ICS11.220DB21B41遼寧省地方標準DB21/T3253—2020小反芻獸疫病毒實時熒光RT-PCR檢測方法Developmentthemethodofreal-timefluorescentRT-PCRfordetectionofPPRV遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB21/T3253—2020目次前123456789言..............................................................................II范圍................................................................................1規(guī)范性引用文件......................................................................1縮略語..............................................................................1原理................................................................................1儀器和器材..........................................................................1試劑和引物..........................................................................2操作步驟............................................................................2試驗成立條件與結果判定..............................................................4檢測過程中防治交叉污染的措施........................................................410廢棄物處理.........................................................................5IDB21/T3253—2020前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由動物衛(wèi)生標準化技術委員會（遼寧）提出。本標準由遼寧省農業(yè)農村廳歸口。本標準起草單位：遼寧省農業(yè)發(fā)展服務中心、洛陽萊普生信息科技有限公司、遼寧佰瑞生物科技有限公司。本標準主要起草人：鄧文超、石霖、魏園園、吳繼陽、張皓淳、王冰、張鑫、王竹、劉金玲、董娜、高原、楊作豐、彭瀟瀟、姚偉、里里、陳騰、胡影。本標準發(fā)布實施后，任何單位和個人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進行反饋，我們將及時答復并認真處理，根據實際情況依法進行評估及復審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省農業(yè)農村廳（沈陽市和平區(qū)太原北街2號），聯系電話標準起草單位通訊地址：遼寧省動物及產品檢疫中心（沈陽市沈河區(qū)萬柳塘路105號甲），聯系電話IIDB21/T3253—2020小反芻獸疫病毒實時熒光RT-PCR檢測方法1范圍本標準規(guī)定了小反芻獸疫病毒實時熒光RT-PCR檢測方法的技術要求。本標準適用于在生物安全Ⅱ級（BSL-2）以上的實驗室進行小反芻獸疫病毒病的診斷、監(jiān)測及流行病學調查，適用于反芻動物血液血清、淋巴結及口鼻棉拭子中小反芻獸疫病毒核酸的RT-PCR檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T19495.2-2004轉基因產品檢測實驗室技術要求中華人民共和國農業(yè)部公告第302號（《獸醫(yī)實驗室生物安全技術管理規(guī)范》）農業(yè)部關于印發(fā)《病死及病害動物無害化處理技術規(guī)范》的通知（農醫(yī)發(fā)[2017]25號）3縮略語DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）RT-PCR：反轉錄聚合酶鏈式反應（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）PBS：磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersolution）TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液（Trisacetate-EDTAbuffer）4本方法針對小反芻獸疫病毒高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在反應體系中含小反芻獸疫病毒基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強5臺式冷凍離心機（離心范圍0～20000r/min）冰箱：4℃±1℃，-20℃±1℃，-80℃±1℃1DB21/T3253—20205.3全自動熒光定量PCR儀（ABI7000、ABI7300、ABI7500、ABI7900、BIO-RadCFX384Touch、BIO-RadCFX96Touch等）5.45.5離心管：15mL、1.5mL和0.2mL。微量可調移液器：100～1000μL，20～200μL，10～100μL，5～50μL，2～20μL，0.5～10μL，0.2～2μL。6試劑和引物6.1RNA抽提試劑：Trizol外觀為淡粉色，于4～8℃保存。6.26.36.4氯仿：-20℃預冷。異丙醇：-20℃預冷。DEPC水：去離子水中加入0.1%DEPC，37℃作用1h或室溫過夜，121±1℃高壓滅菌15min。6.575%乙醇：用無水乙醇和DEPC水配制，-20℃預冷。6.66.7陽性對照：PPRV細胞培養(yǎng)物。陰性對照：滅菌水。6.8PrimeScriptTMoneStepRT-PCRkitVer.2試劑盒。6.9PBS：磷酸鹽緩沖液（0.02mol/LpH7.2）。引物：用于RT-PCR反應的引物濃度為20μmol/L。注：本標準中使用的試劑，除另有說明外，所有實驗使用的試劑等級均為不含RNA或RNase的分析純或生化試劑；所有試劑均用無RNA酶污染的無菌的容器分裝。7采樣時要將拭子深入口腔、鼻腔來回刮3~5次，取口腔、鼻腔分泌液，將拭子放入有1.0mLPBS的采用靜脈采血方法，使用無菌注射器抽取羊只血液樣品置于離心管中待檢或者靜置后取上清待檢。取少量樣品（2~3g）于研缽或勻漿器中研磨,加10mLPBS混勻，然后將研磨勻漿轉入無菌離心管中，4℃，3000r/min離心10min取上清液轉入無菌的1.5mL離心管中，編號待檢。2DB21/T3253—2020采集或處理的樣品在2～8℃條件下保存應不超過24h；若需長期保存，應放置-80℃冰箱，但應避免反復凍融（凍融不超過3次）。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在6～8h之內運送到實驗室檢測。按照《獸醫(yī)實驗室生物安全技術管理規(guī)范》進行樣品的生物安全標識。7.2熒光RT-PCR檢測7.2.1RNA提取RNA的提取可采用手動提取或者使用商品化試劑盒提取，但是注意提取時設立陽性對照、陰性對照。7.2.1.1手動提取RNA的操作步驟7.2.1.1.1將750μLTrizol加入1.5mL滅菌離心管中，然后加入250μL待檢樣品，顛倒混勻后室溫靜置3～5min。7.2.1.1.27.2.1.1.2再加入250μL氯仿，混勻器上振蕩混合15s（或用手反復顛倒混勻），4℃下13000r/min離心15min。7.1.1.1.3小心吸取450μL上清液轉移至裝有500μL異丙醇的1.5mL滅菌離心管中，顛倒混勻。-20℃室溫靜置15min，4℃13000r/min離心10min。7.1.1.1.4棄上清液，加入1mL75%的DEPC乙醇，4℃下13000r/min離心10min。重復洗滌2次。7.1.1.1.54000r/min離心10s，用微量移液器小心將殘余液體吸干，室溫干燥3～10min。7.1.1.1.6干燥后用20μLDEPC水溶解管壁上的RNA，冰上保存?zhèn)溆?；若需長期保存應放置-70℃冰反應體系的成分：去離子水7.5ul，上游引物PPRVF0.5ul，下游引物PPRVR0.5ul，探針PPRVP(10umol/L)0.5ul，2╳qPCRMasterMix12.5ul，Taq聚合酶0.5ul，反轉錄酶0.5ul，加入PCR反應管后震蕩離心混勻。打開PCR反應管蓋，加入PCR反應液20μL,加入樣本模板5μL，陽性對照和陰性對照也各加5μL，記錄加樣順序。蓋好PCR管蓋，將PCR反應液與樣本模板振蕩混勻后，4℃，2000r/min，離心10s。將PCR反應管轉移到PCR區(qū)進行上機。開機預熱并檢驗儀器性能。取樣本準備區(qū)準備好的PCR反應管，放置在儀器樣品槽相應位置，并記錄放置順序。3DB21/T3253—20207.2.4.3按表1設置儀器擴增相關參數，進行PCR擴增表1儀器擴增相關參數體系信號采集反應體系設為25μL小反芻獸疫病毒—FAM通道采集熒光信號。階段條件50℃：10min循環(huán)數反轉錄預變性11PCR反應條件95℃：3min95℃：5sPCR55℃：60s45（此階段結束時采集熒光信號）8試驗成立條件與結果判定試驗成立條件8.1陽性對照：Ct值≤30，有明顯指數增長，呈典型的S