P84PCR儀器PCR→PCR產(chǎn)物→電泳2、DNA移動的方向：向與自身帶電情況相反的電極方向移動一般使用的電泳緩沖液pH=8，DNA分子帶負電荷，在電場中DNA便由負極向正極泳動。1、DNA移動的原理3、DNA移動進度的觀測：依靠：電泳指示劑【拓展】電泳指示劑還可以：使上樣孔中的樣品可見，確保樣品準確加入孔內(nèi)。電泳原理：指示劑移動速率比DNA更快，當指示劑遷移至凝膠邊緣時，提示應及時停止電泳，避免目標分子跑出凝膠。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠瓊脂糖的微結(jié)構(gòu)資料卡片：瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，從瓊脂中提取而來，在電泳緩沖液中加熱到沸點后溶解，冷卻后又凝固成均勻的膠體胨，具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。拓展：瓊脂糖冷卻后形成具有剛性濾孔的膠體胨，凝膠孔徑的大小由瓊脂糖的濃度決定。筆記：瓊脂糖凝膠電泳中影響DNA分子移動速率的因素：①凝膠的濃度②DNA分子大小和構(gòu)像③電壓大?。ㄓ绊懩z濾孔孔徑大?。┮?guī)律：DNA分子越大，遷移越慢。微量離心管：實際上是進行PCR反應的場所微量移液器：用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體擴增緩沖液：含鎂離子、pH：8.0電泳緩沖液：是Tris-乙酸鹽緩沖液或Tris-硼酸鹽緩沖液含EDTA、pH：8.0作用：抑制核酸酶活性，保護DNA微量離心管：實際上是進行PCR反應的場所微量移液器：用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體擴增緩沖液：含鎂離子、pH：8.0電泳緩沖液：是Tris-乙酸鹽緩沖液或Tris-硼酸鹽緩沖液含EDTA、pH：8.0凝膠載樣緩沖液：含：溴酚藍是：電泳指示劑作用：抑制核酸酶活性，保護DNA微量離心管：實際上是進行PCR反應的場所微量移液器：用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體擴增緩沖液：含鎂離子、pH：8.0電泳緩沖液：是Tris-乙酸鹽緩沖液或Tris-硼酸鹽緩沖液含EDTA、pH：8.0凝膠載樣緩沖液：含：溴酚藍是：電泳指示劑作用：抑制核酸酶活性，保護DNA核酸染料：的作用：染劑與DNA結(jié)合后能吸收300nm波長的紫外光，發(fā)出可見熒光。其熒光強度與DNA分子的含量成正比。與樣品一起添加在加樣孔中配置凝膠糖溶液時添加在已融化并稍微冷卻后的凝膠中實驗1：PCR等濃度、等量參照下表的參數(shù)，設置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量移液管中依次加入各組分。待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部移液離心擴增實驗1：PCR使DNA充分變性，雙鏈打開，以利于引物更好地和模板結(jié)合思考1：預變性的目的是什么？思考2：為什么最后1次變性時間延長？使DNA充分變性，雙鏈打開，以利于引物更好地和模板結(jié)合思考1：預變性的目的是什么？原理：①TaqDNA聚合酶活性會隨著循環(huán)次數(shù)增加而下降，導致在后期的PCR循環(huán)中，會發(fā)生“部分片段可能沒有完全延伸完，TaqDNA聚合酶就脫落了”的情況，形成“半成品DNA”。②與正常DNA產(chǎn)物相比，這種“半成品DNA”在變性時需要的能量更多。目的：為了讓未延伸完全的DNA雙鏈部分完全解開，重新延伸。思考3：為什么最后1次延伸時間延長？確保DNA鏈完整合成梳子配制瓊脂糖溶液制備凝膠實驗2：瓊脂糖凝膠電泳加樣配制瓊脂糖溶液制備凝膠實驗2：瓊脂糖凝膠電泳加樣【筆記】標準參照物（Marker）1、是：已知的DNA分子大小的片段，2、作用：在實驗時和樣本DNA同時進行凝膠電泳，通過對比兩者的遷移速率，可以大致估計樣本DNA的大小。配制瓊脂糖溶液制備凝膠加樣實驗2：瓊脂糖凝膠電泳電泳、觀察分子量大（長片段）分子量?。ǘ唐危┖可伲ú涣?、細帶）含量多（很亮、粗帶）注意：1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20°C儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。結(jié)果分析1.你是否成功擴增出DNA片段?判斷的依據(jù)是什么?可以通過紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及粗細來評價擴增結(jié)果。電泳方向小片段大片段規(guī)律：DNA分子量越大，遷移的越慢（條帶位置遠離點樣孔）DNA分子量越小，遷移的越快（條帶位置靠近點樣孔）且DNA數(shù)量越多，條帶越寬、越亮。2.你進行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶?如果不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個結(jié)果的可能原因。如果擴增不成功，可能的原因有：①漏加了PCR的反應成分，②各反應成分的用量不當，③PCR程序設置不當如果擴增擴增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：①引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易聚合成二聚體②退后溫度過低③DNA聚合酶的質(zhì)量不好若外源基因是單點（單個）插入植物核基因組（且未破壞內(nèi)源基因），自交后通常表現(xiàn)為孟德爾分離比（如3:1或1:2:1）。但是：大多數(shù)情況下，插入的目的基因數(shù)量、插入的位置都是隨機的