸變兩條染色單體均受損染色體畸變?nèi)旧w畸變裂隙

斷裂斷片和缺失微小體

無著絲點環(huán)環(huán)狀染色體雙著絲點染色體倒位

易位插入和重復(fù)

輻射體1.裂隙：在一條染色單體或兩條染色單體上出現(xiàn)無染色質(zhì)的區(qū)域，但該區(qū)域的大小等于或小于染色單體的寬度。在制備染色體標(biāo)本過程中，會因各種因素的影響形成裂隙，故認(rèn)為裂隙并非染色質(zhì)損傷，所以，在計算染色體畸變率時通常不考慮裂隙。2.斷裂(break)同裂隙，但無染色質(zhì)區(qū)域的大小大于染色單體的寬度。3.無著絲粒斷片和缺失：染色體或染色單體斷裂后，無著絲粒的部分可與有著絲粒的部分分開，形成斷片，有著絲粒的部分稱為缺失。發(fā)生在染色體或染色單體末端的缺失稱為末端缺失，發(fā)生在臂內(nèi)任何部分的缺失稱為中間缺失。4.微小體(minutebody)中間缺失形成的斷片有時很小，成圓點狀，稱為微小體。

染色體缺失及環(huán)狀染色體的形成圖

染色體插入和重復(fù)示意圖

5.環(huán)狀染色體(ringchromosome)染色體兩條臂均發(fā)生斷裂后，帶有著絲粒部分的兩端連接起來形成環(huán)狀。通常伴有一對無著絲點的斷片。

6.倒位(inversion)在一條染色體或染色單體上發(fā)生兩處斷裂，其中間節(jié)段旋轉(zhuǎn)180℃后再重接。如果被顛倒的是有著絲點的節(jié)段，稱為臂間倒位；如被顛倒的僅是長臂或短臂范圍內(nèi)的一節(jié)段，稱為臂內(nèi)倒位。

染色體的臂間倒位

染色體相互易位示意圖

7.易位(tranlocation)當(dāng)兩條染色體同時發(fā)生斷裂后，互相交換染色體片段。如果交換的片段大小相等，稱為平衡易位(balancedtranslocation)。8.插入(insertion)和重復(fù)(duplication)一條染色體的斷片插人到另一條染色體上稱為插入。當(dāng)插入片段使染色體具有兩段完全相同的節(jié)段時，稱為重復(fù)。染色體畸變一、DNA損傷與突變(一)堿基損傷1.堿基類似物的取代

2.烷化劑3.堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)改變或破壞

4.嵌入DNA鏈突變機(jī)制突變的不良后果

體細(xì)胞突變生殖細(xì)胞突變癌變致畸衰老配子死亡死胎自發(fā)流產(chǎn)先天畸形一、機(jī)體修復(fù)DNA損傷的機(jī)制可分為兩大類：1.損傷耐受機(jī)制：指DNA遺傳可繞過那些阻止DNA復(fù)制的DNA損傷。

2.修復(fù)機(jī)制：DNA修復(fù)直接修復(fù)切除修復(fù)O6甲基鳥嘌呤修復(fù)光修復(fù)錯配堿基修復(fù)堿基切除修復(fù)核苷酸切除修復(fù)機(jī)體對致突變作用的影響復(fù)制后修復(fù)呼救性修復(fù)關(guān)于遺傳毒理學(xué)成套觀察項目中那些試驗可入選的原則有：①選擇的遺傳毒性試驗應(yīng)包括5種類型的遺傳學(xué)終點。②通常的實驗材料有病毒、細(xì)菌、真菌、培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞、植物、昆蟲及哺乳動物等。③體內(nèi)試驗與體外試驗配合。④應(yīng)包括生殖細(xì)胞和體細(xì)胞。通常，對于一種受試物應(yīng)當(dāng)先用原核細(xì)胞或體細(xì)胞的體外試驗按遺傳學(xué)終點合理配套進(jìn)行試驗，并對有陽性結(jié)果的遺傳學(xué)終點驗證其在體內(nèi)的真實性，再行選用生殖細(xì)胞致突變試驗進(jìn)行遺傳危害的評價。觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法二、常用的致突變試驗

(一)細(xì)菌回復(fù)突變試驗(Ames試驗)

鼠傷寒沙門氏菌原養(yǎng)型(his+)組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株。(his-)正向突變回復(fù)突變代謝活化系統(tǒng)受試物觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法二、常用的致突變試驗(二)微核試驗

微核(Micronucleus)的產(chǎn)生與染色體損傷有關(guān)，是染色體或染色單體的無著絲點斷片或紡錘絲受損傷而丟失的整個染色體，在細(xì)胞分裂后期遺留在細(xì)胞質(zhì)中，末期之后，單獨形成一個或幾個規(guī)則的次核，包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，因比主核小，故稱微核。在細(xì)胞質(zhì)中微核來源有二：斷片或無著絲粒染色體在細(xì)胞分裂后期不能定向移動，而遺留在細(xì)胞質(zhì)中；有絲分裂毒物的作用使個別染色體或帶苔絲粒的染色體環(huán)和斷片在細(xì)胞分裂后期被留在細(xì)胞質(zhì)中。微核試驗(Micronucleustest，MNT)是觀察受試物能否產(chǎn)生微核的試驗。其主要可檢出DNA斷裂劑和非整倍體誘變劑。

觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法(二)微核試驗MNNCE觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法二、常用的致突變試驗(三)染色體畸變分析

(四)姐妹染色單體交換試驗（SCE）

觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法二、常用的致突變試驗(五)果蠅伴性隱性致死試驗(六)顯性致死試驗(七)程序外DNA臺成試驗

(八)轉(zhuǎn)基因動物致突變試驗(九)哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法外源化學(xué)物致癌作用學(xué)習(xí)目的與要求掌握化學(xué)致癌的機(jī)制、化學(xué)致癌的過程；熟悉化學(xué)致癌物的分類；了解化學(xué)毒物致癌性判別的基本方法。重點：化學(xué)致癌的分子機(jī)制、化學(xué)致癌的過程。世界衛(wèi)生組織癌癥研究中心目前全世界發(fā)病率最高的癌癥是肺癌，每年新增患者人數(shù)為120萬。其次是乳腺癌，每年新增患者人數(shù)為100萬。隨后依次是腸癌94萬，胃癌87萬，肝癌56萬，宮頸癌47萬，食道癌41萬。1775年——英國Pott

陰囊癌1895年——德國Rehn

職業(yè)性膀胱癌1915年——日本山極和市川試驗性皮膚癌1922年——英國Kennway

動物皮膚癌1945年——英國Case職業(yè)性膀胱癌世界衛(wèi)生組織癌癥研究中心對于癌癥預(yù)防的建議

減少脂肪攝入，使之低于30％總熱量增加膳食纖維攝入量至每天20～30克，但不超過40克多吃新鮮蔬菜和水果避免肥胖控制飲酒少吃鹽漬、鹽腌和煙熏食物脂肪攝入過量的危害

乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、前列腺癌、膽囊癌發(fā)病率與脂肪攝入過多有關(guān)。研究表明，脂肪可增強(qiáng)小腸細(xì)菌作用，使求偶素活性增強(qiáng)，而求偶素是引起乳腺癌的重要因素之一。脂肪在通過腸道時可在細(xì)菌作用下形成二級產(chǎn)物，促進(jìn)結(jié)腸癌變。脂肪過量分兩個方面，一個是肉食，一個是炒菜的食用油，除了橄欖油對人體沒有副作用外，其他油類都含有很高的飽和脂肪酸，而我們炒菜的油放得實在是太多了一點。蔬菜和水果攝入不足的危害

科學(xué)家對200項膳食與腫瘤關(guān)系的流行病調(diào)查結(jié)果進(jìn)行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)在156項研究中有128項顯示攝入蔬菜和水果不足者易患下列常見癌，且危險性高兩倍：肺癌、喉癌、口腔癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、膀胱癌、胰腺癌、子宮頸癌、卵巢癌。研究證明，蔬菜和水果中含有豐富的抗壞血酸、胡蘿卜素、膳食纖維、葉酸，十字花科蔬菜亦含有較強(qiáng)的抑癌活性成分?？箟难釣檠趸瘎?，可抑制活性氧自由基對細(xì)胞DNA的損傷，還能阻斷致癌的亞硝胺類化合物在體內(nèi)合成。膳食纖維不夠?qū)е录膊?/p>

膳食纖維是指不被體內(nèi)吸收、利用的多糖類，包括纖維素、半纖維素和果膠。膳食纖維可通過增加糞便量刺激腸蠕動及稀釋致癌物，減少致癌物對腸道的毒害。據(jù)報道，給52例切除結(jié)腸腺癌患者補(bǔ)充麥纖維4個月，可降低糞便中促癌物總膽汁酸含量的50％。重視葉酸

葉酸又叫維生素M、維生素B11。葉酸是B族維生素之一，因綠葉中含量十分豐富而得名。葉酸是參與DNA、RNA前體嘌呤和嘧啶以及蛋氨酸合成的重要成分，葉酸對多種癌癥（肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌）有較好的抑制作用。其作用機(jī)理可能為：一是抗氧化作用，二是減少致癌物與DNA的形成。不良飲食習(xí)慣

食物在油煎炸時溫度高達(dá)200℃以上，油脂進(jìn)行著復(fù)雜的氧化、聚合、環(huán)化等反應(yīng)。尤其經(jīng)反復(fù)高溫的剩油炸后可產(chǎn)生致癌物和促癌物。國外報道，多次使用的剩油加到飲料中可誘發(fā)大鼠腫瘤。這就是我們叫大家少吃油條、油炸臭豆腐的原因。煙熏食物熏肉在制作過程中產(chǎn)生致癌物——3．4苯并芘，并可滲透到食物去。飲酒國外報道，飲酒可增加婦女患乳腺癌的危險性，且隨飲酒量增大而增高。霉菌已知有20多種霉菌及其毒素對動物有致癌性。我國食管癌和肝癌的高發(fā)可能與居民攝入霉菌污染的食物有關(guān)。強(qiáng)致癌食品的8大黑名單一、腌制食品：咸魚產(chǎn)生的二甲基亞硝酸鹽，在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為致癌物質(zhì)二甲基亞硝酸胺。咸蛋、咸菜等同樣含有致癌物質(zhì)，應(yīng)盡量少吃。二、燒烤食物：烤牛肉、烤鴨、烤羊肉、烤鵝、烤乳豬、烤羊肉串等，因含有強(qiáng)致癌物不宜多吃。三、熏制食品：如熏肉、熏肝、熏魚、熏蛋、熏豆腐干等含苯并芘致癌物，常食易患食道癌和胃癌。四、油炸食品：煎炸過焦后，產(chǎn)生致癌物質(zhì)多環(huán)芳烴。咖啡燒焦后，苯并芘會增加20倍。油煎餅、臭豆腐、煎炸芋角、油條等，因多數(shù)是使用重復(fù)多次的油，高溫下會產(chǎn)生致癌物。五、霉變物質(zhì)：米、麥、豆、玉米、花生等食品易受潮霉變，被霉菌污染后會產(chǎn)生致癌毒素——黃曲霉菌素。六、隔夜熟白菜和酸菜：會產(chǎn)生亞硝酸鹽，在體內(nèi)會轉(zhuǎn)化為亞硝酸胺致癌物質(zhì)。七、檳榔：嚼食檳榔是引起口腔癌的一個因素。八、反復(fù)燒開的水：反復(fù)燒開的水含亞硝酸鹽，進(jìn)入人體后生成致癌的亞硝酸胺。環(huán)境致癌因素物理因素：輻射化學(xué)因素：化學(xué)致癌物生物因素：病毒一、化學(xué)致癌作用——多因素、多基因參與的多階段過程致癌過程有多個與癌腫有關(guān)的基因參與不同器官來源、不同組織類型、臨床階段以至同一種腫瘤在不同地區(qū)所見的遺傳變化是不同的多種環(huán)境致癌物、致癌因子或條件可協(xié)同作用個體的不同遺傳背景對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要影響二化學(xué)致癌過程1細(xì)胞癌變的多階段學(xué)說從正常細(xì)胞基因突變或表達(dá)改變，發(fā)展到癌細(xì)胞，直至癌轉(zhuǎn)移，是一個多階段多基因調(diào)控多因素參與的過程?；瘜W(xué)致癌過程三個階段：引發(fā)階段（initiation）促長階段（promotion）進(jìn)展階段（progression）引發(fā)階段——啟動階段，第一步驟

化學(xué)致癌物對靶細(xì)胞DNA產(chǎn)生損傷作用經(jīng)細(xì)胞分裂增殖固定下成為突變細(xì)胞?；瘜W(xué)致癌物不可逆的將正常細(xì)胞腫瘤細(xì)胞。起始步驟引發(fā)劑或啟動劑相對迅速的過程促長階段——第二階段促進(jìn)引發(fā)形成腫瘤細(xì)胞分裂生長。特點：⑴促癌物的作用長期、慢性⑵引發(fā)物和促癌物單獨作用均不能引起腫瘤⑶引發(fā)必須發(fā)生在促長之前⑷引發(fā)作用是不可逆改變，促長在早期階段的改變是可逆的具有促長作用的化學(xué)物質(zhì)稱為促長劑。進(jìn)展階段——第三階段在腫瘤形成過程中，在促進(jìn)之中或之后，細(xì)胞表現(xiàn)出不可逆的遺傳學(xué)改變標(biāo)志：遺傳不穩(wěn)定性增加和惡性變化，在形態(tài)上或功能代謝和行為方面逐漸表現(xiàn)出腫瘤的特征。一、用于致癌物篩選的短期試驗（一）致突變試驗：①基因突變試驗：鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(Ames試驗);②染色體畸變試驗：體外細(xì)胞系細(xì)胞遺傳學(xué)分析，小鼠骨髓微核試驗，大鼠骨髓染色體畸變試驗;③原發(fā)性DNA損傷：DNA加合物，鏈斷裂，DNA修復(fù)誘導(dǎo)(細(xì)菌SOS反應(yīng)，大鼠肝UDS誘導(dǎo))，SCE試驗；④體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化：敘利亞地鼠胚胎細(xì)胞，Balb/c3T3細(xì)胞。一、用于致癌物篩選的短期試驗：（二）哺乳動物短期致癌試驗：哺乳動物短期致癌試驗又稱為有限體內(nèi)試驗，指時間有限(數(shù)月)，靶器官有限。較受重視的短期致癌試驗有下列四種：1．小鼠皮膚腫瘤誘發(fā)試驗：于小鼠皮膚局部連續(xù)涂抹受試物，以觀察皮膚乳頭瘤和癌的發(fā)生，一般20周可結(jié)束實驗，較敏感的小鼠為SENCAR小鼠。此試驗也可設(shè)計為檢測受試物的引發(fā)活性或促長活性。典型的引發(fā)劑為致癌性多環(huán)芳烴，促長劑為佛波醇酯(TPA)。2．小鼠肺瘤誘發(fā)試驗：染毒途徑常用腹腔注射，也可灌胃或吸入，一般30周可結(jié)束實驗，觀察肺腫瘤的發(fā)生。較敏感的小鼠為A系小鼠。此試驗也可設(shè)計)b檢測受試物的引發(fā)活性或促長活性。典型的引發(fā)劑為烏拉坦，促長劑為二丁基經(jīng)基甲苯(BHT)。3．大鼠肝轉(zhuǎn)化灶誘發(fā)試驗。對大鼠進(jìn)行肝大部切除術(shù)后，給以受試物，一般可在8～14周結(jié)束實驗，觀察肝轉(zhuǎn)化灶生成。肝轉(zhuǎn)化灶是癌前病變，有γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性升高，G6P酶和ATP酶活性降低，以及鐵攝取能力降低。轉(zhuǎn)化灶可用組織化學(xué)或免疫化學(xué)方法鑒定。此試驗也可設(shè)計為檢測受試物的引發(fā)活性或促長活性。典型的引發(fā)劑為二乙基亞硝胺(DEN)，促長劑為苯巴比妥(PB)。4．雌性大鼠乳腺癌誘發(fā)試驗，一般可用SD大鼠(或Wistar大鼠)，實驗周期為6個月。此四個試驗不是成組試驗，應(yīng)根據(jù)受試物的特點選擇使用。此四個試驗任一試驗得到陽性結(jié)果的意義與長期動物致癌試驗相似，但陰性結(jié)果并不能排除受試物的致癌性。一、用于致癌物篩選的短期試驗：（二）哺乳動物短期致癌試驗：何時應(yīng)考慮進(jìn)行致癌性評價：①人體可能長期暴露于該化學(xué)物；②該化學(xué)物或其代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與已知致癌物相似；③反復(fù)染毒毒性試驗提示該化學(xué)物可能產(chǎn)生癌前病變。如在3種遺傳毒理學(xué)短期試驗均得到陽性結(jié)果，可預(yù)測為遺傳毒性致癌物；如在3種遺傳毒理學(xué)短期試驗均得到陰性結(jié)果，可預(yù)測為非遺傳毒性非致癌物；如經(jīng)5種遺傳毒理學(xué)短期試驗仍不能預(yù)測其致癌性的化學(xué)品，應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行哺乳動物致癌試驗。

①臨床上連續(xù)應(yīng)用6個月以上的藥品；對慢性或復(fù)發(fā)性疾病需間斷性長期反復(fù)治療的藥品；造成長期暴露的給藥系統(tǒng)。②已知屬于對人具有潛在致癌性的同類化合物；構(gòu)效關(guān)系提示具有致癌危險性的物質(zhì)3長期毒性試驗發(fā)現(xiàn)癌前病變3原型或代謝產(chǎn)物在組織內(nèi)長期蓄積，引起局部組織反應(yīng)或其他病理生理反應(yīng)的物質(zhì)。③具有遺傳毒性的物質(zhì)往往具有致癌性，如擬長期使用，應(yīng)進(jìn)行慢性毒性試驗(1年)，檢測早期致癌反應(yīng)。④擬用于病人預(yù)期壽命少于3年的藥品不必進(jìn)行致癌試驗，如腫瘤治療藥等。

⑤局部使用吸收很差的藥物不必進(jìn)行經(jīng)口致癌試驗。

⑥已具有致癌性資料的藥物的各種酸、堿、鹽應(yīng)提供其在藥物動力學(xué)、藥效學(xué)或安全性方面沒有明顯改變的證據(jù)，對于酯和復(fù)雜的衍生物在確定是否需要進(jìn)行致癌試驗時也應(yīng)有類似的資料，并應(yīng)個案討論。

⑦基本作為替代治療的內(nèi)源性物質(zhì)不需要進(jìn)行致癌試驗。但對生物技術(shù)制品，下列情況可考慮進(jìn)行致癌試驗：生物學(xué)作用明顯不同于天然相應(yīng)物質(zhì)的制品；結(jié)構(gòu)明顯不同于天然相應(yīng)物質(zhì)的制品；在人體引起局部或全身濃度明顯增加的制品。二、哺乳動物長期致癌試驗：（一）試驗動物

物種和品系：要求用兩種實驗動物，常規(guī)選用大鼠和小鼠，也可用倉鼠。嚙齒類動物對多數(shù)致癌物易感性較高，壽命相對較短，費用也較低，生理和病理學(xué)資料較完備，因此使用最廣泛。在選擇品系時應(yīng)選擇較敏感、自發(fā)腫瘤率低、生活力強(qiáng)及壽命較長的品系。性別：為接近人類情況，應(yīng)使用同等數(shù)量的雌雄兩種性別的動物。年齡：使用剛斷乳的動物，以保證有足夠長的染毒和發(fā)生癌癥的時間，而且幼年動物解毒酶及免疫系統(tǒng)尚未完善，對致癌作用比較敏感。（二）劑量選擇和動物數(shù)量

致癌試驗一般設(shè)三個試驗組美國NCI推薦以最大耐受劑量(MTD)為高劑量。最大耐受劑量是由90天毒性試驗來確定的，此劑量應(yīng)使動物體重減輕不超過對照組的10％，并且不引起死亡及導(dǎo)致縮短壽命的中毒癥狀或病理損傷。ICH(1995)提出，高劑量選擇可以根據(jù)：①毒性終點，即最大耐受劑量(MTD);②藥代動力學(xué)終點，嚙齒動物血漿AUC(時量曲線下面積)為人的25倍；③選擇吸收飽和劑量;④藥效學(xué)終點，不應(yīng)產(chǎn)生生理學(xué)和內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂;⑤最大可行劑量，受試物在飼料中最高含量為5％。限制劑量為1500mg／(kg體重·d)。（二）劑量選擇和動物數(shù)量中及低劑量組則按等比級數(shù)下推，如分別為上一個劑量水平的1/2或1/3。低劑量組應(yīng)不影響動物的正常生長、發(fā)育和壽命，即不產(chǎn)生任何毒性效應(yīng)。但低劑量組應(yīng)高于人的接觸劑量，一般不低于高劑量的10％。中劑量組介于高、低劑量之間，如有可能按受試物的毒物動力學(xué)性質(zhì)來確定。對照組除不給受試物外，其他條件均與試驗組相同。同時應(yīng)設(shè)陰性(溶劑或賦形劑)對照組。必要時可設(shè)陽性對照組，陽性致癌物最好與受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)相近。動物數(shù)量：每組至少有雌雄各50只動物，希望在出現(xiàn)第一個腫瘤時，每組還有不少于25只動物。

（三）染毒途徑

經(jīng)口染毒是將受試物給予實驗動物的常用途徑，一般把受試物摻人飼料或飲水中連續(xù)給予動物(5～7天/周)。若摻入后的適口性不良，可用灌胃法。摻入濃度要定期監(jiān)測，觀察其均勻性和穩(wěn)定性，摻入的濃度一般不超過5％。經(jīng)皮染毒，涂敷受試物的面積一般不少于動物體表總面積的10％。必須保證受試物與皮膚良好接觸，并防止動物舔食。每天涂抹一次，每周3～7次。吸入染毒，每天染毒4小時，每周5～7天。染毒柜內(nèi)受試物濃度應(yīng)定期或連續(xù)監(jiān)測，其分布應(yīng)均勻、恒定。其他注射途徑可根據(jù)需要采用。（四）試驗期限(1)一般情況下，試驗期限小鼠和倉鼠應(yīng)為18個月，大鼠為24個月；然而對于某些生