核酸分子雜交技術第一節(jié)

核酸分子雜交的基本原理原理：堿基互補配對原則

一、核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)

來源不同的兩條單鏈核酸分子通過堿基互補形成異源雙螺旋分子，稱為核酸分子雜交。雜交可分成：DNA/DNA、RNA/RNA、DNA/RNA之間的雜交。復性RNADNA待測核酸序列探針(probe)：已知核酸序列二、DNA的變性(denaturation)

定義：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。方法：過量酸、堿、加熱、變性試劑如尿素、甲酰胺以及某些有機溶劑如乙醇、丙酮等。

變性后其它理化性質變化：OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸堿滴定曲線改變 生物活性喪失DNA變性的本質是雙鏈間氫鍵的斷裂

例：變性引起紫外吸收值的改變DNA的紫外吸收光譜增色效應：DNA變性時其溶液OD260增高的現(xiàn)象。熱變性解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對A260值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。目錄Tm：變性是在一個相當窄的溫度范圍內完成，在這一范圍內，雙鏈DNA變性一半所需要的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱熔解溫度(meltingtemperature,Tm)。其大小與G+C含量成正比。Tm=（G+C）%×0.41+69.3三、DNA的復性DNA復性(renaturation)的定義

在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可恢復天然的雙螺旋構象，這一現(xiàn)象稱為復性。

熱變性的DNA經緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為退火(annealing)。減色效應DNA復性時，其溶液OD260降低。DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復性不同來源的DNA分子復性的速度受到諸多因素的影響：1.核酸分子的濃度：一般適宜的探針濃度為0.1～0.5μg。2.核酸分子的長度：核酸探針的長度控制在50～300bp3.溫度：適宜的復性溫度是較Tm值低25℃。4.離子強度：離子強度過低，不利于復性。5.核酸分子的復雜性。第二節(jié)

核酸分子雜交的基本方法核酸分子雜交的類別（一）DNA印跡技術(Southernblotting)

用于基因組DNA的定性定量分析、酶切圖譜分析、基因突變分析及限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）等。（二）RNA印跡技術(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。

蛋白質的印跡分析(Westernblotting)

用于蛋白質定性定量及相互作用研究。其他斑點印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)（一）Southern印跡雜交

DNA印跡E.Southern 1975年方法1.酶解DNA限制性內切酶（RestrictionEnzyme,RE）限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）在人類基因組中，平均約200對堿基可發(fā)生一對變異（稱為中性突變），中性突變導致個體間核苷酸序列的差異，稱為DNA多態(tài)性。不少DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內切酶識別位點上，酶切水解該DNA片段就會產生長度不同的片段，稱為限制性片段長度多態(tài)性。2.分離電泳

在電場中帶電粒子向帶符號相反的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）。

＋－=－＋－3.凝膠中核酸的變性堿變性中和處理4.轉膜硝酸纖維素膜尼龍膜轉膜方法毛細管虹吸印跡法電轉印法真空轉移法毛細管虹吸印跡法

電轉印法

真空轉移法5.雜交預雜交：封閉非特異性DNA位點。雜交6.雜交結果的檢測放射自顯影照片Southern印跡的應用基因診斷法醫(yī)學

DNA的多態(tài)性。微衛(wèi)星DNA和小衛(wèi)星DNA等是重要的多態(tài)性標志。單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)

DNA指紋（DNAfinger-print）分析的基本流程如下：DNA的提純與純化→限制性內切酶消化→電泳分離→分子雜交→指紋圖的顯示假設一對夫妻，生了一男一女，又領養(yǎng)了一個女孩，妻子還帶來與其前夫所生的女兒。這一家人的DNA指紋如圖所示。由此可推斷出：A和C是親生兒女；B為妻子和其前夫所生；D為養(yǎng)女

（二）Northernblot和Southernblot不同在于：A：靶核酸是RNA；B：RNA電泳時，凝膠中加入變性劑，防止

RNA分子形成二級結構；C：電泳結束后直接轉膜。一、原理三種印跡技術的比較

(三）原位雜交(insituhybridization)

原位雜交是將分子雜交與組織化學相結合的一種技術。它是利用標記的已知核酸探針，在組織、細胞及染色體上檢測特異的DNA或RNA序列的核酸雜交技術。主要過程：⑴制備標記的核酸探針:

長度一般為50～300bp。⑵標本的制作與處理:

注意防止核酸丟失、保持形態(tài)結構、保證探針穿透到達靶區(qū)。⑶原位雜交:DNA探針雜交可在2-4小時內完成，而RNA探針雜交則應過夜。⑷雜交信號的顯示和結果分析。

熒光原位雜交圖

（四）溶液雜交(Solutionhybridization)核酸酶S1保護分析法(nucleaseS1protectionassay)RNA酶保護分析法(RNaseProtectionAssay，RPA)1.核酸酶S1

保護分析法合成單鏈DNA探針與RNA樣品進行雜交DNA/RNA核酸酶S1降解DNA和RNA單鏈放射自顯影2.RNA酶保護分析法制備標記RNA探針RNA/RNA與待測RNA雜交RNaseT1和RNaseA降解單鏈RNA電泳第三節(jié)探針

探針(probe)

一小段用同位素、生物素或熒光染料等標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。一、核酸探針的來源

基因組DNA探針

cDNA探針

RNA探針寡核苷酸探針組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉化菌限制性內切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*基因組DNA文庫目錄mRNAcDNA

雙鏈cDNA

重組DNA分子cDNA文庫逆轉錄酶載體受體菌復制*cDNA文庫逆轉錄酶AAAA

TTTT

AAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄二、核酸探針的標記物?①高度靈敏性；②標記物與核酸探針結合，應絕對不能影響核酸探針與模板的結合能力及結合的特異性；③當用酶促方法進行標記時，應對酶促活性（Km值）無多大影響，以保證標記反應的效率和標記產物的比活性；④高度特異性；⑤較高的化學穩(wěn)定性，保存時間長，標記及檢測方法簡單；⑥對環(huán)境無污染，對人體無損傷；⑦價格低廉等。常用的探針標記物：放射性同位素：

3H、32P、35S、125I等。非放射性同位素：熒光、地高辛素、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶等。放射性核素標記物（靈敏度極高）①32P：釋放β-粒子,能量高,穿透力極強。②35S：35S的放射性亦較強，但β-粒子能量較低，因此其檢測靈敏度較32P稍低。③3H：適用于細胞原位雜交。④125I和131I：碘放射性同位素在70年代曾被廣泛應用于核酸探針的標記。非放射性標記物無放射性污染，穩(wěn)定性好①半抗原：生物素、地高辛②配體：生物素③熒光素：④化學發(fā)光物質，可以像放射性核素一樣直接對X光膠