病原微生物檢測(cè)技術(shù)目錄概述病原微生物基礎(chǔ)知識(shí)傳統(tǒng)檢測(cè)方法顯微鏡、培養(yǎng)與生化技術(shù)現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)分子生物學(xué)與高通量技術(shù)應(yīng)用與展望第一章：概述細(xì)菌單細(xì)胞微生物病毒需宿主復(fù)制的微粒真菌含有細(xì)胞壁的真核生物寄生蟲(chóng)依賴宿主生存的復(fù)雜生物什么是病原微生物？定義能引起宿主疾病的微小生物細(xì)菌原核單細(xì)胞微生物病毒非細(xì)胞結(jié)構(gòu)的遺傳物質(zhì)包真菌與寄生蟲(chóng)真核微生物，復(fù)雜結(jié)構(gòu)病原微生物檢測(cè)的重要性疾病診斷確定病原體是臨床治療的基礎(chǔ)食品安全預(yù)防食源性疾病爆發(fā)公共衛(wèi)生控制傳染病傳播，保障群體健康檢測(cè)技術(shù)發(fā)展歷程11670年代列文虎克發(fā)明顯微鏡21880年代科赫固體培養(yǎng)基31940年代抗生素敏感試驗(yàn)41980年代PCR技術(shù)誕生52000年代高通量測(cè)序技術(shù)第二章：傳統(tǒng)檢測(cè)方法鏡檢形態(tài)學(xué)觀察培養(yǎng)法活菌分離培養(yǎng)生化鑒定代謝特性分析血清學(xué)檢測(cè)免疫反應(yīng)檢測(cè)直接涂片鏡檢原理通過(guò)染色突出微生物形態(tài)特征直接觀察微生物的存在適用范圍能直接觀察的各類(lèi)標(biāo)本需要快速初步診斷的場(chǎng)景優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便快速缺點(diǎn)：敏感性低，特異性有限培養(yǎng)法原理提供適宜條件使微生物生長(zhǎng)繁殖普通培養(yǎng)基適合大多數(shù)微生物生長(zhǎng)選擇性培養(yǎng)基抑制某些菌群，促進(jìn)特定菌生長(zhǎng)鑒別培養(yǎng)基通過(guò)顏色變化區(qū)分不同菌種培養(yǎng)法（續(xù)）培養(yǎng)條件溫度：37°C常規(guī)，特殊菌不同氧氣：需氧，兼性，厭氧培養(yǎng)時(shí)間：18-24小時(shí)至數(shù)周優(yōu)點(diǎn)獲得活菌培養(yǎng)物可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)金標(biāo)準(zhǔn)地位缺點(diǎn)耗時(shí)長(zhǎng)部分病原體難培養(yǎng)需特殊設(shè)備和條件生化鑒定20+常見(jiàn)生化試驗(yàn)用于區(qū)分不同微生物種類(lèi)4小時(shí)快速生化系統(tǒng)自動(dòng)化檢測(cè)多種生化反應(yīng)98%鑒定準(zhǔn)確率常見(jiàn)細(xì)菌的準(zhǔn)確識(shí)別率血清學(xué)檢測(cè)原理抗原抗體特異性結(jié)合檢測(cè)患者體內(nèi)抗體或病原體抗原凝集試驗(yàn)觀察顆粒凝集現(xiàn)象快速、簡(jiǎn)便，但特異性有限ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)高靈敏度和特異性第三章：現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)核酸檢測(cè)直接檢測(cè)病原體基因組蛋白質(zhì)檢測(cè)檢測(cè)特異性蛋白標(biāo)志物生物信息學(xué)數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析自動(dòng)化系統(tǒng)集成化檢測(cè)流程4分子生物學(xué)技術(shù)概述聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）變性95°C，DNA雙鏈分離退火55-60°C，引物結(jié)合延伸72°C，DNA聚合酶合成新鏈循環(huán)放大30-40個(gè)循環(huán)，指數(shù)級(jí)擴(kuò)增目標(biāo)片段PCR技術(shù)的應(yīng)用1常規(guī)PCR結(jié)果需電泳分析，只能定性2實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程，可定量3多重PCR同時(shí)檢測(cè)多個(gè)病原體4數(shù)字PCR單分子擴(kuò)增，精確定量基因芯片技術(shù)原理固相載體上固定大量已知序列探針通過(guò)雜交反應(yīng)檢測(cè)樣本中的靶序列優(yōu)勢(shì)高通量同時(shí)檢測(cè)多種病原體可檢測(cè)耐藥基因結(jié)果可視化局限性成本較高靈敏度低于PCR需預(yù)先設(shè)計(jì)探針質(zhì)譜技術(shù)新一代測(cè)序技術(shù)（NGS）文庫(kù)構(gòu)建DNA片段化并連接接頭擴(kuò)增PCR或橋式擴(kuò)增生成簇測(cè)序合成法或連接法檢測(cè)堿基數(shù)據(jù)分析生物信息學(xué)處理生成序列宏基因組測(cè)序（mNGS）概念直接測(cè)序環(huán)境或臨床樣本中所有微生物基因組不依賴培養(yǎng)或預(yù)設(shè)靶標(biāo)與傳統(tǒng)方法比較無(wú)需預(yù)先了解可能的病原體單次檢測(cè)覆蓋各類(lèi)微生物可發(fā)現(xiàn)新型或罕見(jiàn)病原體mNGS的檢測(cè)流程樣本采集血液、腦脊液、組織等核酸提取提取總DNA/RNA文庫(kù)構(gòu)建DNA片段化、接頭連接高通量測(cè)序生成海量序列數(shù)據(jù)生物信息分析比對(duì)參考數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定病原體mNGS的優(yōu)勢(shì)無(wú)需預(yù)設(shè)靶標(biāo)不受檢測(cè)范圍限制可檢測(cè)未知病原體新發(fā)傳染病診斷利器高通量同時(shí)檢測(cè)多種病原體快速急危重癥快速診斷mNGS的局限性成本單次檢測(cè)費(fèi)用高設(shè)備投入大結(jié)果解讀挑戰(zhàn)數(shù)據(jù)量龐大需專(zhuān)業(yè)生物信息學(xué)分析污染問(wèn)題極易受環(huán)境DNA污染假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)高免疫學(xué)新技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)原理：熒光標(biāo)記抗原或抗體優(yōu)勢(shì)：高通量單細(xì)胞分析應(yīng)用：細(xì)胞內(nèi)病原體檢測(cè)微流控技術(shù)原理：微型化反應(yīng)系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)：樣本量少，自動(dòng)化程度高應(yīng)用：即時(shí)檢測(cè)（POCT）第四章：病毒檢測(cè)技術(shù)14形態(tài)學(xué)電鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)、雞胚抗原檢測(cè)免疫學(xué)方法核酸檢測(cè)分子生物學(xué)方法病毒培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)連續(xù)傳代細(xì)胞系原代細(xì)胞培養(yǎng)觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)雞胚培養(yǎng)適用于流感病毒等接種部位：尿囊腔、羊膜腔觀察胚胎病變病毒抗原檢測(cè)免疫熒光法熒光標(biāo)記抗體結(jié)合病毒抗原熒光顯微鏡下觀察免疫層析法側(cè)向流動(dòng)技術(shù)金標(biāo)或熒光標(biāo)記應(yīng)用范圍呼吸道病毒腸道病毒病毒核酸檢測(cè)PCR循環(huán)次數(shù)DNA拷貝數(shù)(對(duì)數(shù)值)第五章：細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)1形態(tài)學(xué)檢查染色鏡檢培養(yǎng)鑒定菌落特征與生化反應(yīng)耐藥性檢測(cè)藥敏試驗(yàn)4分子檢測(cè)基因型分析細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查革蘭染色區(qū)分革蘭陽(yáng)性（紫色）和革蘭陰性（紅色）細(xì)菌根據(jù)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差異抗酸染色檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌等抗酸菌利用細(xì)胞壁含脂質(zhì)高特性熒光染色熒光顯微鏡下觀察提高檢出率和特異性細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定選擇性培養(yǎng)基抑制雜菌，促進(jìn)目標(biāo)菌生長(zhǎng)鑒別培養(yǎng)基通過(guò)顏色變化區(qū)分菌種自動(dòng)化鑒定系統(tǒng)VITEK/Phoenix系統(tǒng)快速鑒定質(zhì)譜鑒定MALDI-TOFMS蛋白指紋圖譜細(xì)菌耐藥性檢測(cè)24小時(shí)紙片擴(kuò)散法K-B法抗生素敏感性測(cè)定8小時(shí)微量肉湯稀釋法確定最小抑菌濃度(MIC)4小時(shí)自動(dòng)化系統(tǒng)快速、標(biāo)準(zhǔn)化藥敏結(jié)果2小時(shí)分子檢測(cè)耐藥基因直接檢測(cè)第六章：真菌檢測(cè)技術(shù)直接鏡檢形態(tài)學(xué)特征初步識(shí)別培養(yǎng)鑒定菌落特征與顯微結(jié)構(gòu)觀察生化免疫細(xì)胞壁成分檢測(cè)4分子檢測(cè)真菌DNA序列分析真菌鏡檢KOH透明法10-20%KOH溶解角蛋白質(zhì)墨汁染色顯示隱球菌莢膜熒光染色鈣熒光白與真菌壁結(jié)合真菌培養(yǎng)沙氏培養(yǎng)基常用于真菌初次分離含環(huán)丙沙星抑制細(xì)菌改良馬丁培養(yǎng)基用于病原性真菌培養(yǎng)抑制污染菌生長(zhǎng)玉米粉瓊脂觀察真菌孢子結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)鑒定輔助真菌血清學(xué)檢測(cè)(1,3)-β-D-葡聚糖檢測(cè)真菌細(xì)胞壁成分半乳甘露聚糖檢測(cè)侵襲性曲霉菌感染標(biāo)志物隱球菌莢膜多糖抗原隱球菌腦膜炎診斷第七章：寄生蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)直接檢查顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察免疫學(xué)檢測(cè)檢測(cè)抗原或抗體2分子生物學(xué)PCR檢測(cè)特異基因序列3培養(yǎng)分離特定寄生蟲(chóng)體外繁殖4寄生蟲(chóng)直接檢查糞便檢查直接涂片法浮聚集法沉淀法血液涂片厚涂片檢查薄涂片檢查檢測(cè)血液寄生蟲(chóng)組織檢查活檢組織檢查HE染色特殊染色寄生蟲(chóng)免疫學(xué)檢測(cè)間接免疫熒光抗體法檢測(cè)患者血清中特異性抗體熒光顯微鏡下觀察免疫層析法快速檢測(cè)抗原或抗體現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)ELISA高通量篩查半定量分析寄生蟲(chóng)分子生物學(xué)檢測(cè)特異性PCR基于保守基因區(qū)域設(shè)計(jì)引物L(fēng)AMP技術(shù)等溫?cái)U(kuò)增，現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)多重PCR同時(shí)檢測(cè)多種寄生蟲(chóng)高通量測(cè)序復(fù)雜混合感染分析第八章：快速檢測(cè)技術(shù)樣本采集1分鐘，無(wú)需預(yù)處理樣本加載直接滴加，操作簡(jiǎn)單反應(yīng)等待10-30分鐘自動(dòng)反應(yīng)結(jié)果判讀肉眼觀察或儀器讀取免疫層析技術(shù)原理側(cè)向流動(dòng)技術(shù)抗原抗體特異性結(jié)合膠體金或熒光標(biāo)記顯示結(jié)果應(yīng)用：新冠病毒抗原檢測(cè)樣本類(lèi)型：鼻咽拭子檢測(cè)時(shí)間：15-30分鐘靈敏度：中等特異性：高等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)60分鐘反應(yīng)時(shí)間比PCR反應(yīng)更快60-65°C反應(yīng)溫度無(wú)需溫度循環(huán)儀4-6對(duì)引物數(shù)量特異性高，靈敏度高10?倍擴(kuò)增倍數(shù)擴(kuò)增效率高于PCR基于CRISPR的檢測(cè)技術(shù)核酸提取樣本中分離靶標(biāo)序列擴(kuò)增RPA或LAMP預(yù)擴(kuò)增CRISPR識(shí)別Cas蛋白特異切割靶序列信號(hào)產(chǎn)生熒光或側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)第九章：自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)血培養(yǎng)自動(dòng)化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)微生物生長(zhǎng)微生物鑒定系統(tǒng)生化反應(yīng)或質(zhì)譜分析分子診斷平臺(tái)全流程自動(dòng)化核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化樣本處理與檢測(cè)一體化自動(dòng)化血培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)時(shí)間（小時(shí)）檢出率（%）自動(dòng)化微生物鑒定系統(tǒng)VITEK系統(tǒng)生化反應(yīng)卡自動(dòng)孵育和讀數(shù)3-8小時(shí)出結(jié)果Phoenix系統(tǒng)微量肉湯稀釋法同時(shí)進(jìn)行鑒定和藥敏結(jié)果更快，4-6小時(shí)質(zhì)譜系統(tǒng)MALDI-TOFMS技術(shù)蛋白質(zhì)指紋圖譜分析2分鐘出結(jié)果全自動(dòng)分子診斷平臺(tái)GeneXpert系統(tǒng)集成樣本處理和PCR擴(kuò)增2小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)FilmArray系統(tǒng)多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)多種病原體全流程自動(dòng)化優(yōu)勢(shì)降低污染風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)準(zhǔn)化操作提高準(zhǔn)確性第十章：質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室生物安全保障人員與環(huán)境安全樣本采集與處理確保樣本質(zhì)量2內(nèi)部質(zhì)控日常監(jiān)控檢測(cè)質(zhì)量外部質(zhì)評(píng)驗(yàn)證檢測(cè)能力實(shí)驗(yàn)室生物安全1BSL-4埃博拉、天花等高危病原體2BSL-3結(jié)核菌、SARS-CoV-2等3BSL-2沙門(mén)菌、流感病毒等4BSL-1非致病性微生物樣本采集與處理實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照驗(yàn)證檢測(cè)程序是否正常工作陰性對(duì)照監(jiān)控試劑污染情況空白對(duì)照評(píng)估實(shí)驗(yàn)環(huán)境背景干擾平行雙檢保障結(jié)果一致性外部質(zhì)量評(píng)價(jià)室間質(zhì)評(píng)多家實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一樣本檢測(cè)結(jié)果比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性問(wèn)題能力驗(yàn)證第三方機(jī)構(gòu)提供未知樣本驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)指標(biāo)正確率精密度準(zhǔn)確度及時(shí)性第十一章：結(jié)果解釋與報(bào)告1檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生原始結(jié)果記錄質(zhì)量核查技術(shù)復(fù)核與質(zhì)控評(píng)估臨床解讀結(jié)合患者情況綜合分析報(bào)告發(fā)布規(guī)范化報(bào)告?zhèn)鬟_(dá)信息結(jié)果判讀原則定性結(jié)果陽(yáng)性/陰性判斷考慮檢測(cè)限制假陽(yáng)性/假陰性可能定量結(jié)果病原體載量判斷臨床意義分析動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)變化耐藥性結(jié)果敏感S/中介I/耐藥R臨界值判斷耐藥基因分析報(bào)告格式與內(nèi)容1患者信息姓名、年齡、性別、ID2樣本信息類(lèi)型、采集時(shí)間、狀態(tài)3檢測(cè)結(jié)果病原體、量級(jí)、耐藥情況4解釋與建議臨床參考價(jià)值和注意事項(xiàng)臨床意義解讀與臨床癥狀結(jié)合檢測(cè)結(jié)果必須結(jié)合臨床癥狀陽(yáng)性不等于致病污染與定植鑒別污染：標(biāo)本采集過(guò)程帶入定植：無(wú)癥狀攜帶感染：引起臨床癥狀多重檢出分析判斷優(yōu)勢(shì)菌考慮混合感染可能第十二章：新技