廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《芒果品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法》編制說明（征求意見稿）一、制定意義及任務(wù)來源1目的意義目前，通過分子生物學(xué)和生物信息學(xué)相結(jié)合的方法在基因水平對種質(zhì)資源生物多樣性進(jìn)行鑒定已經(jīng)成為作物學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。2015年4月，農(nóng)業(yè)部印發(fā)《農(nóng)作物品種DNA身份鑒定體系構(gòu)建實施方案》中指出“現(xiàn)代種業(yè)是國家戰(zhàn)略性、基礎(chǔ)性核心產(chǎn)業(yè)，品種創(chuàng)新是現(xiàn)代種業(yè)發(fā)展的核心，品種保護(hù)與管理是品種創(chuàng)新的必要保障。目前，生物技術(shù)的快速發(fā)展，移動互聯(lián)、大數(shù)據(jù)引發(fā)的產(chǎn)業(yè)變革，為品種管理向田間表型身份鑒定與室內(nèi)基因型（DNA，即脫氧核糖核酸）身份鑒定相結(jié)合的方向發(fā)展提供了有力的技術(shù)支撐”。因此構(gòu)建品種DNA身份鑒定體系是加強(qiáng)種子管理、保障市場公平競爭、保護(hù)農(nóng)民合法權(quán)益、提升品種創(chuàng)新能力和推進(jìn)種業(yè)信息化發(fā)展的需要。分子標(biāo)記鑒定是從DNA水平直接反映品種或親子間的差異，不受植物發(fā)育階段、組織器官、季節(jié)、環(huán)境和表達(dá)等條件的限制，同時DNA標(biāo)記數(shù)量大、多態(tài)性豐富等諸多特點(diǎn)，現(xiàn)已在品種鑒定、圖譜構(gòu)建、基因定位等研究中廣泛應(yīng)用。分子標(biāo)記技術(shù)之一SSR即簡單重復(fù)序列（SimpleSequenceRepeat）或微衛(wèi)星DNA（MicrosatelliteDNA)。它通常是指以2~5個核甘酸為單位的多次串聯(lián)重復(fù)DNA序列，長度大多在100~200bp。SSR在基因組中分布廣泛，由于重復(fù)次數(shù)的不同而引起不同材料間的差異，通常表現(xiàn)為共顯性。SSR兩端有一段相對保守的序列，根據(jù)保守序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增就可獲得SSR片段。由于SSR分布廣泛，具有多態(tài)性好、表現(xiàn)為共顯性、對DNA質(zhì)量要求低且用量少的諸多特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析、雜種鑒定、指紋圖譜構(gòu)建、基因定位等方面?？梢杂糜谥参锲贩N權(quán)精準(zhǔn)授權(quán)、打假與維權(quán)，為《種子法》的實施提供了可靠的技術(shù)手段。芒果（MangiferaindicaL.），漆樹科，杧果屬。果皮顏色有紅中帶黃、黃中帶青、青中帶黃、純青色等。果肉為黃色，鮮美多汁，有濃郁的芳香氣味。內(nèi)部有一粒種子，種子為扁平形。素有“熱帶果王”之美譽(yù)，是世界上著名的熱帶水果，據(jù)世界糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計，2016年全世界芒果實際收獲面積和產(chǎn)量分別為9616.6萬畝和5127.9萬噸；芒果亦是我國重要的熱帶水果之一，我國主要種植地區(qū)為廣東、廣西、海南、云南、福建和臺灣等地，5-9月為盛產(chǎn)期。在面積上僅次于香蕉、荔枝和龍眼，居第四位，據(jù)農(nóng)業(yè)部南亞辦數(shù)據(jù)顯示，2019年全國芒果種植面積達(dá)484.2萬畝，產(chǎn)量278.2萬噸（臺灣未計入），產(chǎn)值190.3億元。2015年，廣西芒果產(chǎn)量超過海南成為最大的芒果產(chǎn)地，居全國首位。2020年廣西芒果果園面積153.93萬畝，產(chǎn)量79.81萬噸，產(chǎn)值50.7億元。廣西百色與海南、攀枝花并稱我國三大芒果之鄉(xiāng)，百色市是我國最大的芒果生產(chǎn)基地，近年來百色為廣西芒果貢獻(xiàn)了大部分產(chǎn)量，芒果產(chǎn)業(yè)已成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民收入的主要來源。廣西芒果品種主要有臺農(nóng)1號芒、金煌芒、紅象牙芒、桂熱芒82號、桂七芒、貴妃芒、桂熱芒10號、凱特芒、新世紀(jì)芒等29個品種。單從形態(tài)上鑒定存在一定困難，這就給芒果品種的選育、生產(chǎn)、經(jīng)營和使用等方面造成不同程度的困擾，同時也給種子管理部門帶來一定的挑戰(zhàn)。我國已出臺了一系列主要農(nóng)作物品種的SSR分子標(biāo)記鑒定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)，而目前尚無利用SSR標(biāo)記技術(shù)鑒定芒果品種真?zhèn)蔚姆椒?biāo)準(zhǔn)。制定相應(yīng)的廣西地方標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范利用SSR標(biāo)記技術(shù)鑒定芒果品種真實性，對品種管理、質(zhì)量監(jiān)控等方面具有重要意義，且對雜種優(yōu)勢群的劃分、種質(zhì)創(chuàng)新及新品種的選育等具有指導(dǎo)意義。2任務(wù)來源2018年由廣西檢驗檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會提出的《芒果品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法》的制定計劃，2018年廣西壯族自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局在關(guān)于下達(dá)《2018年第一批廣西地方標(biāo)準(zhǔn)制定項目計劃的通知》附件文中批準(zhǔn)將其列入2018年第一批廣西地方標(biāo)準(zhǔn)制定項目計劃(序號：2018-0114)，由廣西益譜檢測技術(shù)有限公司、廣西出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心、南寧維爾凱生物科技有限公司等主要負(fù)責(zé)起草該地方標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)。二、工作概述1國內(nèi)外相關(guān)研究杧果（Mango/MangiferaindicaL.)，別名芒果、檬果、望果、漭果、悶果、蜜望子、庵波羅果等，為漆樹科（Anacardiaceae）杧果屬（Mangifera）植物，常綠果樹，有“熱帶果王”之美譽(yù)，世界五大名果之一。由于杧果從起源到馴化的過程復(fù)雜、不同地區(qū)之間引種、地方品種沒有確切的科學(xué)名稱等，近年來，我國各地科研工作者在種質(zhì)資源調(diào)查和收集研究時，大多都局限于某一地區(qū)，各自從不同的角度對杧果進(jìn)行了種下分類，同一個品種在不同省份的參試和審定的進(jìn)程往往也不一致，同一品種在不同省份通過審定后該品種的標(biāo)準(zhǔn)樣品存在差異，另外，在多個省份審定的情況下，不同單位對同一品種的不同命名，還有竊用他人品種后換名審定的，從而導(dǎo)致一定數(shù)量上的仿冒雷同，品種間親緣關(guān)系不明確，而且從形態(tài)特征上很難將其準(zhǔn)確歸類，給杧果品種管理帶來一定的混亂。因此，為了更好的保護(hù)現(xiàn)有杧果的品種權(quán)和新品種的鑒定，應(yīng)堅持品種命名的唯一性原則，需要建立起一種快速、準(zhǔn)確、可靠、高效的杧果種質(zhì)資源鑒定方法，而傳統(tǒng)鑒定評價方法，都有一定的局限性。目前世界上約有杧果品種1000多個，我國約有200個杧果品種或品系。杧果具有豐富的遺傳多樣性，果實的大小、形狀、色澤、纖維多少、核大小等是區(qū)別杧果品種的主要依據(jù)，但杧果的品種、品系很多，過去多用實生苗繁殖，產(chǎn)生了許多自然雜交種，新的品種又不斷地被人工培育出來，由于存在飾變和觀察標(biāo)準(zhǔn)不同，依據(jù)植物學(xué)性狀難以對杧果資源進(jìn)行準(zhǔn)確分類，導(dǎo)致同物異名、同名異物和資源重復(fù)保存等現(xiàn)象嚴(yán)重。M.T.Wahdan等利用SSR標(biāo)記對42對引物進(jìn)行了篩選，其中36對引物具有可重復(fù)的多態(tài)性DNA擴(kuò)增模式。在這兩個品種的水果中，60.7%的得分片段被認(rèn)為是假定的基因型特異性標(biāo)記。多態(tài)信息含量（PIC）在0.25~0.75之間，平均為0.51。Hania和Aml品種的水果的雜合度分別為0.68和0.53。通過對這36對引物的條帶分析，可以區(qū)分出不同的品種的水果，說明利用SSR引物進(jìn)行PCR是一種有效的基因型鑒定方法，可以利用DNA指紋圖譜描述和鑒定兩個埃及芒果新品系的園藝初步研究（PreliminaryHorticulturalStudiesToDescribeAndIdentifyOfTwoNewEgyptianMangoStrainsUsingDNAFingerprint.）；A.Sennhenn等用19個簡單序列重復(fù)標(biāo)記對38棵芒果干葉片進(jìn)行分子分類，研究肯尼亞東部和中部芒果地方品種的形態(tài)和分子特征。利用Nei’s遺傳距離和鄰居連接方法建立了芒果樣品間的遺傳親緣關(guān)系樹狀圖。形態(tài)學(xué)鑒定得出6個不同的聚類(Identificationofmango(MangiferaindicaL.)landracesfromEasternandCentralKenyausingamorphologicalandmolecularapproach)；ManalEidt等采用-簡單序列重復(fù)(SSRs)技術(shù)對25個埃及芒果品種的遺傳變異程度進(jìn)行了分析，并建立了指紋圖譜。根據(jù)35個SSR標(biāo)記的可重復(fù)性、可分離性和品種間的分離能力，選擇了35個SSR標(biāo)記。35個SSR位點(diǎn)產(chǎn)生219個多態(tài)性高的等位基因(約100%)。通過多態(tài)位點(diǎn)百分比、觀察到的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀察到的雜合度、預(yù)期雜合度、固定指數(shù)和基因流等參數(shù)，計算了栽培種質(zhì)的等位基因初變異率和遺傳基礎(chǔ)（EfficiencyParametersofSSRMarkersforCharacterizationofSomeMangoCultivarsandTheirSuitabilityinMolecularBar-codingSSR）。石勝友，張燕梅，武紅霞等采用SSR標(biāo)記方法，對來自7個國家的36份杧果品種進(jìn)行了遺傳相似性分析，目的是為杧果育種親本合理選配、現(xiàn)有國外種質(zhì)的充分發(fā)掘利用提供科學(xué)依據(jù)；王靜毅等人應(yīng)用SSR技術(shù)對廣西主要杧果資源遺傳關(guān)系進(jìn)行SSR分析，對48個杧果品種（系）的遺傳關(guān)系進(jìn)行了檢測。廣西主要杧果資源品種間的遺傳相似系數(shù)在0.4559~0.9412之間，平均為0.7053，以桂熱杧06-3號與桂熱杧06-5號兩者之間的相似系數(shù)最小，而Keitt與紅凱特杧及玉文杧與蜜桃杧之間相似系數(shù)最大。UPGMA聚類分析將48個品種分為5大類群。聚類結(jié)果表明，在分子水平上，杧果品種間的親緣關(guān)系與胚性無直接關(guān)系；且廣西本地杧果品種(系)多是象牙杧、青皮杧、呂宋杧或秋杧等的雜交子代或?qū)嵣蟠?。芒果種質(zhì)資源真?zhèn)舞b定的相關(guān)文獻(xiàn)資料有：1、王靜毅等.廣西主要杧果資源遺傳關(guān)系的SSR分析[J].熱帶作物學(xué)2009,30(9):1301-1307；2、石勝友,張燕梅.武紅霞,等.36個杧果引進(jìn)品種的遺傳相似性研究[J].果樹學(xué)報2010，27（6）:914-917；3、黃麗芳,雷新濤,姚全勝,等.芒果SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].熱帶作物學(xué)2010,31(3):410-414；4、黃麗芳,閆林,范睿,等人.芒果實生資源遺傳多樣性的SSR分析[J].熱帶作物學(xué)2011,32(10):1828-1832；5、羅純,武紅霞,姚全勝,等人.芒果轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)信息分析與引物篩選[J].熱帶作物學(xué)報2015,36(7):1261-1266;6、覃昱茗,張宇,黃國弟,等.杧果SC-SSR分子標(biāo)記反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用，2021，34（3）：37-43.7、王明,應(yīng)東山,王琴飛,等.我國芒果主栽品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報JournalofSouthernAgriculture2015,46(7):1154-1159;8、閆慧清,劉澤標(biāo),吉海旺,等.芒果EST-SSR位點(diǎn)分析及引物開發(fā)[J].分子植物育種,2020,18(11)9、周立,羅聰,何堂熹,等.基于EST-SSR標(biāo)記的芒果品種遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析[J].分子植物育種.2020,18(11)10、PreliminaryHorticulturalStudiesToDescribeAndIdentifyOfTwoNewEgyptianMangoStrainsUsingDNAFingerprint(利用DNA指紋圖譜描述和鑒定兩個埃及芒果新品系的園藝初步研究)[J].JournalofAmericanScience,2011,7(2):641-650;11、A.Sennhenn?K.Prinz?J.Gebauer?,A.Whitbread?R.Jamnadass?K.Kehlenbeck.Identificationofmango(MangiferaindicaL.)landracesfromEasternandCentralKenyausingamorphologicalandmolecularapproach(肯尼亞東部和中部芒果地方品種的形態(tài)學(xué)和分子鑒定)[J].GenetResourCropEvol,2014,61:7-22.12、ManalEid,M.A.Hussein.EfficiencyParametersofSSRMarkersforCharacterizationofSomeMangoCultivarsandTheirSuitabilityinMolecularBar-codingSSR(標(biāo)記在芒果品種鑒定中的有效性參數(shù)及其在分子條形碼中的適用性)[J].NewYorkScienceJournal2017;10(8):68-76.上述這引些研究都表明：SSR標(biāo)記與毛細(xì)管凝膠電泳相結(jié)合的分子標(biāo)記技術(shù)可以鑒定芒果品種，可為芒果的遺傳分析、指紋圖譜構(gòu)建、雜交效率評定等提供可靠、快速的方法。2標(biāo)準(zhǔn)起草的主要工作過程2.1引物的來源本技術(shù)規(guī)范編制過程中使用的38對SSR引物主要來源于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所、廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院、農(nóng)業(yè)部熱帶果樹生物學(xué)重點(diǎn)實驗室等科研院所和高校發(fā)表的文章中所使用的，以及查閱其它文獻(xiàn)上使用的芒果基因組序列引物。2.2芒果品種類型的收集本實驗收集了20個芒果品種，分別是桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七，其主要來源于廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所芒果種質(zhì)資源圃種植基地（南寧市邕武路）。2.3技術(shù)路線與實驗選取20個廣西區(qū)內(nèi)種植的不同芒果品種。用篩選出的38對SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，對SSR引物的擴(kuò)增穩(wěn)定性及多態(tài)性進(jìn)行分析，并采用毛細(xì)管電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行同步分析驗證。根據(jù)峰圖簡單易讀取、多態(tài)性高、擴(kuò)增穩(wěn)定性高、染色體上分布均勻的原則，最終確定了38對核心引物用于芒果品種鑒定。2.4技術(shù)驗證經(jīng)廣西益譜檢測技術(shù)有限公司、廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實驗室和南寧國拓生物科技有限公司等三家單位，對技術(shù)規(guī)程的可操作性和檢測數(shù)據(jù)的可重現(xiàn)性進(jìn)行了驗證。其中廣西益譜檢測技術(shù)有限公司對20個廣西區(qū)內(nèi)種植的不同芒果品種的38對SSR引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測驗證；6個廣西區(qū)內(nèi)種植的不同芒果品種的6對SSR引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測驗證。廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實驗室和南寧國拓生物科技有限公司分別對6個廣西區(qū)內(nèi)種植的不同芒果品種的38對SSR引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測驗證；6個廣西區(qū)內(nèi)種植的不同芒果品種的6對SSR引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測驗證。經(jīng)驗證，《芒果品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法》技術(shù)規(guī)程中的DNA提取、PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測方法具有可操作性，按照技術(shù)規(guī)程中的聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶明顯，清晰可辯；毛細(xì)管電泳檢測方法中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物均能獲得清晰、穩(wěn)定的主峰，且易于識別。三、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容1標(biāo)準(zhǔn)編制原則規(guī)范性原則：本技術(shù)規(guī)范的制定符合法律法規(guī)，符合有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的要求，包括GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》、NY/T2594《植物品種鑒定DNA分子標(biāo)記法總則》、NY/T2440-2013《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南芒果》、GB/T6682《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》。適用性原則：本規(guī)程的全部內(nèi)容具有可操作性。統(tǒng)一性原則：本規(guī)程與現(xiàn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)統(tǒng)一，不發(fā)生沖突。先進(jìn)性原則：本規(guī)程采用目前國際國內(nèi)外品種鑒定領(lǐng)域均認(rèn)可的、成熟的SSR標(biāo)記技術(shù)，以非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳平臺為主，兼顧毛細(xì)管電泳檢測平臺的芒果品種鑒定技術(shù)，與田間小區(qū)鑒定方法對比，該方法的先進(jìn)性在于不受環(huán)境影響和季節(jié)約束，檢驗周期短。2標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)編寫主要內(nèi)容包括樣品處理、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR）、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細(xì)管電泳操作過程以及結(jié)果判定，適用于芒果種質(zhì)資源真?zhèn)蔚臋z測。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程編制的過程主要進(jìn)行了以下試驗和工作：2.1原理不同品種芒果的遺傳組成不同，其基因組（DNA）中SSR的重復(fù)次數(shù)存在差異，根據(jù)SSR的差異，通過PCR擴(kuò)增及電泳技術(shù)可以鑒定芒果品種。2.2樣品來源樣品采自廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所芒果種質(zhì)資源圃種植基地（南寧市邕武路）的芒果葉片。2.3儀器電子天平、高速冷凍離心機(jī)、水浴鍋、PCR擴(kuò)增儀、垂直板電泳系統(tǒng)、毛細(xì)管電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、膠片觀察燈等。2.4試劑液氮、無水乙醇、三氯甲烷、甲醛、三羥甲基氨基甲烷、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、2×TaqPlusPCR預(yù)混試劑、40%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液、氯化鈉、氫氧化鈉、硝酸銀、硼酸、過硫酸銨、十六烷基三甲基溴化銨、乙二胺四乙酸二鈉、四甲基乙二胺、瓊脂糖、去離子甲酰胺、DNA分析儀用丙烯酰胺膠液、DNA分析儀用LIZ500分子量內(nèi)標(biāo)、DNA分析儀用電泳緩沖液、DNA分析儀用光譜校準(zhǔn)基質(zhì)。2.5SSR引物引物序列見表1表1引物編號及引物擴(kuò)增信息序號引物名稱條帶大?。╞p）引物退火溫度（℃）引物序列（5’-3’）1mangoES11148-24855正向：CTTCCTTTCTCTCATCACTTCCA反向：CTTCAATAGTAGCCCCATCACTG2mangoES24157-27055正向：CAGTAACTACTACCACCGCAACC反向：ATATTCTCGCTCTCGTTGTTTTG3mangoES35156-24655正向：TCCATTTTTGACAAATCTCCACT反向：TAGCCTTGAATTCCTCAAACAAA4mangoES39143-16355正向：GGTTGTTATCGTCGTTATTGTGG反向：CGGAAAATGTTCGACTTGTAACT5mangoES40144-24455正向：GGGACATTGACTTAACAGCTTTC反向：CTTCTGCCTGAATGTACTGGACT6mangoES69150-21055正向：CCTGTGCTTACCACCCATATTAG反向：AAAGATTGCAAGTCTGAGCAAAA7mangoES71125-18055正向：TGATGAGAATGAACAAGCAGCTA反向：TATCTGCAGTAACAGCACTCAGC8mangoES126143-20055正向：CGGGTAAACCCACTATGTATTCC反向：TGGTGGTGGTAAAAAGAAGAAAA9mangoES170150-15855正向：TCGAGAGCTACTCTTTATCGGAA反向：AATTAAGCGTGCAAACCTGTAGA10mangoES172146-19655正向：TATCATCAGAACTACCGCCATTT反向：CTCTTTTCTTCGCTGTGTTTTGT11EST14175-29050正向：ATTATCCCTATAATGCCCTAT反向：CTCGGTTAACCTTTGACTAC12MCR55170-22058正向：AGGACATCTGTGACCAAGAGC反向：TTCCCACCCACAACTCCAAC13MCR130250-26058正向：TGTCTTTCAGCTTCACCGCT反向：CGCAGTGGAGAGTTGTTGTG14MCR220250-51058正向：CGGGACCATGTCACCAGAAA反向：GGCGAATGCGTAGTCAGAGA15Lmma1205-25550正向：ATGGAGACTAGAATGTACAGAG反向：ATTAAATCTCGTCCACAAGT16Lmma4240-38047正向：AGATTTAAAGCTCAAGAAAAA反向：AAAGACTAATGTGTTTCCTTC表1引物編號及引物擴(kuò)增信息（續(xù)）序號引物名稱條帶大?。╞p）引物退火溫度（℃）引物序列（5’-3’）17Lmma5280-39047正向：AGAATAAGCTGATACTCACAC反向：TAACAAATATCTAATTGACAGG18Lmma6105-20550正向：ATATCTCAGGCTTCGAATGA反向：TATTAATTTTCACAGACTATGTTCA19Lmma7210-25050正向：ATTTAACTCTTCAACTTTCAAC反向：AGATTTAGTTTTGATTATGGAG20Lmma8260-36050正向：CATGGAGTTGTGATACCTAC反向：CAGAGTTAGCCATATAGAGTG21Lmma9205-23047正向：TTGCAACTGATAACAAATATAG反向：TTCACATGACAGATATACACTT22Lmma10155-21050正向：TTCTTTAGACTAAGAGCACATT反向：AGTTACAGATCTTCTCCAATT23Lmma11240-41049正向：ATTATTTACCCTACAGAGTGC反向：GTATTATCGGTAATGTCTTCAT24Lmma12210-25047正向：AAAGAATAGCATTTAATTAAGGA反向：GTAAGTATCGCTGTTTGTTATT25Lmma13180-23047正向：CACAGCTCAATAAACTCTATG反向：CATTATCCCTAATCTAATCATC26Lmma15220-27050正向：AACTACTGTGGCTGACATAT反向：CTGATTAACATAATGACCATCT27Lmma16220-25050正向：ATAGATTCATATCTTCTTGCAT反向：TATAAATTATCATCTTCACTGC28AY942818125-15055正向：CCACGAATATCAACTGCTGCC反向：TCTGACACTGCTCTTCCACC29AY94281990-14053正向：AAACGAGGAAACAGAGCAC反向：CAAGTACCTGCTGCAACTAG30AY942820170-23053正向：AGGTCTTTTATCTTCGGCCC反向：AAACGAAAAAGCAGCCCA31AY942821280-41049正向：TGTAGTCTCTGTTTGCTTC反向：TTCTGTGTCGTCAAACTC32AY94282323055正向：AGAATAAAGGGGACACCAGAC反向：CCATCATCGCCCACTCAG33AY942824220-32050正向：TTGATGCAACTTTCTGCC反向：ATGTGATTGTTAGAATGAACTT34AY942825240-39053正向：CGAGGAAGAGGAAGATTATGAC反向：CGAATACCATCCAGCAAAATAC35AY94282624050正向：TGTGAAATGGAAGGTTGAG反向：ACAGCAATCGTTGCATTC36AY942827180-24049正向：GTTTTCATTCTCAAAATGTGTG反向：CTTTCATGTTCATAGATGCAA37AY942828130-29053正向：CTCGCATTTCTCGCAGTC反向：TCCCTCCATTTAACCCTCC38AY942829370-50050正向：GAACGAGAAATCGGGAAC反向：GCAGCCATTGAATACAGAG廣西益譜檢測技術(shù)有限公司表2聚丙烯酰胺凝膠電泳所用的6個品種芒果與19對引物序號芒果品種名稱引物名稱序號引物名稱1桂熱芒07-3號AY94281811AY9428282桂熱芒290號AY94282312Lmma13金煌芒AY94281913Lmma154圣心AY94282014Lmma135臺農(nóng)AY94282115Lmma96桂七AY94282716Lmma117AY94282917Lmma128AY94282418Lmma49AY94282519Lmma510AY942826表3聚丙烯酰胺凝膠電泳所用的20個品種與19對引物序號芒果品種名稱引物名稱1桂熱芒07-2號mangoES392桂熱芒07-3號mangoES403桂熱芒08-10號mangoES1264桂熱芒10-1號mangoES1705桂熱芒16-1號mangoES696桂熱芒285號Lmma77桂熱芒290號Lmma108三年芒MCR559PULMERmangoES2410安寧紅芒mangoES3511金煌芒mangoES7112桂熱芒10號mangoES17213圣心MCR13014桂熱芒82號Lmma615桂熱芒60號Lmma816桂熱芒4號EST1417泰國芒14號MCR22018桂熱芒08-6號Lmma1619臺農(nóng)mangoES1120桂七廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實驗室和南寧國拓生物科技有限公司表4聚丙烯酰胺凝膠電泳所用的6個品種與38對引物序號芒果品種名稱引物名稱序號引物名稱1桂熱芒07-3號AY94281820mangoES112桂熱芒290號AY94282321mangoES243金煌芒AY94281922mangoES354圣心AY94282023mangoES395臺農(nóng)AY94282124mangoES406桂七AY94282725mangoES697AY94282926mangoES718AY94282427mangoES1269AY94282528mangoES17010AY94282629mangoES17211AY94282830EST1412Lmma131MCR22013Lmma1532MCR5514Lmma1333MCR13015Lmma934Lmma616Lmma1135Lmma717Lmma1236Lmma818Lmma437Lmma1019Lmma538Lmma16毛細(xì)管電泳廣西益譜檢測技術(shù)有限公司、廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實驗室、南寧國拓生物科技有限公司均選擇6個芒果品種，6對引物，每個品種分別做6對引物的毛細(xì)管電泳，品種名稱及引物名稱如下表6：表5毛細(xì)管電泳驗證所用的6個芒果品種與6對引物序號芒果品種名稱引物名稱1桂熱芒07-3號mangoES392桂熱芒290號mangoES1263金煌芒mangoES1724圣心Lmma165臺農(nóng)AY9428196桂七AY9428202.6操作步驟2.6.1樣品采集用不銹鋼剪刀采集種植的已知品種的芒果嫩葉放入塑料樣品袋中，做好標(biāo)識，放入0-8℃保溫箱中，帶回實驗室，于-18℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.6.2DNA的提取取2.6.1中適量芒果葉片用自來水沖洗干凈，再用去離子水沖洗兩遍，自然晾干后用不銹鋼剪刀剪碎放入研缽中，加入液氮研磨成粉末狀，分取100mg放入1.5mL離心管中，加入750μLCTAB提取溶液，渦旋振蕩混勻后于65℃水浴45min~60min，期間每隔15min顛倒離心管混勻；加入500μL的三氯甲烷，顛倒混勻，12000rpm離心3min，轉(zhuǎn)移上清液約0.5mL至新離心管中，加入等體積即0.5mL預(yù)冷至約4℃的無水乙醇，顛倒混勻，-18℃冰箱下靜置1h，12000rpm離心3min，去上清，室溫下干燥沉淀。加入50μL無菌純水于-18℃中保存?zhèn)溆?。注：以上為推薦的DNA提取方法。其他能夠達(dá)到PCR擴(kuò)增質(zhì)量要求的DNA提取方法也適用于本規(guī)程。2.6.3PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系見表7。表6PCR反應(yīng)體系試劑終濃度體積滅菌純水-8.5μL2×TaqTaqPlusPCR預(yù)混試劑1×12.5μL10μmol/L正向引物0.4μmol/L1.0μL10μmol/L反向引物0.4μmol/L1.0μL25ng/μLDNA模板2.0ng/μL2.0μL總體積25.0μLPCR反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，退火30s（退火溫度見表1推薦引物表），72℃延伸30s，35個循環(huán)；最后72℃下延伸7min。2.6.4PCR產(chǎn)物檢測非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測.1聚丙烯酰胺凝膠制備在一對玻璃板間插入1.0mm寬的間隔片，在封口處注入1%瓊脂糖溶液，讓其凝固密封。在50mL量杯中依次加入7.5mL5×TBE緩沖液，7.5mL40%Acryl/BisSolution(29:1)，攪拌并用純凈水定容至30mL；加入200μL10%過硫酸銨和12μL四甲基乙二胺溶液，混勻后倒入凝膠板之間，隨即插好樣品梳，使其在50min~60min內(nèi)聚合凝固，凝膠高度應(yīng)不小于10cm。.2電泳將玻璃板固定于垂直電泳槽上，在電泳槽中加入電泳緩沖液，小心拔下樣品梳。用加樣器吸取1μL不同引物（表1）PCR產(chǎn)物，加入樣品孔中，同時在同一塊膠中加入1μLDNAmarker。電泳選用的電壓梯度為1~5V/cm，2×TaqPlus預(yù)混試劑的藍(lán)色指示帶從上到下分別到達(dá)膠板1/2、2/3處（大約1h）后結(jié)束電泳。.3銀染顯色將附著凝膠的玻璃板用去離子水沖洗30s~60s后，將凝膠放入方形不銹鋼盤中，加入染色液覆蓋凝膠，輕搖5min~10min進(jìn)行染色；倒掉染色液，用去離子水快速漂洗，放入顯色液中，輕搖至顯色出清晰帶紋；取出凝膠用去離子水沖洗兩遍，瀝干后進(jìn)行拍照。毛細(xì)管電泳檢測.1PCR產(chǎn)物樣品準(zhǔn)備分別取等體積的稀釋后不同引物（表5）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶液混合，從混合液中吸取1μL按序號加入到DNA分析儀專用96孔板孔中，板中各孔分別再加入0.1μLDNALIZ500分子量內(nèi)標(biāo)和8.9μL去離子甲酰胺。將樣品在PCR儀上95℃變性5min，取出，迅速置于碎冰塊上，冷卻10-15min。將整個96孔板置于離心機(jī)中，離心10s后放置到DNA分析儀上待檢。.2電泳檢測按照儀器操作規(guī)程，編輯樣品表及運(yùn)行程序，執(zhí)行運(yùn)行程序，儀器自動給出檢測結(jié)果，保存并記錄數(shù)據(jù)。2.7數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計樣品每個SSR位點(diǎn)的等位變異采用擴(kuò)增片段長度的形式表示。對于毛細(xì)管電泳檢測方法，通過使用對照品種，消除同型號不同批次間或不同型號DNA分析儀間可能存在的系統(tǒng)誤差，使用片段分析軟件讀取待檢樣品在該位點(diǎn)的等位變異。對于非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法，將每個擴(kuò)增位點(diǎn)的等位變異與相應(yīng)的對照品種的等位變異片段大小進(jìn)行比較，確定待檢樣品在該位點(diǎn)的等位變異。純點(diǎn)結(jié)合的等位變異大小數(shù)據(jù)記為X/X，其中X為該位點(diǎn)等位變異的大??；雜合位點(diǎn)的等位變異大小數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y分別為該位點(diǎn)上的2個等位變異的大小，小片段數(shù)據(jù)在前、大片段數(shù)據(jù)在后。缺失位點(diǎn)在等位變異大小數(shù)據(jù)記錄為0/0。示例1：樣品在某個位點(diǎn)上僅出現(xiàn)1個等位變異，大小為160bp，則該位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為160/160。示例2：樣品在某個位點(diǎn)上僅出現(xiàn)2個等位變異，大小為160bp、165bp，則該位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為160/165。2.8判定方法當(dāng)待檢樣品和對照品種間差異位點(diǎn)數(shù)≥2，則判定為“不同品種”；當(dāng)待檢樣品和對照品種間差異位點(diǎn)數(shù)=1，判定為“近似品種”；當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)=0，判定為“極近似品種或相同品種”。2.9結(jié)果與記錄2.9.1用瓊脂糖凝膠檢測毛細(xì)管電泳和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果見附件原始記錄圖譜。廣西益譜檢測技術(shù)有限公司結(jié)果原始記錄圖譜（見附件1）廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實驗室結(jié)果原始記錄圖譜（見附件2）南寧國拓生物科技有限公司結(jié)果原始記錄圖譜（見附件3）四、制定標(biāo)準(zhǔn)的原則和依據(jù)，與現(xiàn)行法律、法規(guī)的關(guān)系，與有關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的協(xié)調(diào)情況。本標(biāo)準(zhǔn)的編制依據(jù)現(xiàn)行的法律、法規(guī)和國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)，與這些文件中的規(guī)定不存在矛盾，協(xié)調(diào)一致。五、重大意見分歧的處理結(jié)果和依據(jù)無六、提出標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)制實施或推薦實施的建議和理由本項標(biāo)準(zhǔn)的制訂，已經(jīng)實驗室的驗證，可作為推薦性地方標(biāo)準(zhǔn)，用于芒果種質(zhì)資源真?zhèn)蔚臋z測。廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《芒果品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法》編寫組2022.4.18附件1：廣西益譜檢測技術(shù)有限公司結(jié)果原始記錄及圖譜1非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳M123456789101112131415161718192021222324M252627282930313233343536373839404142M123456789101112131415161718192021222324M252627282930313233343536373839404142M123456789101112131415161718192021222324M252627282930313233343536373839404142M123456789101112131415161718192021222324M252627282930313233343536373839404142圖1.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種順序依次為：桂熱芒07-3號、桂熱芒290號、金煌芒、圣心、臺農(nóng)、桂七引物名稱：1-6:AY942818，7-12:AY942823，13-18:AY942819，19-24:AY942820，25-30：AY942821，31-36:AY942827，37-42:AY942829。M123456789101112131415161718M192021222324252627282930313233343536373839404142M123456789101112131415161718M192021222324252627282930313233343536373839404142圖2.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種順序依次為：桂熱芒07-3號、桂熱芒290號、金煌芒、圣心、臺農(nóng)、桂七引物名稱：1-6:AY942824，7-12:AY942826，13-18:AY942825，19-24：AY942828，25-30：Lmma1，31-36：Lmma15，37-42：Lmma13。M123456789101112131415161718192021222324252627282930M123456789101112131415161718192021222324252627282930圖3.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種順序依次為：桂熱芒07-3號、桂熱芒290號、金煌芒、圣心、臺農(nóng)、桂七引物名稱：1-6:Lmma9，7-12：Lmma12，13-18：Lmma11，19-24：Lmma4，25-30：Lmma5。MM1234567891011121314151617181920圖4.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：mangoES39MM1234567891011121314151617181920圖5.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：mangoES40MM1234567891011121314151617181920圖6.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：mangoES126MM1234567891011121314151617181920圖7.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：mangoES170MM1234567891011121314151617181920圖8.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：mangoES69MM1234567891011121314151617181920圖9.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：Lmma7MM1234567891011121314151617181920圖10.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：Lmma1MM1234567891011121314151617181920圖11.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：MCR55MM1234567891011121314151617181920圖12.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：mangoES24MM1234567891011121314151617181920圖13.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：mangoES35MM1234567891011121314151617181920圖14.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：mangoES71MM1234567891011121314151617181920圖15.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：mangoES172MM1234567891011121314151617181920圖16.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：MCR130MM1234567891011121314151617181920圖17.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：Lmma6MM1234567891011121314151617181920圖18.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：Lmma8MM1234567891011121314151617181920圖19.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：EST14MM1234567891011121314151617181920圖20.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：MCR220M1234567891011121314151617181920M1234567891011121314151617181920圖21.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：Lmma16MM1234567891011121314151617181920圖22.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種編號1-20順序依次為：桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農(nóng)、桂七引物名稱：mangoES112.毛細(xì)管電泳圖譜圖1桂熱芒07-3號基于引物mangoES39的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖2桂熱芒290號基于引物mangoES39的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖3金煌芒基于引物mangoES39的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖4圣心基于引物mangoES39的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖5臺農(nóng)基于引物mangoES39的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖6桂七基于引物mangoES39的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖7桂熱芒07-3號基于引物mangoES126的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖8桂熱芒290號基于引物mangoES126的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖9金煌芒基于引物mangoES126的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖10圣心基于引物mangoES126的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖11臺農(nóng)基于引物mangoES126的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖12桂七基于引物mangoES126的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖13桂熱芒07-3號基于引物mangoES172的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖14桂熱芒290號基于引物mangoES172的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖15金煌芒基于引物mangoES172的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖16圣心基于引物mangoES172的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖17臺農(nóng)基于引物mangoES172的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖18桂七基于引物mangoES172的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖19桂熱芒07-3號基于引物L(fēng)mma16的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖20桂熱芒290號基于引物L(fēng)mma16的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖21金煌芒基于引物L(fēng)mma16的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖22圣心基于引物L(fēng)mma16的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖23臺農(nóng)基于引物L(fēng)mma16的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖24桂七基于引物L(fēng)mma16的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖25桂熱芒07-3號基于引物AY942819的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖26桂熱芒290號基于引物AY942819的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖27金煌芒基于引物AY942819的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖28圣心基于引物AY942819的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖29臺農(nóng)基于引物AY942819的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖30桂七基于引物AY942819的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖31桂熱芒07-3號基于引物AY942820的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖32桂熱芒290號基于引物AY942820的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖33金煌芒基于引物AY942820的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖34圣心基于引物AY942820的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖35臺農(nóng)基于引物AY942820的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖36桂七基于引物AY942820的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜附件2：廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實驗室結(jié)果原始記錄及圖譜1非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳M123456789101112131415161718M192021222324252627282930313233343536373839404142M123456789101112131415161718M192021222324252627282930313233343536373839404142圖1.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種順序依次為：桂熱芒07-3號、桂熱芒290號、金煌芒、圣心、臺農(nóng)、桂七引物名稱：1-6:AY942818，7-12:AY942823，13-18:AY942819，19-24:AY942820，25-30：AY942821，31-36:AY942827，37-42:AY942829。M123456789101112131415161718192021222324M252627282930313233343536373839404142M123456789101112131415161718192021222324M252627282930313233343536373839404142圖2.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種順序依次為：桂熱芒07-3號、桂熱芒290號、金煌芒、圣心、臺農(nóng)、桂七引物名稱：1-6:AY942824，7-12:AY942826，13-18:AY942825，19-24：AY942828，25-30：Lmma1，31-36：Lmma15，37-42：Lmma13123456M789101112131415161718192021222324252627282930123456M789101112131415161718192021222324252627282930圖3.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種順序依次為：桂熱芒07-3號、桂熱芒290號、金煌芒、圣心、臺農(nóng)、桂七引物名稱：1-6:Lmma9，7-12：Lmma12，13-18：Lmma11，19-24：Lmma4，25-30：Lmma5。M123456789101112131415161718192021222324M252627282930313233343536373839404142M123456789101112131415161718192021222324M252627282930313233343536373839404142圖4.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種順序依次為：桂熱芒07-3號、桂熱芒290號、金煌芒、圣心、臺農(nóng)、桂七引物名稱：1-6:mangoES11,7-12:mangoES24,13-18:mangoES35,19-24:mangoES39,25-30:mangoES40,31-36:mangoES69,37-42:mangoES71。M123456789101112131415161718M192021222324252627282930313233343536373839404142M123456789101112131415161718M192021222324252627282930313233343536373839404142圖5.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種順序依次為：桂熱芒07-3號、桂熱芒290號、金煌芒、圣心、臺農(nóng)、桂七引物名稱：1-6:mangoES126,7-12:mangoES170,13-18:mangoES172,19-24:EST14,25-30:MCR220,31-36：MCR55,37-42：MCR130。123456M789101112131415161718192021222324252627282930123456M789101112131415161718192021222324252627282930圖6.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種順序依次為：桂熱芒07-3號、桂熱芒290號、金煌芒、圣心、臺農(nóng)、桂七引物名稱：1-6:Lmma6,7-12:Lmma7,13-18:Lmma8,19-24:Lmma10,25-30:Lmma16。2.毛細(xì)管電泳圖譜PAGEPAGE92圖1桂熱芒07-3號基于引物mangoES39的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖2桂熱芒290號基于引物mangoES39的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖3金煌芒基于引物mangoES39的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖4圣心基于引物mangoES39的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖5臺農(nóng)基于引物mangoES39的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖6桂七基于引物mangoES39的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖7桂熱芒07-3號基于引物mangoES126的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖8桂熱芒290號基于引物mangoES126的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖9金煌芒基于引物mangoES126的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖10圣心基于引物mangoES126的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖11臺農(nóng)基于引物mangoES126的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖12桂七基于引物mangoES126的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖13桂熱芒07-3號基于引物mangoES172的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖14桂熱芒290號基于引物mangoES172的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖15金煌芒基于引物mangoES172的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖16圣心基于引物mangoES172的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖17臺農(nóng)基于引物mangoES172的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖18桂七基于引物mangoES172的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖19桂熱芒07-3號基于引物L(fēng)mma16的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖20桂熱芒290號基于引物L(fēng)mma16的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖21金煌芒基于引物L(fēng)mma16的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖22圣心基于引物L(fēng)mma16的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖23臺農(nóng)基于引物L(fēng)mma16的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖24桂七基于引物L(fēng)mma16的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖25桂熱芒07-3號基于引物AY942819的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖26桂熱芒290號基于引物AY942819的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖27金煌芒基于引物AY942819的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖28圣心基于引物AY942819的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖29臺農(nóng)基于引物AY942819的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖30桂七基于引物AY942819的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖31桂熱芒07-3號基于引物AY942820的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖32桂熱芒290號基于引物AY942820的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖33金煌芒基于引物AY942820的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖34圣心基于引物AY942820的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖35臺農(nóng)基于引物AY942820的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜圖36桂七基于引物AY942820的擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測圖譜附件3：南寧國拓生物科技有限公司結(jié)果原始記錄及圖譜1.非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳M123456789101112131415161718192021222324M252627282930313233343536373839404142M123456789101112131415161718192021222324M252627282930313233343536373839404142圖1.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種順序依次為：桂熱芒07-3號、桂熱芒290號、金煌芒、圣心、臺農(nóng)、桂七引物名稱：1-6:AY942818，7-12:AY942823，13-18:AY942819，19-24:AY942820，25-30：AY942821，31-36:AY942827，37-42:AY942829。M123456789101112131415161718M192021222324252627282930313233343536373839404142M123456789101112131415161718M192021222324252627282930313233343536373839404142圖2.不同芒果品種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果備注：芒果品種順序依次為：桂熱芒07-3號、桂熱芒290號、金煌芒、圣心、臺農(nóng)、桂七引物名稱：1-6:AY942824，7-12:AY942826，13-18:AY942