1.微生物的分離純化目錄/Contents01菌種分離與純化技術(shù)簡介物理消毒滅菌法稀釋涂布平板法0203平板劃線分離法菌種分離與純化技術(shù)簡介

從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化,微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落,通常是由一個細(xì)胞繁殖而成的集合體。01菌種分離與純化技術(shù)簡介貼標(biāo)簽：打開平皿包扎紙，在平皿上蓋邊緣貼好標(biāo)簽紙或者用記號筆注明菌種、接種時間、操作者等信息。11bcda制備平板倒平皿：左手持平皿，開口位置過火，右手持三角瓶，向平皿內(nèi)傾注15-20mL培養(yǎng)基。取三角瓶：在酒精燈無菌區(qū)用右手將棉塞擰松，用右手手掌和小拇指拔取棉塞，右手持三角瓶，瓶口保持在酒精燈火焰旁。凝固：倒好的平皿輕輕晃動一下，置于水平操作臺上凝固，凝固中不能移動。02稀釋涂布平板法取6支盛有9mL無菌水的試管排列于試管架上，依次標(biāo)上10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6字樣。以1ml無菌吸管按無菌操作從樣品管中吸取1mL菌液于10-1試管中，然后用另一吸管在10-1試管中來回吹吸三次，使其混合均勻，制成10-1稀釋液。再用此吸管從10-1管中吸取1mL稀釋液注入10-2管中，依次制成10-2，10-3，10-4，10-5，10-6稀釋液。梯度稀釋02稀釋涂布平板法接種：用一支1mL無菌吸管從高稀釋度開始分別吸取各個低度稀釋液0.1mL至相應(yīng)的無菌平皿內(nèi)。11bcda接種涂布涂布：左手少許打開皿蓋，用涂布棒把培養(yǎng)基上的菌懸液均勻涂布開。將涂抹好的平板放于操作臺上20-30min，使菌液滲入培養(yǎng)基內(nèi)。燒涂布棒：右手拿涂布棒，在酒精燈上灼燒并冷卻。涂布棒滅菌：灼燒涂布棒滅菌。02稀釋涂布平板法培養(yǎng)b.清理臺面：整理試驗(yàn)臺面，實(shí)驗(yàn)器具滅菌、清洗歸位。a.培養(yǎng)：將接種好的平皿按照微生物最佳培養(yǎng)溫度倒置放于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。02稀釋涂布平板法挑取單菌落02稀釋涂布平板法將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許細(xì)胞接種到上述3種培養(yǎng)基斜面上,分別置于28℃和37℃溫室培養(yǎng)。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。貼標(biāo)簽：打開平皿包扎紙，在平皿上蓋邊緣貼好標(biāo)簽紙或者用記號筆注明菌種、接種時間、操作者等信息。11bcda制備平板倒平皿：左手持平皿，開口位置過火，右手持三角瓶，向平皿內(nèi)傾注15-20mL培養(yǎng)基。取三角瓶：在酒精燈無菌區(qū)用右手將棉塞擰松，用右手手掌和小拇指拔取棉塞，右手持三角瓶，瓶口保持在酒精燈火焰旁。凝固：倒好的平皿輕輕晃動一下，置于水平操作臺上凝固，凝固中不能移動。02平板劃線分離法取菌：用右手的小指和手掌取下管塞，試管口緩緩過火滅菌2-3次，接種環(huán)伸入試管，先使環(huán)接觸管內(nèi)壁，冷卻。將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中，沾取一環(huán)菌液。將試管口通過火焰，并塞上棉塞。cb接種環(huán)滅菌：右手拿接種環(huán)，在火焰上將環(huán)端灼燒滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部分均灼燒滅菌，重復(fù)灼燒2-3次。a準(zhǔn)備菌懸液：將菌懸液試管搖勻，擰松試管棉塞。平板劃線03平板劃線分離法e接種環(huán)滅菌：在酒精燈火焰上再次灼燒接種環(huán)滅菌。d平板劃線：左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌液的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，進(jìn)行連續(xù)或分區(qū)劃線，蓋上皿蓋。平板劃線03平板劃線分離法圖4-15平板劃線法示意圖培養(yǎng)b.清理臺面：整理試驗(yàn)臺面，實(shí)驗(yàn)器具滅菌、清洗歸位。a.培養(yǎng)：將接種好的平皿按照微生物最佳培養(yǎng)溫度倒置放于電熱恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。03平板劃線分離法挑取單菌落03平板劃線分離法將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許細(xì)胞接種到上述3種培養(yǎng)基斜面上,分別置于28℃和37℃溫室培養(yǎng)。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。

2.微生物菌種保藏技術(shù)目錄/Contents01常規(guī)保藏方法菌種保藏方法真空冷凍干燥保藏方法0201常規(guī)保藏方法

1、菌種保藏的目的存活，不丟失，不污染；防止優(yōu)良性狀喪失；隨時為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種。01常規(guī)保藏方法

1.斜面保藏法

將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，待其充分生長后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好（棉塞換成膠塞效果更好），置4℃冰箱中保藏。保藏時間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存2～4個月移種一次，酵母菌間隔兩個月，普通細(xì)菌一個月，假單胞菌兩周傳代一次。

此法優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、使用方便，缺點(diǎn)是保藏時間短、易變異、易被污染。01常規(guī)保藏方法2.液體石蠟保藏法

將無菌石蠟加在已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫或室溫下保存。此法實(shí)用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏1～2年，普通細(xì)菌也可保藏1年左右。此法的優(yōu)點(diǎn)是制作簡單，不需特殊設(shè)備，且不需經(jīng)常移種，還可防止干燥，缺點(diǎn)是保存時必須直立放置，所占位置較大，同時也不便攜帶。01常規(guī)保藏方法處理液體石蠟：將液體石蠟分裝于二角燒瓶內(nèi)，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，121℃滅菌30min，接著檢查是否徹底無菌，即接入肉湯中檢查有無雜菌生長。然后放在40℃溫箱中，使水分蒸發(fā)掉，備用。加石蠟油：用滅菌吸管在無菌操作下將5mL石蠟油注入到已長好菌的斜面上，加入的量以超過斜面頂端1cm為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。保藏：石蠟油封存后，將試管直立，放入4℃冰箱中保存。也可直接放在低溫干燥處保藏。01常規(guī)保藏方法

穿刺培養(yǎng)是將含0.6％～0.8％的瓊脂培養(yǎng)基裝試管滅菌后直立冷凝后，用接種針尖挑取少量菌體，垂直刺入瓊脂培養(yǎng)基中心，放在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)，待菌長好后即可放低溫保存，此法較斜面保存有利，大腸桿菌可保藏2年以上不發(fā)生明顯變異。02沙土保藏方法沙土保藏法①制作沙土管

②滅菌加壓蒸汽滅菌，直至檢測無菌為止。③制備菌液取3mL無菌水至待保藏的菌種斜面中,用接種環(huán)輕輕刮下菌苔。振蕩制成菌懸液。④加樣用1mL吸管吸取上述懸液0.1mL至沙土管,再用接種環(huán)拌勻。⑤干燥把裝好菌液的沙土管放入干燥器或同時用真空泵連續(xù)抽氣,使之干燥。⑥保藏干燥后的沙土管可直接放入冰箱中保藏；也可以用石蠟封住棉花塞后放冰箱中保藏。02真空冷凍干燥保藏方法真空冷凍干燥保藏法是兼具低溫、干燥、除氧三方面菌種保藏的主要因素，除不宜于絲狀真菌的菌絲體外，對病毒、細(xì)菌、放線菌、酵母及絲狀菌孢子等各類微生物都適用，不宜用凍干法保存的微生物不到2%。冷凍干燥保存的菌種存活時間長、效果好，一般菌種可保存5年以上，有的可保藏15年以上不發(fā)生變異。還具有體積小、不易污染、便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，是一種用得最為廣泛的菌種保藏方法。

02真空冷凍干燥保藏方法操作流程準(zhǔn)備安瓶管準(zhǔn)備脫脂乳準(zhǔn)備菌種制備菌懸液分裝樣品冷凍真空干燥封管存活性檢測保藏活化02真空冷凍干燥保藏方法（1）準(zhǔn)備安瓿管

用于冷凍干燥菌種保藏的管宜采用中性玻璃制造，形狀可用長頸球形底的，也稱淚滴形管。安瓶管先用2%HCl浸泡，再水洗多次，烘干。將標(biāo)簽放入安瓿管內(nèi)，管口塞上棉花，121℃滅菌30min，備用。02真空冷凍干燥保藏方法（2）制備脫脂乳用鮮乳經(jīng)處理或使用脫脂乳粉配兌脫脂牛乳，滅菌，并做無菌試驗(yàn)后備用。（3）準(zhǔn)備菌種

所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在最適培養(yǎng)基中用最適溫度培養(yǎng)，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物。細(xì)菌和酵母的菌齡要求超過對數(shù)生長期，用對數(shù)生長期的菌種進(jìn)行保藏，其存活率反而降低。一般，細(xì)菌要求24～48h的培養(yǎng)物；酵母需培養(yǎng)3天；放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7～10天。02真空冷凍干燥保藏方法（4）制備菌懸液

將脫脂牛乳2mL左右直接加到待保藏的菌種斜面試管中，用接種環(huán)將菌種刮下，輕輕攪亂使其均勻地懸浮在牛乳內(nèi)成懸浮液。（5）分裝樣品

用無菌長滴管將懸浮液分裝入安瓶管底部，每支安瓶管的裝量約為0.9mL（一般裝入量為安瓶管球部體積的1/3）。

（6）冷凍將分裝好的安瓶管放在低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰（固體CO2）酒精液或干冰丙酮液，溫度可達(dá)-70℃。將安瓶管插入冷凍劑，只需冷凍4～5min，即可使懸液結(jié)冰。02真空冷凍干燥保藏方法（7）真空干燥（8）封管（9）存活性檢測抽取一管進(jìn)行存活性檢查。（10）保藏一般4℃冰箱，避光處保藏。（11）活化

如果要從中取出菌種恢復(fù)培養(yǎng)，可先用消毒，然后將安瓶管上部在火焰上燒熱，再滴幾滴無菌水75％酒精將管的外壁，使管子破裂。再用接種針直接挑取松散的干燥樣品，在斜面接種。3.微生物細(xì)胞大小的測定和顯微鏡直接計(jì)數(shù)技術(shù)目錄/Contents01微生物細(xì)胞大小測定所用器材02微生物菌體大小測定方法微生物檢驗(yàn)室01測定用器材微生物細(xì)胞的大小是微生物重要的形態(tài)特征之一，只有在顯微鏡下用刻有一定刻度的測微尺才能測量。目鏡測微尺是一塊圓形玻片，在玻片中央刻有精確的刻度，通常是將5mm等分為50小格（或把10mm長度等分為100小格），實(shí)際每格等于100μm。由于不同目鏡、物鏡組合的放大倍數(shù)不相同，目鏡測微尺每格實(shí)際表示的長度也不一樣，因此測量微生物大小時須先用置于鏡臺上的鏡臺測微尺來標(biāo)定，以求出在一定放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每小格所代表的相對長度。01測定用器材鏡臺測微尺鏡臺測微尺為一塊特制的載玻片，其中央有一小圓圈。圓圈內(nèi)刻有精確的刻度，將長1mm的直線等分為100小格，每小格等于10μm（即0.01mm)，是專門用來標(biāo)定目鏡測微尺的。01測定用器材鏡臺測微尺鏡臺測微尺為一塊特制的載玻片，其中央有一小圓圈。圓圈內(nèi)刻有精確的刻度，將長1mm的直線等分為100小格，每小格等于10μm（即0.01mm)，是專門用來標(biāo)定目鏡測微尺的。01測定用器材目鏡測微尺鏡臺測微尺01

血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片。玻片中有四條下凹的槽，構(gòu)成三個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊上面刻有一個方格網(wǎng)。方格網(wǎng)上刻有9個大方格，其中只有中間的一個大方格為計(jì)數(shù)室，供微生物計(jì)數(shù)用。這一大方格的長和寬各為1mm，面積為1mm，深度為0.1mm（即蓋上蓋玻片后，計(jì)數(shù)區(qū)的高度為0.1mm），所以其體積為0.1mm。測定用器材血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造01測定用器材01測定用器材01血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造測定用器材01血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造測定用器材02測定方法

目鏡測微尺的校正（1）取下接目鏡，旋下目鏡的上透鏡，將目鏡測微尺有刻度的一面朝下，放入接目鏡的隔板上，再旋上目透鏡，裝入鏡筒內(nèi)。（2）將鏡臺測微尺置于顯微鏡的載物臺上，使有刻度的一面朝上，同觀察標(biāo)本一樣，使具有刻度的小圓圈位于視野中央。02測定方法

（3）用低倍鏡觀察，對準(zhǔn)焦距，待看清物鏡測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微尺的刻度與物鏡測微尺的刻度相平行，并使目鏡測微尺和鏡臺測微尺的某一區(qū)間的兩對刻度線完全重合；也可使兩尺的左邊第一條線完全重合，再向右尋找兩尺的另外一條重合線。02測定方法

（4）記錄二對重合線間的目鏡測微尺所占的格數(shù)和鏡臺測微尺所占的格數(shù)。因?yàn)殓R臺測微尺的刻度每格長10μm，所以由下列公式可以算出目鏡測微尺每格所代表的長度。目鏡測微尺每格長度

（μm）用同樣法，分別校正在高倍鏡下和油鏡下目鏡測微尺每小格所代表的長度。注意：校正目鏡測微尺只能在特定的情況下重復(fù)使用，若更換物鏡或目鏡的放大倍數(shù)時，必須重新校正目鏡測微尺每一格所代表的長度。＝兩個刻度重合間鏡臺測微尺格數(shù)×10兩個刻度重合間目鏡測微尺格數(shù)02測定方法

菌體大小的測定①將啤酒酵母制成水浸片。②大小換算。將標(biāo)本先在低倍鏡下找到目的物,然后在高倍鏡下用目鏡測微尺測定每個菌體長度和寬度所占的刻度,刻度乘上目鏡測微尺每格和長度,即等于該微生物的大小。③求平均值

一般測量微生物細(xì)胞的大小,用同一放大倍數(shù)在同一標(biāo)本上任意測定10～20個菌體后,求出其平均值即可代表該菌的大小。02測定方法血球計(jì)數(shù)板的使用

①稀釋菌液

根據(jù)待測菌懸液濃度，加無菌水適當(dāng)稀釋，目的是便于酵母菌懸液的計(jì)數(shù)，以每小方格內(nèi)含有4～5個酵母細(xì)胞為宜，一般稀釋100倍即可。

②準(zhǔn)備計(jì)數(shù)板取清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板（使用前可通過顯微鏡檢驗(yàn)計(jì)數(shù)板上有無污物，若有，則需清洗后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)），在中央的計(jì)數(shù)室上加蓋專用的蓋玻片。02測定方法

③加樣懸液搖勻，用滴管吸取一滴置于蓋玻片的邊緣（不宜過多），讓菌懸液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用緩緩滲入計(jì)數(shù)室，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。

④計(jì)數(shù)靜置片刻（一般5～10min)，使酵母菌全部沉降到血球計(jì)數(shù)室內(nèi)。將血球計(jì)數(shù)板置于載物臺上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)室后，再換成高倍鏡觀察并計(jì)數(shù)。由于活細(xì)胞的折射率和水的折射率相近，觀察時應(yīng)減弱光照的強(qiáng)度。02測定