植物生物技術(shù)講稿

張獻龍

說明：植物生物技術(shù)有兩個課形：面向植物科學(xué)技術(shù)專業(yè)的理論課授課為50學(xué)時，面向其它專業(yè)的

理論課授課為40學(xué)時。本講稿按50學(xué)時編寫，講授40學(xué)時課形時，根據(jù)教學(xué)大綱取舍。

2005年元月

緒論

學(xué)時分配：1學(xué)時

教學(xué)目的：介紹生物技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展，植物生物技術(shù)與農(nóng)業(yè)革命，植物

生物技術(shù)在未來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中所起的作用。以事實引起學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣。

一、植物生產(chǎn)的幾次重要革命

?綠色革命：20世紀50-60年代以高稈改變?yōu)榘挒闃酥镜膬?yōu)質(zhì)、高

產(chǎn)“墨西哥小麥”的矮稈化和矮稈水稻良種的全面推廣、使全世界糧食

產(chǎn)量躍上了一個新的臺階。為什么矮桿可以大幅度提高產(chǎn)量？（耐

肥，抗倒，增加密度等）

?雜種優(yōu)勢利用：70年代初，我國雜交水稻的培育成功，并大面積應(yīng)用

于生產(chǎn)，使水稻單產(chǎn)增長20%-30%,創(chuàng)造了農(nóng)業(yè)奇跡。（三系、兩系、

一系，資源挖掘）

?生物技術(shù)的應(yīng)用（基因革命時代的到來）：20世紀80年代初轉(zhuǎn)基因

作物投入生產(chǎn)標志著生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的成功應(yīng)用。

二、生物技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展

,生物技術(shù)的概念：生物技術(shù)（biotechnology）,有時也稱生物工程

（bioengineering）,以現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)成果為基礎(chǔ)設(shè)計、改造生物

體，生產(chǎn)人類需要的產(chǎn)品。

基因工程Geneticengineering

細胞工程Cellengineering

生物技術(shù)酶工程Enzymeengineering

發(fā)酵工程Fermentation

蛋白質(zhì)工程Protein

?生物技術(shù)的產(chǎn)生：

1953DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)；60年代遺傳密碼的全部破譯；1972重

組DNA技術(shù)的建立(生物技術(shù)學(xué)科產(chǎn)生的關(guān)鍵技術(shù))

介紹重組DNA技術(shù)在現(xiàn)代遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物技術(shù)研究

中的意義。

三、轉(zhuǎn)基因作物在全球的應(yīng)用狀況

1.全球轉(zhuǎn)基因作物的面積分布

2.發(fā)達國家與發(fā)展中國家的比較

3.不同作物的應(yīng)用概況

四、植物生物技術(shù)與應(yīng)用

?概念：植物生物技術(shù)(PlantBiotechnology)是指對植物品質(zhì)和性狀

進行改造的生物技術(shù)。

植物生物技術(shù)包括:

植物組織培養(yǎng)(或細胞工程)PlantTissueCulture

基因克隆與轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)GeneCloningandGenetically

ModifiedCrops(GMcrops)

分子標記及輔助育種應(yīng)用MolecularmarkersandMAS

?植物生物技術(shù)發(fā)展趨勢：從“投入特征”的作物向“產(chǎn)出特征”的作物轉(zhuǎn)

變

?植物生物技術(shù)的農(nóng)業(yè)應(yīng)用：創(chuàng)造新材料；培育新品種；開發(fā)功能食品;

快速繁殖稀有材料；材料的指紋分析、新基因挖掘、定位、輔助育種

等

五、植物生物技術(shù)與傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)技術(shù)的關(guān)系

?傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中仍將發(fā)揮主導(dǎo)作用，不可用生物技術(shù)全面

替代。如新品種選育。

?生物技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)結(jié)合可以加速研究進程

?生物技術(shù)可以大幅度提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值

?生物技術(shù)產(chǎn)品的出現(xiàn)使大批農(nóng)業(yè)公司被生物技術(shù)公司替代，使農(nóng)業(yè)經(jīng)

營領(lǐng)域發(fā)生變革

思考題：

生物技術(shù)的概念及其涵蓋的內(nèi)容；植物生物技術(shù)包括那幾個方面；生物技

術(shù)與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的關(guān)系。

參考書：

?植物細胞組織培養(yǎng)，劉慶昌主編，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003

?作物DNA標記輔助育種，方宣鈞主編，科學(xué)出版社，2001

?植物基因工程原理與技術(shù)，王關(guān)林主編，最新版？，科學(xué)出版社

?農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報；科學(xué)通報；中國科學(xué)C；植物學(xué)報；遺傳學(xué)報；

植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報；實驗生物學(xué)報；生命科學(xué)研究；科學(xué)導(dǎo)

報

,TrendsinBiotechnology；TrendsinPlantScience；Trensgenic

Research；PlantCell,TissueandOrganCulture；PlantScience；In

vitroCellular&DevelopmentalBiology;TAG;PlantBreeding；

Euphytica

第一章植物組織培養(yǎng)的原理與方法

學(xué)時分配：5學(xué)時

教學(xué)目的：通過該章教學(xué)，讓學(xué)生掌握植物組織培養(yǎng)所涉及的基本概念；

培養(yǎng)基的組成、特點和用途；植物組織培養(yǎng)實驗室建設(shè)；無菌操作的原理

與技術(shù)等。學(xué)習(xí)后，應(yīng)能獨立設(shè)計組織培養(yǎng)實驗室，能夠進行無菌操作，

能夠獨立配制培養(yǎng)基。

第一節(jié)植物組織培養(yǎng)實驗室建設(shè)

一、植物組織培養(yǎng)實驗室的設(shè)置

標準的植物組織培養(yǎng)實驗室必須具備下列必需的設(shè)施：（1）清洗

和貯存玻璃器皿、塑料器皿和其它實驗器皿；（2）培養(yǎng)基的配制、滅菌和

貯存；（3）植物材料的無菌操作；（4）可控溫度、光照、濕度的條件，以

便對材料進行體外培養(yǎng)；（5）培養(yǎng)物生長發(fā)育過程的顯微觀察

1、洗滌室：主要用于清洗各種器皿、培養(yǎng)瓶（皿）的烘干，需要與洗滌有

關(guān)的各種小工具、涼干架、烘箱等。滅菌設(shè)備可以安裝在該室。

2、培養(yǎng)基室：各種藥品、母液的儲存，培養(yǎng)基的配制與分裝。需要試劑瓶、

pH計、冰箱、天平、微波爐、水浴鍋等。

3、接種室：用于植物材料的無菌操作。接種室為密閉式，用紫外線燈進行

空氣消毒。接種室的主要儀器設(shè)備是超凈工作臺和操作臺（用于放置培養(yǎng)

基）。

4、培養(yǎng)室：培養(yǎng)室是存放接種有植物材料的培養(yǎng)瓶的地方。培養(yǎng)室的溫度

必須是可控的，一般是用空調(diào)或熱風(fēng)機使溫度保持在25±2℃。植物組織培

養(yǎng)要求一定的光照，采用日光燈源，一般光照強度為1000~40001uxo培養(yǎng)

室的濕度應(yīng)控制在相對濕度80%左右，當培養(yǎng)室的相對濕度降到50%以下

時，應(yīng)采取措施增加濕度，以免培養(yǎng)基變干。在培養(yǎng)室內(nèi)應(yīng)設(shè)有若干培養(yǎng)

架以放置培養(yǎng)物。培養(yǎng)架大小一般為1200mmX600mmX400mm0培養(yǎng)室

的主要設(shè)備是培養(yǎng)架、控溫控光系統(tǒng)、搖床等。

二、植物組織培養(yǎng)實驗室的主要儀器設(shè)備

（一）洗滌設(shè)備

一般應(yīng)有一個洗滌室，專供洗滌及洗凈培養(yǎng)瓶的儲藏.

（二）滅菌設(shè)備

廠一高溫高壓滅菌

廠物理滅菌干熱滅菌

I射線照射滅菌

1.滅菌種類yJ過濾滅菌

「熏蒸滅菌

J化學(xué)滅菌Y

I消毒液滅菌

2.滅菌方法

（1）高溫高壓滅菌

原理：將待滅菌的物品放在一個密封的高壓高溫滅菌鍋內(nèi)，在1210c高

壓和每平方厘米1個大氣壓下，一般持續(xù)15-20\就可殺死一切微生物的

營養(yǎng)體及其抱子，適于器皿、工具、衣物和培養(yǎng)基滅菌。

滅菌操作：

滅菌需要的時間與物品有關(guān)：

含有20-50ml培養(yǎng)基的試管或三角瓶，121°C,2(T

含有50-500ml培養(yǎng)基的三角瓶，121°C,25'

含有500-5000ml培養(yǎng)基的三角瓶，121°C,35，

空試管、瓶、濾紙等，121°C,3(T

高溫高壓滅菌后可能會出現(xiàn)如下問題，需要引起注意：

1.pH值下降0.3-0.5單位；2.太高溫度滅菌時會使糖焦化，可能會

產(chǎn)生毒性；3.滅菌時間太長會使鹽沉淀，同時使瓊脂解聚；4.揮發(fā)性物質(zhì)

不能高溫滅菌，否則會被破壞.

(2)過濾滅菌法

原理：將帶菌的液體或氣體通過孔徑小于0.45p微孔濾器裝置，使液、氣體

通過濾膜流入無孔瓶中。此法主要用于不能利用高溫高壓滅菌的培養(yǎng)基成

分

滅菌操作：

不能高溫高壓滅菌的物質(zhì)：

多糖Saccharose；Colchicine；Zeatin；GA（95%失活）；VB1>VB12>

Vc、泛酸；Antibiotics；Plantextracts；Enzymes

（3）化學(xué)滅菌法

主要用于植物材料的消毒，所用濃度、消毒時間因不同材料而定,

應(yīng)靈活運用并不斷總結(jié)經(jīng)驗。

（三）化學(xué)實驗設(shè)備

主要用于培養(yǎng)基的配制、分裝與滅菌，化學(xué)試劑的配制，蒸溜水

的生產(chǎn)，接種材料的準備、生化分析等

主要設(shè)備有：實驗臺、水槽、涼干架、冰箱、藥品柜、電爐或

微波爐、天平、攪拌器、離心機、蒸溜器、pH計、各種玻璃器皿（量筒、

燒杯、試劑瓶、移液管、容量瓶、三角瓶、培養(yǎng)皿、parafilm、滴管等）

（四）無菌操作設(shè)備

首先應(yīng)具備一個無菌操作室，保持清潔,裝有紫外燈。室內(nèi)設(shè)備：放

物臺、超凈工作臺、各種接種工具

（五）培養(yǎng)設(shè)備

廠自動控溫控光系統(tǒng)

廠培養(yǎng)室y培養(yǎng)架

L搖床

材料培養(yǎng)處-<

「調(diào)溫培養(yǎng)箱

J培養(yǎng)箱Y調(diào)溫調(diào)濕培養(yǎng)箱

一光照培養(yǎng)箱

（六）細胞學(xué)觀察設(shè)備

主要是顯微鏡系統(tǒng)，成像系統(tǒng)等。包括倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、

研究顯微鏡、體視顯微鏡、CCD、計算機等。

第二節(jié)培養(yǎng)基的配制

培養(yǎng)基：含有各種被培養(yǎng)生物材料生長所需要的營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基質(zhì)。

一、培養(yǎng)基的成分

培養(yǎng)基中包括植物生長必需的15種營養(yǎng)元素和某些生理活性物質(zhì)，可概括

為三大類：

（1）無機營養(yǎng)物

無機元素在植物生長發(fā)育中非常重要，鎂（Mg）是葉綠素分子的一部

分，鈣（Ca）是細胞壁的組分之一，氮（N）是各種氨基酸、維生素、蛋白

質(zhì)和核酸的重要組成部分。此外，鐵（Fe）、鋅（Zn）和鋁（Mo）等是某

些酶的組成部分。植物除了碳（C）、氫（H）和氧（O）外，已知還有12

種元素對于植物的生長是必需的，它們是氮（N）、磷（P）、硫（S）、鈣（Ca）、

鉀（K）、鎂（Mg）、鐵（Fe）、鎰（Mn）、銅（Cu）、鋅、硼（B）和鋁（A1）。

其中前6種元素需要的數(shù)量較大，因此稱之為大量元素或主要元素。后6

種元素需要的數(shù)量較小，因此稱為微量元素或次要元素。按照國際植物生

理協(xié)會的建議，植物所需要的濃度大于0.5mmol/L的元素為大量元素，小

于0.5mmol/L的元素為微量元素

（2）有機營養(yǎng)成分

主要包括碳源（糖類）和維生素類。

雖然大多數(shù)培養(yǎng)物都能合成所有必需的維生素，但合成能力有限,

其數(shù)量顯然不足。為了能使組織很好地生長，在培養(yǎng)基中常常必須補加幾

種維生素和氨基酸。其中硫胺素（維生素B1）一般認為是一種必需的成分。

在其它各種維生素中，已知毗哆醇（維生素B6）,煙酸（維生素B3）,泛酸

鈣（維生素B5）和肌醇也都能顯著地改善培養(yǎng)的植物組織生長狀況。為了

促進某些愈傷組織和器官的生長，有時還使用很多種化學(xué)成分不明的復(fù)雜

的營養(yǎng)混合物，如水解酪蛋白，椰子汁，玉米胚乳，麥芽浸出物，番茄汁

和酵母浸出物等。

最常用的碳源是蔗糖，使用濃度為2%?5%。碳源除了作為植物生

長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)以外，另一重要的功能是調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的滲透壓。

（3）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

主要是細胞分裂素和生長素，有時也用GA3。

生長素：生長素影響到植物莖和節(jié)間的伸長、向性、頂端優(yōu)勢、葉片脫落

和生根等現(xiàn)象。在離體植物組織培養(yǎng)中，生長素被用于誘導(dǎo)細胞分裂和根

的分化。在植物組織培養(yǎng)中常用的生長素有：IAA（口引噪乙酸）、IBA（口引

口朵丁酸）、NAA（蔡乙酸）、NOA（蔡氧乙酸）、P—CPA（對氯苯氧乙酸）、

2,4-D（二氯苯氧乙酸）和2,4,5-T（三氯苯氧乙酸）。其中IBA和NAA

廣泛用于生根，并能與細胞分裂素互作促進莖的增殖。2,4-D和2,4,5-T

對于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長非常有效。生長素一般溶于95%酒精或O.lmol/L

的NaOH中，后者的溶解效果更好。

細胞分裂素：細胞分裂素影響植物細胞分裂、頂端優(yōu)勢的變化和莖的分化

等。培養(yǎng)基中加入細胞分裂素，主要是為促進細胞分裂和由愈傷組織形成

器官，分化不定芽。比較常用的細胞分裂素有：BAP（若氨基喋吟）、—BA

（苦基腺膘吟）、2—ip（異戊烯氨基喋吟）、KT（激動素，吠喃氨基喋吟）

和ZT（玉米素）。細胞分裂素一般溶于0.5或lmol/L的HC1或NaOH中。

二、培養(yǎng)基的種類和特點

目前發(fā)展出的培養(yǎng)基有幾十種，但常用的有MS、B5、white、N6、KM8P、

SH等。

MS的無機鹽和離子濃度較高，養(yǎng)分平衡，是目前使用最多的培養(yǎng)

基

B5的主要特點是含有較低的錢，這個成分可能對很多培養(yǎng)物的生

長有抑制作用

white的特點是無機鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)

KM8P主要用于原生質(zhì)體培養(yǎng)，其特點是有機成分較復(fù)雜，它包括

了所有的單糖和維生素，呼吸代謝中的主要有機酸。

N6主要用于花藥培養(yǎng)，其特點是成分簡單，且KNO3和（NH4）

2SO4含量高。

三、培養(yǎng)基的配制

1.母液的配制

配制母液有兩個好處：可減少每次配制稱量藥品的麻煩；減少極微

量藥品在每次稱量時造成的誤差，一般需準備四種母液:

A）大量元素母液:

可配成10倍母液，用時每配1000ml培養(yǎng)基取100ml母液。配制母液

時應(yīng)注意：分別稱量；充分溶解；注意混合秩序：Ca++應(yīng)最后加入，與SO42-

和HPO42-錯開，以免產(chǎn)生沉淀；混合時要緩慢，邊攪拌邊混合。

B）微量元素母液

因含量低，一般配成100倍甚至1000倍，每配1000ml培養(yǎng)基取

10ml或1ml,注意的原則同大量元素。

C）鐵鹽母液

必須單獨配制，若與其它元素混合易造成沉淀。一般采用螯合鐵，

即硫酸亞鐵與EDTA鈉鹽的混合物。一般擴大200倍，每配1000ml培養(yǎng)基

取5ml,EDTA鈉鹽需用溫水溶解，然后與FeSO4液混合，在75-800C之

間讓其螯合1小時，使用螯合鐵的目的：避免沉淀；緩慢不斷地供應(yīng)鐵。

D）有機化合物母液

主要是維生素和氨基酸類物質(zhì)，這類物質(zhì)不能配成混合母液，一定

要分別配成單獨的母液，濃度為每毫升含使用時根據(jù)需要量取。

E）激素

每種激素必須單獨配成母液，其濃度為0.1,0.5或多數(shù)

激素難溶于水，配法如下：

IAA、IBA、GA3先溶于少量酒精，再加水定溶至一定刻度

NAA可溶于熱水或少量酒精中，再加水定溶至一定刻度

2,4-D不溶于水，可用1mol的NaOH溶解后再定溶

KT和BA先溶于少量1molHC1中，再加水定溶

玉米素先溶于少量95%酒精中，再加水定溶。

2.培養(yǎng)基的配制

-稱出規(guī)定數(shù)量的瓊脂和蔗糖，加水直到培養(yǎng)基最終容積的3/4,

在恒溫水浴中加熱使之溶解。在配制液體培養(yǎng)基時則無須加熱，

因為蔗糖甚至在微溫的水中也可以溶解。

-分別按配方逐個加入各種貯備液，包括生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他的特

殊補加物。

-加蒸鐳水直至培養(yǎng)基的最終容積。

-充分混合之后，用O.lmol/LNaOH和O.lmol/LHCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的

pHo一般來說，植物組織培養(yǎng)適合的pH值為5.8,當pH高于6

時，培養(yǎng)基將會變硬，低于5時;瓊脂就不能很好地凝固。

-把培養(yǎng)基分裝到所選用的培養(yǎng)容器中，每個25義150mm的試管

約裝培養(yǎng)基15ml；每個150ml三角瓶約裝50ml。

-封口

-滅菌

-對于不能用高壓滅菌的藥品來講，經(jīng)過濾滅菌后的藥液等到高壓

滅菌的培養(yǎng)基冷卻到大約60℃時一，在超凈工作臺加入到培養(yǎng)基

中，搖勻。

第三節(jié)離體無菌操作技術(shù)

一、植物材料的消毒

接種前必須使材料完全無菌，這是取得植物組織培養(yǎng)成功的根本保

證。取材應(yīng)注意的事項：

1.從健壯株上取材，不要有傷口

2.嚴格防治病蟲

3.要在晴天取，最好中午或下午取材,不要在雨天、陰天或露水未干十取材料

4.最好避開選用田間材料，選用無菌苗

5.若非要用田間材料，最好將材料種在大棚里（無雨水的地方）或生長箱里.

一些常用的植物材料消毒劑有:HgCl2,次氯酸鈉等。

對于難消毒的材料,如有茸毛的、粗糙不平的、地下部的等，在消毒前，一

般先用肥皂水洗凈，自來水沖凈，再在70%酒精或1N鹽酸中浸30,再進入

消毒劑，消毒劑中可加數(shù)滴吐溫20,以增強消毒劑的效果。

二、無菌操作

開始操作前要用70%酒精消毒手和前臂。為保證做到無菌操作,

除實驗中所用物品需事先消毒外，在實驗中還要保持無菌操作。因此在進

行實驗前，要點燃酒精燈，一切操作如安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，

都應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。但要注意，金屬器械不能在火焰中長時

間燒灼，以防退火。燒灼過的器械要冷卻后才能使用工作臺面上的用品要

放置有序、布局合理。酒精燈在當中，右手使用的物品在右側(cè)，左手用品

在左側(cè)。工作忌忙亂而要有序；組織、細胞及培養(yǎng)板在未做處理和使用前,

不要過早暴露于空氣中，應(yīng)分別使用不同吸管吸取營養(yǎng)液、細胞懸液及其

它各種用液，不能混用。用吸管、注射器進行轉(zhuǎn)移液體操作時，吸管、注

射器針頭、不能觸及瓶口以防止細菌污染或細胞的交叉污染。

三、無菌培養(yǎng)

材料接種后應(yīng)移入培養(yǎng)室培養(yǎng)，一般培養(yǎng)室要求非常衛(wèi)生、恒溫，

有理想的光照控溫系統(tǒng),一般材料要求250C左右，晚上一般不應(yīng)低于200Co

第四節(jié)組織培養(yǎng)術(shù)語

?愈傷組織(Callus,Calli,Calluses)：愿意指植物在受傷之后于傷口

表面形成的一團薄壁細胞，在組織培養(yǎng)中指在人工培養(yǎng)基上由外植體

長出來的一團無序生長的薄壁細胞。

?外植體(Explant)：由活植物體上切取下來以進行培養(yǎng)的那部分組織

或器官

,脫分化(dedifferentiation)：—1V成熟細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)的過程

?全能性(Totipotency)：具有完整細胞核的植物細胞所擁有的形成完

整植株的潛在能力

?再分化(Redifferentiation)：脫分化的細胞在形成植物器官或植株的

過程

?克隆(Clone)：在植物細胞培養(yǎng)中，克隆指單一細胞有絲分裂形成的

細胞群體，也指通過無性繁殖而形成的植株群體。

,誘導(dǎo)(Induction)：體外培養(yǎng)植物材料時，細胞分裂的啟動及結(jié)構(gòu)、

器官等的誘發(fā)

?體細胞克隆：由單一體細胞形成的細胞群體

?配子細胞克隆：由單一配子細胞形成的細胞群體

-滅菌與消毒：滅菌(Sterilization)指消除實驗設(shè)備或材料上的所有微

生物；消毒(Disinfection)：僅指消除可能造成污染或侵染的有機體。

思考題：

1.掌握本章講述的概念和名詞，要求理解并記憶

2.如何理解植物細胞的全能性？

3.滅菌的方法包括哪兩類，每類包括寫什么方法，基本原理是什么？

4.哪些物質(zhì)不能該溫高壓滅菌？

5.常用的培養(yǎng)基有哪幾種，每種培養(yǎng)基的特點？

6.培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分分為哪兒大類？大量元素和微量元素是如何劃分

的，其中大量元素包括哪集中？各種激素的溶解方法？

7.為什么要配制培養(yǎng)基的母液？配制母液時應(yīng)注意那些事項？為什么

鐵鹽使用螯合鐵？

8.為了保證消毒徹底，從自然條件下取外植體時應(yīng)注意什么問題？

第二章胚胎培養(yǎng)

學(xué)時分配：2學(xué)時

教學(xué)目的：要求掌握胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)和胚乳培養(yǎng)的意義，尤其是在育種

工作中的實用價值。

胚培養(yǎng)的概念：植物胚胎培養(yǎng)是指使胚及具胚器官（如子房、胚珠）在離

體無菌培養(yǎng)條件下發(fā)育成幼苗的技術(shù)。

胚是遺傳物質(zhì)從上代向下代傳遞的重要載體，在種植業(yè)生產(chǎn)中具有重要意

義。

第一節(jié)胚培養(yǎng)

一、胚培養(yǎng)的意義

1、克服遠緣雜交不親和性和雜種不育性，獲得種間或?qū)匍g雜種

植物胚培養(yǎng)的最大用途是用以獲得種間或?qū)匍g雜種。在很多種

間和屬間雜交中，受精作用能正常完成，胚也能進行早期的發(fā)育，但由

于胚乳發(fā)育不良，雜種胚最終將會夭折，因而不能形成有發(fā)芽能力的種

子。在這類難以成功的雜交中，雜種胚常常具有正常生長的潛力，若把

雜種胚夭折以前置于某種合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，則能獲得雜種植株。

2.研究合子胚的胚胎發(fā)育

離體培養(yǎng)的胚胎發(fā)育主要與三個因素有關(guān):接種時胚體的大小,

培養(yǎng)基的成分，接種前在胚珠中停留的長短。如果接種的是球形胚，就

會形成很多不正常胚，因為胚越小，對培養(yǎng)基的成分越敏感；如果接種

的是心形或心形期以后的胚，胚的發(fā)育與體內(nèi)發(fā)育相似。

3.克服種子休眠，提早結(jié)實

植物休眠從幾天到幾年不等。某些園藝植物如落葉樹的育種和

繁育工作因種子休眠期太長而受到影響。休眠的種子在給于合適的溫

度、氧氣和濕度條件也不能萌發(fā)，而應(yīng)用胚培養(yǎng)常?？梢钥朔@一類種

子發(fā)育上的障礙，促進胚的生長發(fā)育。通過胚的離體培養(yǎng)，可使休眠期

縮短。

蘋果屬的一些品種，種子播種后在土壤中需幾個月才能萌發(fā)，離

體培養(yǎng)的胚卻能在48h萌發(fā)，4周內(nèi)形成移植幼苗，5個月的幼苗長達

1m高。

4.獲得單倍體植株

單倍體的產(chǎn)生方法很多，通過遠緣雜交，結(jié)合胚培養(yǎng)技術(shù)是獲得單

倍體的有效方法之一。栽培大麥與球莖大麥進行雜交，受精作用幾乎完

全正常，但由于二者的細胞分裂周期不同，合子胚在經(jīng)過幾次有絲分裂

以后，球莖大麥的染色體被淘汰，子細胞中只留下大麥的染色體，為大

麥單倍體。

5.縮短育種周期，提高育種效率

在育種實踐中，為了加快育種進程，可采用離體胚培養(yǎng)的方法。

例如薔薇屬植物的栽培品種常需1年才能開花。從離體培養(yǎng)胚獲得的幼

苗只需2?3個月即可開花，而利用這種花作父本，1年內(nèi)可產(chǎn)生2個世

代，大大地提高育種進程。

6.稀有植物的繁殖(使種子無生活力或胚發(fā)育不全的植物獲得后代)

許多落葉果樹的種子是早熟的，種子往往不育。用胚胎培養(yǎng)可以將不

能正常萌發(fā)的種子培養(yǎng)出第二代植物。

蘭花、天麻的種子成熟時，胚只有6?7個細胞，多數(shù)胚不能成活。

如在種子接近成熟時一，把胚分離出來進行培養(yǎng)，就能生長發(fā)育成正常植株。

椰子(Cocosnucifera)的胚乳是液體的，為液體胚乳。有一種變

異類型，它們的椰子不能形成液體胚乳，取而代之的是一種柔軟肥厚的組織。

這些果實被稱做“Makapuno”。因這種變異類型的種子不能繁殖，故

“Makapuno”十分稀罕，價格非常昂貴，在菲律賓只有盛大宴會才供應(yīng)這種果

實。應(yīng)用離體胚培養(yǎng)技術(shù)，將“Makapuno”的種胚進行離體胚培養(yǎng)已成功地由

“Makapuno”種子獲得了植株，且85%后代所結(jié)的果實均是“Mak叩uno"。

二、胚培養(yǎng)技術(shù)

1.自然條件下胚的發(fā)育

2.離體培養(yǎng)條件下胚的發(fā)育

3.胚培養(yǎng)操作技術(shù)

三、胚培養(yǎng)的影響因素

1、胚齡

一般說來，胚齡大小與成活率成正相關(guān)。

離體胚培養(yǎng)時，胚的發(fā)育有以下幾種可能性途徑：（1）胚胎發(fā)育

途徑：幼胚經(jīng)過心形期，再發(fā)育到魚雷形期，進而進入子葉期，最后萌發(fā)

成苗。這是幼胚培養(yǎng)成功的途徑。（2）早熟萌發(fā)途徑：幼胚從心形期發(fā)育

到魚雷形期后，不經(jīng)過子葉期直接發(fā)育成苗，即跳過某一個發(fā)育階段，這

樣的幼苗往往很弱小，組織不健全，且難于培養(yǎng)成正常的植株。（3）產(chǎn)生

愈傷組織：幼胚培養(yǎng)過程中細胞脫分化產(chǎn)生愈傷組織。通過幼胚培養(yǎng)產(chǎn)生

的愈傷組織，經(jīng)植株再生同樣可得到遠緣雜種。據(jù)報道，由胚培養(yǎng)產(chǎn)生的

愈傷組織較其它外植體容易得到再生植株。（4）停止生長或幼胚死亡。非

常小的幼胚進行培養(yǎng)時，接種后常遇到細胞生長停滯，如不采取一些拯救

措施，幼胚細胞即死亡。

2、培養(yǎng)基

成熟胚培養(yǎng)只要求含有無機營養(yǎng)元素、幾種維生素和少量激素

的基本培養(yǎng)。而未成熟胚一般不能在這類簡單培養(yǎng)基上生長，它們比成熟

胚對營養(yǎng)的要求更為復(fù)雜，除了無機和有機營養(yǎng)、維生素、氨基酸、激素

外，胚乳的看護對于幼胚培養(yǎng)十分重要。

3、培養(yǎng)條件

溫度：大多數(shù)植物的離體胚培養(yǎng)溫度為25℃?30℃。不同的植物類型對其溫

度要求也不相同。起源于低緯度地區(qū)的喜溫植物要求較高的溫度，而起源

于高緯度地區(qū)的耐低溫植物所需的溫度相對較低。

光照：光對于某些植物胚胎的生長并不很重要，但對某些植物胚卻有很大

影響。主要表現(xiàn)在光能抑制未成熟胚的早熟萌發(fā)。

第二節(jié)胚珠培養(yǎng)

一、胚珠培養(yǎng)的用途

-成熟胚很小時，胚培養(yǎng)難以成功，采用胚珠培養(yǎng)較易成功。

Maheshwari將授粉5天的罌粟(Papaversomnierurn)胚珠進行離體培

養(yǎng)，得到種子。罌粟授粉5天的胚珠僅為合子胚或只有2個細胞的原

月丕。

?對未受精的胚珠進行培養(yǎng)可誘發(fā)大泡子發(fā)育成單倍體植物。

?在棉花種間雜交中，通過胚珠培養(yǎng)可以防止由于棉鈴脫落

喪失雜種胚。

?研究棉花的纖維發(fā)育

二、培養(yǎng)方法

取回花蕾，去除苞葉、萼片，將子房消毒，無菌狀態(tài)下取出胚珠，接

種于培養(yǎng)基中。

三、影響胚珠培養(yǎng)成功的因素

r------培養(yǎng)基的基本組成

(1)培養(yǎng)條件一"激素

——有機成分

(2)胚的發(fā)育時期

(3)胎座和子房

第三節(jié)胚乳培養(yǎng)

一、胚乳培養(yǎng)的意義

?自然條件下，胚乳細胞以淀粉、蛋白質(zhì)和脂類的形式貯存著大量的營

養(yǎng)物質(zhì)，以供胚胎發(fā)育和種子萌發(fā)之需。因此，胚乳是研究這些天然

產(chǎn)物代謝過程的一個理想系統(tǒng)。

?胚乳培養(yǎng)作為通過三倍體而獲得產(chǎn)生無籽果實植株的一種手段，倍受

國內(nèi)外果樹育種家重視。

?三倍體在植物產(chǎn)量與品種改良中具有十分重要的意義。有些具有重要

經(jīng)濟價值的植物，蘋果、香蕉，桑樹、甜菜、茶和西瓜等其三倍體已

在生產(chǎn)中得到了利用，并顯示出較好的經(jīng)濟效益

?三倍體植株加倍可產(chǎn)生同源六倍體。同源六倍體在植物育種上具有重

要的價值。

二、影響胚乳培養(yǎng)的因素

1.胚乳發(fā)育時期

2.基本培養(yǎng)基

3.外源激素

4.胚因子的作用

5.培養(yǎng)條件

思考題：

1.進行胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)各有什么意義或用途？

2.胚在離體培養(yǎng)條件有有幾種發(fā)育途徑？

第三章愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代和培養(yǎng)

教學(xué)時數(shù)：5學(xué)時

教學(xué)目的：要求掌握愈傷組織誘導(dǎo)、繼代、培養(yǎng)與分化的基本術(shù)語和概念;

掌握器官發(fā)生與體細胞胚胎發(fā)生的區(qū)別與聯(lián)系；掌握促進細胞分化的方法

手段。體細胞再生植株技術(shù)的理論與應(yīng)用價值。

植物細胞全能性(totipotency)：植物體細胞或性細胞，在人為控制的培養(yǎng)條

件下都具有再生成新個體的潛能，因而在適宜的條件下可以被誘導(dǎo)生長分

化形成完整植株。

脫分化(dedifferentiation)：使已分化的體細胞回復(fù)到未分化的原始狀態(tài)并

具有細胞全能性表達潛力的過程。

再分化(rediflferentiation)：處于脫分化狀態(tài)的愈傷組織再度分化成類型的

細胞、組織、器官，甚至最終再生成完整的植株過程。

第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)

一、愈傷組織的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

1.外植體的選擇

選擇外植體要綜合考慮以下幾個因素：①大小要適宜，不宜太小。外植

體的組織塊要達到2萬個細胞(5-10mg)以上才容易成活；②同一植物不

同部位的外植體，其細胞的分化能力、分化條件及分化類型有相當大的差

別；③植物胚與幼齡組織器官比老化組織、器官更容易去分化，產(chǎn)生大量

的愈傷組織；④不同物種相同部位的外植體其分化能力可能大不一樣。總

之，外植體的選擇一般以幼嫩的組織或器官為宜。用于培養(yǎng)的外植體包括

根、莖、葉、果實、子房、花粉、花瓣等各種器官或組織。

2.外植體材料的準備與消毒

外植體的消毒一般采用次氯酸鈉（市面上售的一般為10-14%有效氯），使

用時按1:10稀釋，消毒時間以材料定，消毒后無菌水沖洗4-5次；或用0.1%升

汞消毒。

如果沒有特殊的條件要求，在無菌條件下發(fā)芽種子能產(chǎn)生無菌的根、莖、

葉（無菌苗），較適于誘導(dǎo)愈傷組織。種子是誘導(dǎo)愈傷組織的很好的起始材料,

因為：①可將整粒種子放在加有生長物質(zhì)的培養(yǎng)基上使其直接產(chǎn)生愈傷組

織；②在無激素的培養(yǎng)基上發(fā)芽，可產(chǎn)生無菌的根、莖、葉用作外植體；

③可直接從種子上剪下根原基及芽尖用作外植體。

3.愈傷組織誘導(dǎo)

愈傷組織的誘導(dǎo)采用的培養(yǎng)基的基本成分相似，但對于不同植物，同

一植物不同物種都要對培養(yǎng)成分作相應(yīng)改動，尤其是激素的成分和濃度是

極為重要的因素。生長調(diào)節(jié)物質(zhì)之中，特別是生長素，對于細胞分裂的誘

導(dǎo)以及在其后的生長和增殖，都是必要的物質(zhì)。細胞分裂素未必是必需的

物質(zhì)，然而，常常因不同的供試材料而異。

從單個細胞或外植體上脫分化形成典型的愈傷組織，大致經(jīng)歷三個時期:

起動期、分裂期和形成期：

起動期，又稱為誘導(dǎo)期，是愈傷組織形成的起點。外植體已分化的活細胞在

外源激素的作用下，通過脫分化起動而進入分裂狀態(tài)，并開始形成愈傷組

織。這時在外觀上雖然未見明顯變化，但實際上細胞內(nèi)一些大分子代謝動

態(tài)已發(fā)生明顯的改變，細胞正積極為下一步分裂進行準備。

分裂期。外植體切口邊緣開始膨大，外層細胞通過一分為二的方式進行分

裂，從而形成一團具有分生組織狀態(tài)細胞的過程。這時組織細胞代謝十分

活躍，發(fā)生了一系列生理生化及形態(tài)的變化。

形成期。是指外植體的細胞經(jīng)過誘導(dǎo)、分裂形成了具有無序結(jié)構(gòu)的愈傷組

織時期。這個時期特征是細胞大小不再發(fā)生變化，愈傷組織表層的分裂逐

漸減慢和停止，接著內(nèi)部組織細胞開始分裂，細胞數(shù)目進一步增加。

二、愈傷組織的繼代培養(yǎng)

愈傷組織培養(yǎng)一段時間后必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上以保持培養(yǎng)物的繼

續(xù)正常生長，更換一次培養(yǎng)基稱一代繼代培養(yǎng)(subculture)。

為什么要進行繼代培養(yǎng)？

?經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)一段時間后，培養(yǎng)基里的養(yǎng)分耗盡

?培養(yǎng)基已干燥

?生長物已充滿培養(yǎng)瓶

?培養(yǎng)物需要擴繁

?瓊脂培養(yǎng)基褐化或發(fā)黑(因為植物組織在培養(yǎng)前幾周有時會產(chǎn)生毒

素物質(zhì)，這些物質(zhì)會擴散進入培養(yǎng)基)

?需要讓培養(yǎng)物在一種新的營養(yǎng)條件下生長

?培養(yǎng)基由于植物材料的原因使pH降低，導(dǎo)致培養(yǎng)基液化

一般情況下，培養(yǎng)的愈傷組織需要每4?6周繼代一次。第一次繼代培

養(yǎng)時用無菌刀片將新鮮愈傷切下，無菌地轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基上，被轉(zhuǎn)移的愈

傷小塊不宜過小，否則生長會受抑制。一旦愈傷建立起來，多數(shù)愈傷系需

要每月繼代一次。繼代時一般情況下不需改變原培養(yǎng)基的成分，但很多物

種需要將生長素降低些，尤其是使用2,4-D時。

第二節(jié)懸浮培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)(suspensionculture)：一般是把一些小塊生長旺盛的愈傷組織放入

液體培養(yǎng)基中，進行振蕩培養(yǎng)，從而使愈傷組織塊變成良好分散性的細胞

和小的細胞聚集體。愈傷組織通過懸浮培養(yǎng)能產(chǎn)生大量的比較均一的細胞,

而且細胞增殖速度快，適宜進行大規(guī)模細胞的培養(yǎng)。

一、懸浮培養(yǎng)的用途

?提供一個相對一致的細胞群體(供生化研究、胚胎發(fā)生研究、胚的同

步化研究等)

?能快速吸收外源物質(zhì)，檢查藥效

?研究次生代謝、酶誘導(dǎo)、基因表達、抗生素的降解的良好實驗體系

?多數(shù)懸浮細胞缺乏葉綠體、色素，對酶和次生物質(zhì)的分離及純化十分

有利

-細胞增殖速度快，適于進行大規(guī)模培養(yǎng)

?分離原生質(zhì)體的良好細胞來源

二、從愈傷組織建立懸浮培養(yǎng)體系

多數(shù)懸浮培養(yǎng)物(suspensioncultures)是將生長快、質(zhì)地疏松的愈傷

小塊轉(zhuǎn)移到與愈傷誘導(dǎo)含同樣成分的液體培養(yǎng)基里進行振蕩培養(yǎng)而獲得。

接種時必須有足夠多的細胞塊，以保證有較合適的細胞密度。振蕩速度一

般為30-150rpm。第一次繼代時一，應(yīng)去掉開始時接入的大塊細胞團——過濾。

有時有些物種的愈傷塊很堅硬，接入液體培養(yǎng)基后不能分散，繼代幾次就

會長出疏松愈傷。

三、懸浮培養(yǎng)物的繼代和生長情況檢測

比固體培養(yǎng)繼代時間短得多，一般每周或每兩周繼代一次。其方

法是：培養(yǎng)瓶靜置一段時間后，用吸管吸去上清液，加入新鮮培養(yǎng)液。如

果培養(yǎng)物過多，需要分瓶。

懸浮培養(yǎng)物的生長情況檢測可以通過下列參數(shù)確定：

,細胞疊積體積(packedcellvolume,PCV)

,細胞數(shù)(cellnumber)

?鮮、干重(wetanddryweight)

?蛋白質(zhì)和/或DNA含量(proteinand/orDNAcontent)

?培養(yǎng)基電導(dǎo)率(mediumconductivity)

,細胞生活力(cellviability)

第三節(jié)愈傷組織分化與植株再生

體細胞胚胎發(fā)生：指從體細胞進行的類胚結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)。體細胞胚是一個二

極結(jié)構(gòu)，不物理地附著于原組織，每一個體細胞胚稱為胚狀體，它可以同

合子胚一樣發(fā)育成植株。

器官發(fā)生：指從愈傷組織形成芽及根的過程，芽是一個單極性結(jié)構(gòu)，物理

地同母體組織聯(lián)結(jié)著。

一、器官發(fā)生與植株再生

1.器官發(fā)生與植株再生的方式

在適合的激素濃度和配比及溫光條件下，愈傷組織細胞會發(fā)生

生理代謝上的改變，促使細胞分裂部位和方向改變，首先出現(xiàn)分生細胞，

經(jīng)細胞分裂逐漸形成分生細胞團和分生組織，進一步再分化形成維管結(jié)節(jié)

直至分化成芽和根等器官。可以把愈傷組織分化出芽、根器官概括為以下

幾種方式

⑴單極分化：愈傷組織中的分生中心在刺激物質(zhì)的影響下向著一極分化，

形成有根無芽或者有芽無根的現(xiàn)象。

⑵雙極分化：愈傷組織中隨著細胞分裂出現(xiàn)兩個或兩個以上分生中心，其

中有的分化芽，有的分化根，根芽之間并無輸導(dǎo)等組織溝通，在培養(yǎng)瓶內(nèi)

靠愈傷組織提供養(yǎng)料，這種以愈傷組織隔離著的芽和根的苗，常常不能移

栽成活。

⑶先芽后根：愈傷組織中產(chǎn)生多個分生細胞形成分生中心，從中僅分化出

芽，一般情況下待芽長到一定大小時，切下移入生根培養(yǎng)基中，在其基部

即可分化出根。有些植物在分化芽的培養(yǎng)基上同時在芽器官基部分化出根,

形成完整的植株。大多數(shù)植物均屬這類正常的分化途徑，這類苗移栽較易

成活。

⑷先根后芽：有些植物外植體脫分化后在愈傷組織上先分化出根，而后在

靠近愈傷組織的根部上再分化出芽，有的將根切下放入分化培養(yǎng)基，再于

根上分化出芽器官，甚至在根端也能分化出芽。

2.影響器官發(fā)生的因素

?化學(xué)因素：

從早期煙草組織的研究我們知道，器官發(fā)生的表達可被外源化學(xué)物質(zhì)控

制，高濃度的生長素和低濃度的分裂素可以促使細胞連續(xù)繁殖——無組織的

生長。相反，高濃度的分裂素能引起莖-芽(shoot-bud)形成。同時，

auxion/cytokinin之比值的變化成為特定的器官、根或芽分化的一個參數(shù)，

一個基本的規(guī)律是：生長素促進根分化，分裂素促進芽分化。生長素與根

形成有關(guān)，同時對于愈傷組織的保持也是必須的。在促進芽的分化中，BAP

是最有效的。

?物理因素

光：很多光照條件下，一些植物均能進行器官發(fā)生，說明光周期并不

是非常重要的因子，可有的植物在光、暗交替條件下才能形成芽，而在連

續(xù)光照下則不能。盡管如此，多數(shù)植物需要一個穩(wěn)定的光周期，多數(shù)培養(yǎng)

條件是14-16h光照，8-10h黑暗。光質(zhì)對于某些植物可能也很重要。

溫度：不同植物不一樣，需要摸索，如煙草和棉花就不一樣。

第四節(jié)體細胞胚胎發(fā)生與植株再生

在離體組織細胞培養(yǎng)形成胚狀體的過程中，體細胞分裂增殖并順序通

過原胚期，球形胚期，心形胚期，魚雷形胚期和子葉期五個時期，進而形

成完整的植株，與整體植物中受精卵的發(fā)育過程極為相似。

一、植物胚狀體發(fā)生的普遍性

由于培養(yǎng)的植物組織細胞一般是體細胞，因而將由離體培養(yǎng)的組織細

胞分化出的胚叫體細胞胚(somaticembryo)；又由于離體培養(yǎng)的植物組織細

胞是在未經(jīng)過有性過程的情況下直接產(chǎn)生胚這一結(jié)構(gòu)，并且形成的胚與性

細胞形成的胚相似，因此也將此類胚稱為胚狀體(embryoid)o

胚狀體發(fā)生在高等植物中是一個普遍現(xiàn)象，既包括雙子葉植物，也包

括單子葉植物；既包括許多草本植物，也包括許多木本植物。產(chǎn)生胚狀體

的離體培養(yǎng)物也是多種多樣的，離體的根、莖、葉、花芽、花藥、幼苗、

子葉、子房中的合子胚、胚狀體、多種單細胞、游離的小泡子以及原生質(zhì)

體，都曾記錄過有直接或間接(viacallus)產(chǎn)生胚狀體的能力。

二、研究胚狀體的意義

?數(shù)量多。在細胞、愈傷組織和器官的培養(yǎng)中，一個培養(yǎng)物上誘導(dǎo)胚狀

體的數(shù)量，往往比誘導(dǎo)芽的數(shù)量要多得多。

-速度快。胚狀體是從單細胞直接分化成小植株，而其它再生植株的方

式，一般要經(jīng)過愈傷組織階段，時間上要慢得多。

?結(jié)構(gòu)完整。胚狀體一旦形成即可長成為小植株，成苗率高。

?是研究胚發(fā)育的良好材料體系。

?用于人工種子研究與生產(chǎn)，可節(jié)約大量種子，且可固定雜種優(yōu)勢。

三、胚狀體的概念與分類

胚狀體是植物組織培養(yǎng)中起源于非合子細胞，經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎

發(fā)育過程形成的胚狀結(jié)構(gòu)。這個定義包括下列幾點含義：①胚狀體是組織

培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于組織培養(yǎng)范圍使用，區(qū)別于無融合生殖的胚；②胚狀

體起源于非合子細胞，區(qū)別于合子胚；③胚狀體的形成經(jīng)歷胚胎發(fā)育的過

程，區(qū)別于組織培養(yǎng)中分化的芽體。

胚狀體可按其來源分為兩大類：一類是由普通植物體（胞子體）的各

種器官等雙倍體的體細胞產(chǎn)生的胚狀體，也稱之為體細胞胚；另一類是由

小抱子或其分裂產(chǎn)物等單倍體細胞產(chǎn)生的胚狀體，通常稱為花粉胚，可發(fā)

育成單倍體植株。不管是那種類型的胚狀體，它都有兩個特點：①兩極性,

即在其發(fā)生的最早階段就具有根端（胚根）和莖端（胚芽）；②它與母體植

物或外植體的維管束系統(tǒng)無直接連系。

植株再生通過胚狀體與器官兩種途徑的主要區(qū)別

?胚狀體途徑形成的植株器官途徑形成的植株

?細胞內(nèi)出現(xiàn)方向相反的兩單向極性，單個分生中心

極分化，具有根端和芽端

兩個分生中心

?不定胚維管組織與外植體不定芽和不定根與愈傷組織

維管組織不相連的維管相連無胚胎形態(tài)，分

生中心直接分化為器官

?具有典型的胚胎形態(tài)發(fā)生不定芽的苗無子葉

過程形成的幼苗具有子葉

?胚狀體發(fā)育的苗，根和芽齊全一般先長芽后長根，或先長根后長芽

四、植物胚狀體的產(chǎn)生方式

胚狀體產(chǎn)生的方式可以分為以下五種：

1.胚狀體起源于外植體表面已分化的細胞

2.在外植體的已分化的組織中，由少數(shù)薄壁細胞轉(zhuǎn)變成迅速分裂的細胞,

形成擬分生組織的細胞團和小塊愈傷組織，由這些小塊愈傷組織形成

胚狀體

3.在外植體切口表面形成大量愈傷組織，然后從愈傷組織的表面產(chǎn)生胚

狀體

4.在懸浮培養(yǎng)時，游離細胞可以生長和分裂產(chǎn)生細胞團，這些細胞團長大

變成胚性細胞復(fù)合體，胚性細胞復(fù)合體的表面細胞可產(chǎn)生胚狀體

5.在個別情況下，由單個游離細胞發(fā)育成胚狀體

五、影響胚狀體發(fā)生和發(fā)育的外部條件

1.植物激素

(1)生長素類物質(zhì)

在對胡蘿卜胚狀體的發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)，其胚狀體的發(fā)生可分為兩個階

段，第一階段包括外植體細胞的脫分化、愈傷組織的誘導(dǎo)、胚性細胞或細胞

團的形成，這一階段所用的培養(yǎng)基必須含有生長素類物質(zhì)，主要是2,4-D；

第二階段包括胚狀體的形成和發(fā)育，這一階段必須在降低2,4-D濃度或完

全去除2,4-D的培養(yǎng)基上才能進行。

其它生長素如IAA、NAA、NOA、2,4,5-T等的作用與2,4-D大致

相同，但誘導(dǎo)的效果和對胚狀體形成的抑制作用不完全一致。后來的研究

發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)植物均屬于這一模式，但不同的植物在含生長素時胚狀體

發(fā)育時期不一樣，有的只能產(chǎn)生胚性愈傷，有的可達圓球胚，有的可達魚

雷胚，個別植物可發(fā)育到成熟胚，但是這些不同發(fā)育程度的胚狀體都必須

在轉(zhuǎn)移到無生長素或生長素含量很低的培養(yǎng)基上以后才能繼續(xù)發(fā)育和成株

(2)細胞分裂素類物質(zhì)

細胞分裂素不僅沒有誘導(dǎo)的作用(單獨使用不能誘導(dǎo)愈傷)，而且對已

完成誘導(dǎo)的愈傷組織中胚狀體的發(fā)生還有抑制作用。但在除去細胞分裂素

之后，胚狀體發(fā)生能力還可能部分地恢復(fù)。

(3)生長素與分裂素結(jié)合使用

多數(shù)情況下，生長素與細胞分裂素結(jié)合使用在植物胚狀體誘導(dǎo)中有

正效果。

(4)其它激素

一般ABA、GA抑制胚狀體發(fā)育，但有人認為，ABA對柑桔的胚狀

體發(fā)生有明顯的促進作用。

2.含氮化合物

?NH4+與NO3+的作用不同

?NH4+/NO3+的比例

?氨基酸、酰胺等有機氮

3.其它外部因素

六、影響胚狀體發(fā)生和發(fā)育的內(nèi)部因素

1.植株基因型的影響

培養(yǎng)個體的遺傳基礎(chǔ)決定了離體培養(yǎng)的反應(yīng)能力。不同種的植物甚至

同種植物的不同品種（或不同地理來源）個體之間，其個體基因型存在著差

異，這就決定了不同的體細胞胚胎發(fā)生能力。

2.生理上的隔離

細胞與其周圍組織之間生理上的隔離是其進行胚狀體發(fā)生的先決條

件。

3.外植體的年齡（生理狀態(tài)）與來源

少數(shù)植物如胡蘿卜，兒乎所有的器官都可誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體，但大多數(shù)植

物，在目前只有一定發(fā)育時期的某些器官可產(chǎn)生胚狀體。一般以幼嫩組織作

外植體較易誘導(dǎo)胚狀體。

4.培養(yǎng)時間和細胞倍性變化的影響

一般由初分離或誘導(dǎo)的或僅經(jīng)過短時期培養(yǎng)的愈傷組織，最易產(chǎn)生胚狀

體;隨著培養(yǎng)時間的延長，形成胚狀體的能力下降以至完全消失。培養(yǎng)細胞倍

性的變化可能對胚狀體的形成有一定影響。

5.內(nèi)源激素水平的變化

培養(yǎng)細胞的內(nèi)源激素水平對胚狀體發(fā)生可能有更直接的影響。

七、胚胎發(fā)生的分子機制研究

主要結(jié)合自己的科研結(jié)果講述，讓學(xué)生掌握研究分子機制的意義、實驗

設(shè)計、方法、克隆相關(guān)基因等。

八、誘導(dǎo)胚狀體形成的一些基本原則

?誘導(dǎo)初期通常需要高濃度生長素，但在隨后的胚發(fā)育中，生長素濃度

必須降低或消除。2,4-D對胚胎發(fā)生很重要，尤其對禾本科作物。細

胞分裂素在胚誘導(dǎo)中不具關(guān)鍵作用。

?GA和乙烯通常抑制胚胎發(fā)生

?從幼嫩材料來的愈傷組織易誘導(dǎo)胚胎發(fā)生，柑桔中似乎只有珠心胚比

較好

?降低NH4+對于胚胎發(fā)生很重要，K+促進胚胎發(fā)生，高濃度Ca++抑

制胚胎發(fā)生，而高濃度鹽則促進胚胎發(fā)生

?光一般促進胚胎發(fā)生

?高溫一般促進胚胎發(fā)生，一些植物（尤其是花藥培養(yǎng)）需要冷激（低

溫處理）才能誘導(dǎo)胚胎發(fā)生和胚的發(fā)育

?糖含量一般2-3%為宜

?脫落酸在懸浮培養(yǎng)中有利于胚胎發(fā)生

九、試管苗移栽

試管苗在如下幾個方面不同于田間植株：

?試管苗的角質(zhì)層（蠟質(zhì)層）發(fā)育很差，移栽時易失水

?根很弱，功能差

?自然條件下，植物與真菌、細菌存在一種共生關(guān)系，試管苗缺乏這種

關(guān)系。所以試管苗移栽入土?xí)r需要一個適應(yīng)過程

試管苗移栽時應(yīng)注意如下問題：

?防止被病菌感染：瓊脂要沖洗干凈，最好用無菌土

?為防止根受傷，可以用過篩的細土

?為了保證移栽時順利成活，幼苗應(yīng)在低鹽培養(yǎng)基上生根，1/2MS或

knop營養(yǎng)液

?有時移栽后在低溫處理一段時間以打破休眠（主要用于灌木、樹種等）

?應(yīng)該采取保持濕度的措施

思考題：

1.概念與名詞：植物細胞全能性，脫分化，在分化，外植體，體細胞胚

胎發(fā)生，器官發(fā)生，體細胞胚，胚狀體

2.在發(fā)動愈傷組織誘導(dǎo)時，外植體的選擇應(yīng)注意什么原則？為什么種子

是誘導(dǎo)愈傷的良好其始材料？

3.愈傷組織的誘導(dǎo)分哪幾個時期，各時期有什么特點？

4.什么叫繼代培養(yǎng)？為什么要進行繼代培養(yǎng)？

5.懸浮培養(yǎng)有什么用途？

6.器官發(fā)生再生植株有哪幾種方式？

7.研究胚狀體的意義？

8.胚狀體的兩個特點是什么？

9.影響胚狀體發(fā)生發(fā)育的外部因素、內(nèi)部因素？

10.試管苗移栽時應(yīng)注意哪些事項？

第4章體細胞無性系變異與植物改良

教學(xué)時數(shù)：2學(xué)時

教學(xué)目的：讓學(xué)生掌握體細胞克隆變異產(chǎn)生的遺傳基礎(chǔ)；體細胞克隆變異的

育種應(yīng)用。本章讓學(xué)生自己準備教學(xué)資料，有學(xué)生上課，學(xué)生提問，教師

點評，鍛煉學(xué)生組織課堂的能力、演講能力，體會講課的感覺。要求講課

的學(xué)生準備多媒體，并查閱相關(guān)資料，圖文并茂。分3個部分有3個學(xué)生

講述，每個學(xué)生必須演講30分鐘，每個學(xué)生承擔(dān)一部分：體細胞無性系變

異的概念及其產(chǎn)生的遺傳基礎(chǔ)；無性系變異發(fā)生的普遍性；無性系變異的

育種應(yīng)用。

思考題：

1.體細胞克隆變異與配子體細胞克隆變異

2.體細胞無性系變異產(chǎn)生的遺傳機制是什么？

第5章單倍體細胞培養(yǎng)

教學(xué)時數(shù)：4學(xué)時

教學(xué)目的：要求學(xué)生掌握單倍體的概念和產(chǎn)生途徑；離體培養(yǎng)誘發(fā)單倍體

的意義；花藥培養(yǎng)及其影響因素；小泡子培養(yǎng)；單倍體細胞培

養(yǎng)在育種中的應(yīng)用。

引言

單倍體細胞培養(yǎng)主要包括三個方面：花藥培養(yǎng)、小抱子培養(yǎng)和未受精子

房及卵細胞培養(yǎng)，其中花藥和小抱子培養(yǎng)是體外誘導(dǎo)單倍體的主要途徑。

單倍體是指具有配子染色體數(shù)的個體或組織，即體細胞染色體數(shù)為no

由于物種的倍性不同，可以把單倍體分成兩類，即一倍單倍體

(monohaploids),這類單倍體起源于二倍體物種；多倍單倍體

(polyhaploids),這類單倍體起源于多倍體(如4X,6X等)。典型的單倍

體只能從多倍體植物，如小麥、煙草、三葉草等植物中產(chǎn)生，二倍體植物

產(chǎn)生的單倍體只有在加倍后形成雙單倍體才能存活下來。

一、單倍體的起源和遺傳行為

1.誘發(fā)植物單倍體的方法

①種間和屬間雜交。遠緣雜交中，異種植物雖然不能與母本授粉、受精，

由于遠緣花粉的誘導(dǎo)作用，卵細胞在沒有受精的情況下受刺激而發(fā)育成胚。

這一技術(shù)在土豆育種中得到應(yīng)用。遠緣雜交誘發(fā)單倍體的現(xiàn)象在土豆、大

麥、小麥、玉米中都有發(fā)生。

②物理照射和化學(xué)誘變?；ǚ塾蒙渚€照射后失去了受精能力，然后與母

株授粉，卵細胞在花粉的刺激作用下進行孤雌發(fā)育，從而產(chǎn)生單倍體。這

方面的例子可在煙草、小麥、金魚草中發(fā)現(xiàn)。

③雙生苗的篩選(selectionoftwins)。有些植物可產(chǎn)生多胚種子，即兩個

或多個胚被共同的種皮包裹著，這些種子可產(chǎn)生單倍體-單倍體、二倍體-

二倍體和單倍體-二倍體植株。在Capiscum中，雙生菌的頻率受母本基因

型控制。通過篩選可以提高雙生苗的頻率。

④花藥和花粉培養(yǎng)。

2.單倍體的遺傳行為

一倍的單倍體只有一個染色體基數(shù)(X),減數(shù)分裂時染色體不能配對,

分離極不正常，但具有一定同源關(guān)系的染色體可以部分配對，從而可以對

染色體的演化過程進行研究。起源于同源或異源多倍體的多倍單倍體減數(shù)

分裂時染色體的行為大不相同，如AAAA的單倍體為AA,而AABB的單

倍體為AB,前者具有正常的染色體減數(shù)分裂行為，后者類似于一倍單倍體。

二、單倍體的應(yīng)用價值

?在植物育種中使后代迅速純合

?提高選擇效率

?排除雜種優(yōu)勢對后代選擇的干擾

?遺傳研究的良好實驗材料體系

-突變體的篩選

-消除致死基因

?選育新型自交系

?遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料

三、培養(yǎng)條件下的小泡子發(fā)育

1.小抱子的正常發(fā)育

雄蕊的花藥中可分化出泡原組織，再進一步分化為小抱子母細胞（通

常稱花粉母細胞，染色體數(shù)為2n）,經(jīng)減數(shù)分裂形成四分抱子（染色體數(shù)為

n）,然后經(jīng)單核早期、單核靠邊期、雙核期（一個營養(yǎng)核和一個生殖核），

最后到達三核期而成為成熟花粉

2.培養(yǎng)條件下的小抱子發(fā)育

培養(yǎng)條件下，由于改變了花粉原來的生活環(huán)境，花粉的正常發(fā)育途徑

受到抑制，花粉第二次分裂不再象正?；ǚ郯l(fā)育那樣由生殖核再分裂一次

形成兩個精子核，而是象胚細胞一樣持續(xù)分裂增殖。這時花粉的分裂增殖

方式有四種類型：

1）營養(yǎng)細胞發(fā)育途徑；2）生殖細胞發(fā)育途徑；3）營養(yǎng)細胞和生殖

細胞并進發(fā)育途徑；4）花粉均等分裂途徑

四、花藥培養(yǎng)

1、影響花藥培養(yǎng)的因素

(1)、供體植株的生長條件：在煙草中，短光周期(8h)和高光強(160001ux)

較有利。而大麥，低溫(1200和高光強(200001ux)較好。蕓苔屬的一

些種(油菜)，高光強和一定的溫度變化較有利，對于甘藍型冬油菜來講，

植株在150c下生長比200c下好。對煙草植株進行氮饑餓處理可以提高花

藥培養(yǎng)效果。

(2)、供體植株的年齡：多數(shù)情況下幼年植株優(yōu)于老年植株，可甘藍型油

菜卻相反。

(3)、花粉發(fā)育時期：因物種而異。在煙草中，處于第一次有絲分裂期的

花粉效果最好，而在禾本科和蕓苔屬中，單核早期最好?；ㄋ幵诮臃N以前,

一般需先用醋酸洋紅壓片法進行鏡檢，以確定花粉的發(fā)育時期，并找出花

粉發(fā)育時期與花蕾或幼穗大小、顏色等特征之間的相應(yīng)關(guān)系?？梢愿鶕?jù)花

蕾和花藥的長度判斷小泡子發(fā)育時期，從而為取材提供參考。

花粉二型性的概念:在花藥/花粉培養(yǎng)時.，由于對培養(yǎng)條件的反應(yīng)不同，

花粉在形態(tài)上形成兩種類型，一類是具胚性的，在煙草和大麥中，花粉小，

染色淺；另一類為花粉大，染色深，朝成熟花粉方向發(fā)展。這種現(xiàn)象即花

粉的二型性。

(4)、花蕾和花藥的預(yù)處理：對于有些物種，培養(yǎng)前對花藥和花蕾進行預(yù)

處理，能顯著提高培養(yǎng)效果。如大麥花藥，在40c處理28天，或70c處理

14天，能收到最好效果。除溫度處理以外，其它一些因素的預(yù)處理有時也

能收效，如用激素處理供體植株可以提高土豆花藥單倍體的形成能力。用

EMS、酒精、射線、降低氣壓、高低滲處理進行預(yù)處理的也有報道。

(5)、供體植株的基因型：研究表明，小泡子能否進行胚胎發(fā)生受基因控

制，所以，供體植株的基因型對花藥培養(yǎng)效果有重要影響。

(6)、培養(yǎng)基：花藥培養(yǎng)時往往需要一定的滲透壓，成熟花粉是二細胞結(jié)

構(gòu)的往往需低濃度糖，而成熟花粉為三細胞結(jié)構(gòu)的植物往往需高滲條件，

如油菜小泡子培養(yǎng)時，糖的濃度可用到13-17%。培養(yǎng)基中激素的種類、使

用量和配比，對誘發(fā)小抱子啟動分裂、生長和分化常常起決定作用，而其

它成分一般只起次要的輔助作用。因此，在進行花藥培養(yǎng)時，進行細致的

激素方面的實驗是必要的。氮素的量和各種氮素的比例對培養(yǎng)效果有明顯

影響。有機物質(zhì)在花藥培養(yǎng)中可能起重要作用。在大麥和小麥的花藥培養(yǎng)

中，谷氨酰胺對小抱子胚形成具有明顯的促進作用。有些作物的花藥對培

養(yǎng)基的pH值有一定要求。

(7)、培養(yǎng)條件：多數(shù)植物在250c下培養(yǎng)能誘導(dǎo)愈傷組織，可某些植物，

尤其是蕓苔屬，在高溫350c下處理幾天，然后進入250c培養(yǎng)能收到最好

培養(yǎng)效果。

(8)、活性碳的作用：

(9)、培養(yǎng)密度

2.逆境處理對小抱子胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)作用

?饑餓處理

?高溫處理

?低溫處理

?Y射線

?秋水仙素

?重金屬脅迫

?上述多因子的結(jié)合

其機理是改變細胞分裂周期，改變細胞發(fā)育途徑等

3、花藥培養(yǎng)操作技術(shù)

花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體的技術(shù)相對于其它細胞工程技術(shù)是一種較簡單的

技術(shù)，在合適的植株上選定花蕾后，用一種適當?shù)臏缇鷦┻M行表面消毒，

用無菌水沖洗3-4次，然后在無菌條件下，將花藥連同花絲一起取出，置于

一個無菌的培養(yǎng)皿中，取其中一個花藥在醋酸洋紅中鏡檢，確定花粉的發(fā)

育時期，若發(fā)現(xiàn)符合要求，把其余雄蕊上的花藥輕輕地從花絲上摘下，水

平地放在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。花藥培養(yǎng)2-3周后，花藥中的小胞子經(jīng)大量分

裂形成胚或愈傷組織，并逐漸使花藥壁破裂，表面上看似從花藥表面形成

的突出物。二周后，這類花粉粒進行細胞分裂，成為二細胞的“原胚”，并繼

續(xù)分裂形成多細胞的球形胚。隨培養(yǎng)時間的延長，球形胚逐漸發(fā)育成心形

胚、魚雷形胚等。三周后，轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)，胚狀體見光有淡黃色轉(zhuǎn)綠，并

逐漸發(fā)育成小苗。

評價花藥培養(yǎng)體系的好壞需要一些技術(shù)指標體系，通常使用的有：壓

片或切片觀察，計算啟動分裂的小抱子/總小抱子或計算愈傷組織塊數(shù)（胚

數(shù)、植株數(shù)）/花藥（花蕾）；或一定時間內(nèi)計算尚有活力的小抱子數(shù)/總小

胞子數(shù)。

4、單倍體植株的加倍處理

單倍體植株通常情況下表現(xiàn)為植株矮小，生長瘦弱，由于染色體在減

數(shù)分裂時不能正常配對，所以表現(xiàn)為高度不育。對單倍體進行加倍