山東省地方計(jì)量技術(shù)規(guī)范

JJF（魯）138—2022

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范

CalibrationSpecificationforReal-TimeFluorescentQuantitativePolymerase

ChainReactionAnalyzer

2022—06—24發(fā)布2022—07—01實(shí)施

山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范

1范圍

本規(guī)范適用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的校準(zhǔn)，其他類型PCR儀相同原理部分可參照本

規(guī)范執(zhí)行。

2引用文件

本規(guī)范引用了下列文件：

JJF1527-2015聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范

YY/T1173-2010聚合酶鏈反應(yīng)分析儀

凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本規(guī)范；凡是不注日期的引用文件，

其最新版本（包括所有的修改單）適用于本規(guī)范。

3術(shù)語(yǔ)

YY/T1173-2010中界定的及以下術(shù)語(yǔ)和定義適用于本規(guī)范。

3.1PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）polymerasechainreaction

PCR即聚合酶鏈反應(yīng)是一種對(duì)特定的DNA或RNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法，

由變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。[YY/T1173-2010,術(shù)語(yǔ)和定義3.1]

3.2PCR儀（聚合酶鏈反應(yīng)分析儀）polymerasechainreactionanalyzer,PCRanalyzer

基于PCR技術(shù)原理，模擬DNA或者RNA的復(fù)制過(guò)程，在模板、引物、聚合酶等存

在的條件下，特異擴(kuò)增已知序列，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析的儀器設(shè)備。[YY/T1173-2010,術(shù)語(yǔ)

和定義3.2]

3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀real-timefluorescentquantitativePCRanalyzer,RFQ-PCR

analyzer

可以實(shí)現(xiàn)DNA或者RNA的擴(kuò)增，根據(jù)PCR過(guò)程中熒光染料釋放的熒光強(qiáng)度的變化

對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物量進(jìn)行定量分析，并通過(guò)對(duì)熒光的采集和分析以達(dá)到對(duì)原始模板量進(jìn)行分析的

儀器設(shè)備。

3.4溫度示值誤差temperatureindicationerror

溫控裝置（如均熱塊）的設(shè)定值與所有采樣孔實(shí)際溫度平均值之差。單位：攝氏度，

符號(hào)：℃。

1

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3.5溫度均勻度temperatureuniformity

均熱塊所有采樣測(cè)量孔溫度在某一瞬時(shí)任意兩點(diǎn)溫度之間的最大差值。單位：攝氏度，

符號(hào)：℃。

3.6溫度波動(dòng)度temperaturevolatility

在被檢設(shè)備穩(wěn)定的狀態(tài)下，在規(guī)定的時(shí)間間隔內(nèi)，均熱塊所有采樣點(diǎn)中任意一點(diǎn)溫度

隨時(shí)間的變化量。單位：攝氏度，符號(hào)：℃。

3.7溫度最大過(guò)沖量temperaturemaximumovershoot

均熱塊溫度升高或降低至設(shè)定值過(guò)程中，所有采樣測(cè)量孔溫度超出（高于或低于）設(shè)

定值的最大幅度。單位：攝氏度，符號(hào)：℃。

3.8平均升溫速率meanheatingrate

升溫過(guò)程中模塊單位時(shí)間內(nèi)上升的平均溫度值。單位：攝氏度每秒，符號(hào)：℃/s。

3.9平均降溫速率meancoolingrate

降溫過(guò)程中模塊單位時(shí)間內(nèi)下降的平均溫度值。單位：攝氏度每秒，符號(hào)：℃/s。

3.10熒光染料fluorochrome

由短波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)，釋放出可見(jiàn)光的試劑。[YY/T1173-2010,術(shù)語(yǔ)和定義3.12]。

3.11熒光強(qiáng)度精密度precisionoffluorescenceintensity

對(duì)多個(gè)檢測(cè)孔在同一熒光條件下重復(fù)熒光強(qiáng)度檢測(cè)，其檢測(cè)值的一致性。

3.12閾值循環(huán)數(shù)Ct(Cp)cyclethreshol，crossingpoint

均熱塊測(cè)量孔內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)指數(shù)擴(kuò)增時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)周期數(shù)。主要的計(jì)算方式是以

擴(kuò)增過(guò)程前3～15個(gè)循環(huán)的熒光值的10倍標(biāo)準(zhǔn)差為閾值，當(dāng)熒光值超過(guò)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)

則為閾值循環(huán)數(shù)(Ct)。[YY/T1173-2010,術(shù)語(yǔ)和定義3.15]。

3.13閾值循環(huán)數(shù)精密度precisionofthresholdcycle

均熱塊不同測(cè)量孔在同一熒光條件下，閾值循環(huán)數(shù)重復(fù)測(cè)量的一致性。

3.14熔解溫度melttemperature,Tm

全總DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時(shí)的溫度稱為熔解溫度。單位：攝氏度，符號(hào)：℃。

3.15熔解曲線meltcurve

PCR過(guò)程中均熱塊測(cè)量孔的熒光強(qiáng)度（縱坐標(biāo)）與溫度（橫坐標(biāo)）形成的曲線。

3.16熔解溫度漂移melttemperaturebias

根據(jù)熔解曲線計(jì)算的熔解溫度值與光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器熔解溫度設(shè)定值之差。單位：攝氏度，

2

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符號(hào)：℃。

3.17峰值強(qiáng)度peakintensity

熔解曲線上熔解溫度對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度。

3.18通道峰值強(qiáng)度一致性channelpeakheightconsistency,CPHC

熔解曲線上，所有采樣測(cè)量孔峰值強(qiáng)度的變化趨勢(shì)。

峰高的差異表明熒光定量PCR儀的光路、光學(xué)、光學(xué)檢測(cè)和靈敏度的差異，理想的熒

光定量PCR儀，CPHC為1.00。

3.19線性靈敏系數(shù)linearsensitivityfactor,LSF

同一熔解溫度下，表征熔解曲線線性變化靈敏程度的比率。

注：理想的熒光定量PCR儀，線性靈敏度應(yīng)該是1.00。LSF在0.80和1.20之間，溶解曲線呈現(xiàn)

基本線性；LSF<0.80：在高熒光強(qiáng)度下線性降低，注意信號(hào)飽和；LSF>1.20：在低熒光強(qiáng)度下線性降

低，注意最小信號(hào)檢測(cè)和靈敏度。

3.20熔解溫度比ratioofmelttemperature,RTm

同一熔解溫度下，表征熔解溫度飄移因素的比率。

注：在到之間：相同產(chǎn)品熔解溫度不同，差異僅基于控溫模塊特性，熔解峰漂移與

RTm0.801.20

溫度不均勻直接相關(guān)；：相同產(chǎn)品熔解溫度不同，差異是由控溫模塊、光學(xué)和光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)

RTm>1.20

不準(zhǔn)確共同導(dǎo)致的；：相同產(chǎn)品熔解溫度不同，差異是與光學(xué)、光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)及分析軟件直

RTm<0.80

接相關(guān)。

3.21樣本示值誤差errorofsample’sindication

一次融-凍轉(zhuǎn)換過(guò)程結(jié)束到下次凍-融轉(zhuǎn)換過(guò)程開始之間的過(guò)程。

3.22樣本線性sample'slinearity

系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)擴(kuò)增Ct值對(duì)濃度對(duì)數(shù)值的線性回歸系數(shù)。

4概述

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，全稱為實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)分析儀（real-time

fluorescentquantitativePCRanalyzer,RFQ-PCR，以下簡(jiǎn)稱實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀）是在PCR

反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，同時(shí)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)擴(kuò)增基因進(jìn)行定量分析的儀器。標(biāo)記有熒光染料的探針與模板基因混合后，完成高溫變

性、低溫復(fù)性和適溫延伸的熱循環(huán)后，與模板基因互補(bǔ)配對(duì)的探針被切斷，熒光染料游離

于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下熒光染料發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的

3

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基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長(zhǎng)，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)與之對(duì)應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化的熒光信號(hào)強(qiáng)度，即可

對(duì)待測(cè)擴(kuò)增基因進(jìn)行定量分析。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀均熱塊一般有32孔板、48孔板、96孔板和384孔板等幾種類型，

其中96孔板應(yīng)用最為廣泛。其主要由軟件控制系統(tǒng)、溫度控制模塊、熒光檢測(cè)模塊、均

熱塊檢測(cè)孔組成，詳細(xì)結(jié)構(gòu)如圖1所示。應(yīng)用于新冠病毒核酸快速檢測(cè)的儀器檢測(cè)通量通

常不大于16。

圖1實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀結(jié)構(gòu)示意圖

1—光源2—濾光片3—準(zhǔn)直器4—光導(dǎo)束5—樣品6—均熱塊檢測(cè)孔7—溫度傳感器8—加熱制冷供電

9—光開關(guān)陣列10—光敏器11—電控裝置12—通訊接口13—計(jì)算機(jī)

5計(jì)量特性

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀計(jì)量性能指標(biāo)如表1所示。

表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀計(jì)量性能指標(biāo)

序號(hào)項(xiàng)目技術(shù)指標(biāo)備注

溫度示值誤差±℃

130℃，50℃，0.5

2溫度均勻度60℃，70℃，≤1.0℃

90℃，95℃。

3溫度波動(dòng)度≤0.2℃

溫度項(xiàng)目

溫度最大過(guò)沖量

4/

5平均升溫速率50℃→90℃≥1.5℃/s

6平均降溫速率90℃→50℃≥1.5℃/s

4

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續(xù)表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀計(jì)量性能指標(biāo)

7閾值循環(huán)數(shù)示值誤差±2.5

8閾值循環(huán)數(shù)均勻度≤5

9閾值循環(huán)數(shù)精密度≤10

光學(xué)系統(tǒng)

10

通道峰值強(qiáng)度一致性1±0.2物理項(xiàng)目

11線性靈敏系數(shù)1±0.2

12熔解溫度飄移±1℃

13熔解溫度比1±0.2

光學(xué)系統(tǒng)

14樣本示值誤差±15%

生物化學(xué)

15樣本線性相關(guān)系數(shù)≥0.980項(xiàng)目

注：以上所有指標(biāo)不適用于合格性判別，僅供參考。

6校準(zhǔn)條件

6.1環(huán)境條件

6.1.1環(huán)境溫度：（15～30）℃；環(huán)境濕度：20%RH～85%RH；

6.1.2其它：儀器應(yīng)遠(yuǎn)離振動(dòng)、電磁干擾。

6.2測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)及其他設(shè)備

6.2.1光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器

光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器集成了溫度傳感器和發(fā)射光發(fā)生器兩部分。其溫度測(cè)量范圍為（0～120）℃，

最大允許誤差為±0.1℃，采樣時(shí)間間隔不超過(guò)0.5s；發(fā)射光發(fā)生器的波長(zhǎng)范圍為（360～

780）nm，相對(duì)光輻射強(qiáng)度在10%～100%范圍內(nèi)可調(diào)。

也可用滿足上述技術(shù)要求的其他標(biāo)準(zhǔn)器。

6.2.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

校準(zhǔn)時(shí)應(yīng)采用國(guó)內(nèi)外有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，包括：質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、核糖核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，

其特性量值（拷貝數(shù)量≥109copies/μL，Ur≤5%,k=2）。

6.2.3移液器

規(guī)格：2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL，且需要計(jì)量檢定合格。

7校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法

7.1校準(zhǔn)項(xiàng)目

校準(zhǔn)項(xiàng)目主要分為溫度項(xiàng)目和光學(xué)系統(tǒng)項(xiàng)目?jī)纱箢?，具體項(xiàng)目見(jiàn)表1。校準(zhǔn)光學(xué)系統(tǒng)

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項(xiàng)目時(shí)，可根據(jù)客戶要求與實(shí)際情況選擇光學(xué)系統(tǒng)物理校準(zhǔn)方法或光學(xué)系統(tǒng)生物化學(xué)校準(zhǔn)

方法中的一種方法進(jìn)行校準(zhǔn)。對(duì)校準(zhǔn)結(jié)果產(chǎn)生疑義或仲裁時(shí)，應(yīng)采用光學(xué)系統(tǒng)生物化學(xué)校

準(zhǔn)方法。

7.2校準(zhǔn)方法

7.2.1校準(zhǔn)前的準(zhǔn)備工作

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀均熱塊孔數(shù)少于96孔時(shí)，測(cè)量點(diǎn)為12個(gè)，布點(diǎn)圖（以48孔為

例)如圖2所示，均熱塊孔數(shù)為其他數(shù)量時(shí)，可參照?qǐng)D2布點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀均熱

塊孔數(shù)等于或大于96點(diǎn)時(shí)，測(cè)量點(diǎn)為15個(gè)，布點(diǎn)圖如圖3所示，均熱塊孔數(shù)為其他數(shù)量

時(shí)，可參照?qǐng)D3布點(diǎn)。也可以根據(jù)被測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀說(shuō)明書或客戶要求，增加或減

少測(cè)量點(diǎn)數(shù)量并圖示說(shuō)明。

校準(zhǔn)前將實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀預(yù)熱30min。

將儀器及光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器各部件連接完好，在光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器下部的溫度傳感器表面上涂抹適

量導(dǎo)熱油，以確保其與均熱塊測(cè)量孔接觸良好。將光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器分布于均熱塊測(cè)量孔中。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的準(zhǔn)備與配置參照J(rèn)JF1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》附錄A執(zhí)

行。PCR反應(yīng)體系的配置參照J(rèn)JF1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》附錄B執(zhí)行。

圖212個(gè)光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器位置分布示意圖圖315個(gè)光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器位置分布示意圖

7.2.2校準(zhǔn)過(guò)程

溫度項(xiàng)目校準(zhǔn)時(shí)，典型的校準(zhǔn)設(shè)置程序如表2步驟4～11所示（其中平均升、降溫速

率的測(cè)量數(shù)據(jù)分別來(lái)源于步驟4～5和步驟5～6；溫度示值誤差的測(cè)量數(shù)據(jù)來(lái)源于步驟5～

11；溫度均勻度、溫度波動(dòng)度、溫度最大過(guò)沖量的測(cè)量數(shù)據(jù)來(lái)源于步驟5～10）。光學(xué)系統(tǒng)

采用物理校準(zhǔn)方法時(shí)，典型的校準(zhǔn)設(shè)置程序如表2步驟12～16所示（步驟12和步驟13

之間設(shè)定程序循環(huán)32次）。光學(xué)系統(tǒng)采用生物化學(xué)校準(zhǔn)方法時(shí)，典型的校準(zhǔn)設(shè)置程序如表

6

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3所示。也可以根據(jù)被測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀說(shuō)明書或客戶要求，參照表2或表3進(jìn)行設(shè)

定，并說(shuō)明具體參數(shù)校準(zhǔn)時(shí)所選取的溫度值。

表2溫度項(xiàng)目、光學(xué)系統(tǒng)物理項(xiàng)目典型的校準(zhǔn)設(shè)置程序

設(shè)定溫度點(diǎn)

步驟持續(xù)時(shí)間（s）備注

（℃）

13060

29560預(yù)熱程序

33060

43060

595180

630120

790180溫度技術(shù)指標(biāo)校

850180準(zhǔn)程序

970180

1060180

113060

模擬光學(xué)擴(kuò)增程

128510序：在85℃/60℃

之間循環(huán)32次，

136030同時(shí)進(jìn)行光學(xué)檢

測(cè)。

149515擴(kuò)增變性程序

156030熔解曲線分解過(guò)

程

169515

表3光學(xué)系統(tǒng)生物化學(xué)項(xiàng)目典型的校準(zhǔn)設(shè)置程序

設(shè)定溫度點(diǎn)

步驟持續(xù)時(shí)間（s）循環(huán)數(shù)

（℃）

1501201

2956001

39530

45

46060

7.2.3溫度項(xiàng)目校準(zhǔn)

a)溫度示值誤差

溫度達(dá)到設(shè)定溫度30s后開始記錄測(cè)量值，記錄5s，最少均勻記錄5組數(shù)據(jù)。溫度示

值誤差的計(jì)算按照公式（1）計(jì)算：

1n

TTsTi（1）

ni1

式中：

T——溫度示值誤差，℃；

7

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Ts——設(shè)定溫度值，℃；

Ti——第i個(gè)溫度傳感器測(cè)量值平均值，℃；

n——溫度傳感器數(shù)量。

b)溫度均勻度

溫度達(dá)到設(shè)定溫度30s后開始記錄測(cè)量值，記錄5s，最少均勻記錄5組數(shù)據(jù)。溫度均

勻度的計(jì)算按照公式（2）計(jì)算：

TuTmaxTmin（2）

式中：

Tu——溫度均勻度，℃；

Tmax——所有測(cè)溫傳感器測(cè)定值平均值的最大值，℃；

Tmin——所有測(cè)溫傳感器測(cè)定值平均值的最小值，℃。

c)溫度波動(dòng)度

溫度達(dá)到設(shè)定溫度30s后開始記錄各點(diǎn)量值，記錄60s，最少均勻記錄10組數(shù)據(jù)。按

照公式（3）計(jì)算：

Tfmax[(TjmaxTjmin)/2]（3）

式中：

Tf——溫度波動(dòng)度，℃；

Tjmax——測(cè)量點(diǎn)j溫度傳感器在m次測(cè)量中的最高溫度，℃；

Tjmin——測(cè)量點(diǎn)j溫度傳感器在m次測(cè)量中的最低溫度，℃。

d)溫度最大過(guò)沖量

溫度過(guò)沖量的計(jì)算按照公式（4）計(jì)算：

TtTtmax-Ts（4）

式中：

Tt——溫度最大過(guò)沖量，℃；

8

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Ttmax——上升或下降達(dá)到設(shè)定溫度后，所有溫度傳感器測(cè)得的溫度最高或最低測(cè)量

值，℃；

Ts——設(shè)定溫度值，℃。

e)平均升溫速率

被測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀從50℃升溫至90℃時(shí)，平均升溫速率的計(jì)算按照公式（5）

計(jì)算：

nTT

（biai）（）

Tah/n5

i1thi

式中：

Tah——平均升溫速率，℃/s；

Tai——50℃溫度點(diǎn)第i個(gè)采樣測(cè)量孔的測(cè)量值，℃；

Tbi——90℃溫度點(diǎn)第i個(gè)采樣測(cè)量孔的測(cè)量值，℃；

thi——從Tai到達(dá)Tbi的時(shí)間，s；

n——溫度測(cè)量點(diǎn)的個(gè)數(shù)。

f)平均降溫速率

儀器從90℃降溫至50℃時(shí)，平均降溫速率的計(jì)算按照公式（6）計(jì)算：

nTT

（biai）（6）

Tac/n

i1tci

式中：

T

ac——平均降溫速率，℃/s；

tci——從Tbi到達(dá)Tai的時(shí)間，s。

7.2.4光學(xué)系統(tǒng)物理校準(zhǔn)法

a)閾值循環(huán)數(shù)示值誤差、均勻度和精密度

閾值循環(huán)數(shù)Ct示值誤差的計(jì)算按照公式（7）計(jì)算，均勻度的計(jì)算按照公式（8）計(jì)算，

精密度按照公式（9）計(jì)算Ct值的相對(duì)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以其作為Ct值精密度的表征。

CtiCtqiCts（7）

9

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CtuCtqmaxCtqmin（8）

n

nCtqi

（i1）2

Ctqi

mn

RSDi1100%（9）

Ctnm1

Ctqi

i1

式中：

Cti——第i個(gè)采樣測(cè)量點(diǎn)閾值循環(huán)數(shù)Ct示值誤差；

Ctqi——第i個(gè)采樣孔熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的閾值循環(huán)數(shù)；

Cts——熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器實(shí)際經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；

閾值循環(huán)數(shù)均勻度；

Ctu——

Ctqmax——所有采樣孔熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)的閾值循環(huán)數(shù)最大值；

Ctqmin——所有采樣孔熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)的閾值循環(huán)數(shù)最小值；

RSDCt——閾值循環(huán)數(shù)精密度；

m——光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器數(shù)量。

b)通道峰值強(qiáng)度一致性、線性靈敏系數(shù)

當(dāng)DNA循環(huán)擴(kuò)增從最大熒光強(qiáng)度100%減弱到20%時(shí)，儀器理論上所接受到的熒光強(qiáng)

度也線性遞減。計(jì)算熔解曲線上熔解溫度（Tm）附近溫度點(diǎn)對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，得到通道峰

值強(qiáng)度一致性（CPHC）和線性靈敏系數(shù)(LSF)，分別由公式（10）、公式（11）計(jì)算：

BC

CPHCii（10）

iBC

AiBi

LSFi

BiCi（11）

式中：

CPHCi——通道峰值強(qiáng)度一致性；

Bi——（Tm-2）℃時(shí)，第i個(gè)采樣孔對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度；

10

JJF（魯）138—2022

Ci——（Tm+2）℃時(shí)，第i個(gè)采樣孔對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度；

B——（Tm-2）℃時(shí)，所有采樣孔對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度平均值；

C——（Tm+2）℃時(shí)，所有采樣孔對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度平均值；

Ai——第i個(gè)采樣孔測(cè)量熔解曲線上溫度Tm對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度；

LSFi——線性靈敏系數(shù)。

c)熔解溫度漂移和熔解溫度比

熔解溫度漂移的計(jì)算按照公式（12）計(jì)算，熔解溫度比的計(jì)算按照公式（13）計(jì)算。

()

TmiTmiTms12

TT

RTmtmaxtmin(13)

TmaxTmin

式中：

Tmi——第i個(gè)采樣測(cè)量孔熔解溫度漂移，℃；

Tmi——實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀實(shí)測(cè)Tm值，℃；

Tms——光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器Tm值，℃；

RTm——熔解溫度比；

Ttmax——所有采樣測(cè)量孔實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的Tm最大值，℃；

Ttmin——所有采樣測(cè)量孔實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的Tm最小值，℃；

Tmax——光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器設(shè)定Tm時(shí)所有測(cè)溫傳感器測(cè)定值的最大值，℃；

Tmin——光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器設(shè)定Tm時(shí)所有測(cè)溫傳感器測(cè)定值的最小值，℃。

7.2.5光學(xué)系統(tǒng)化學(xué)校準(zhǔn)法

該部分校準(zhǔn)可參照J(rèn)JF1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》7.4執(zhí)行。

校準(zhǔn)時(shí)，可按照J(rèn)JF1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》附錄A方法配置標(biāo)準(zhǔn)

物質(zhì)，并按照J(rèn)JF1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》附錄B方法配置PCR反應(yīng)

體系，也可以按照被校實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的型號(hào)或技術(shù)要求，使用已經(jīng)配置好的附有證

書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)反應(yīng)板進(jìn)行校準(zhǔn)。

11

JJF（魯）138—2022

使用已經(jīng)配置好的附有證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)反應(yīng)板進(jìn)行校準(zhǔn)前，應(yīng)震蕩混勻。

樣本示值誤差按公式（14）計(jì)算

ccccs（14）

式中：

c——樣本示值誤差，copies/μL

cc——儀器測(cè)量平均值，copies/μL

cs——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)稱值，copies/μL

樣本線性按公式（15）計(jì)算

n

(CtiCt)(lncilnc)

i1（）

rnn15

22

(CtiCt)(lncilnc)

i1i1

式中：

r——線性相關(guān)系數(shù)；

Cti——系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的第i個(gè)擴(kuò)增Ct值；

Ct——系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的Ct平均值；

lnci——系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的第i個(gè)濃度的對(duì)數(shù)值；

lnc——系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度對(duì)數(shù)值的平均值。

8校準(zhǔn)結(jié)果表達(dá)

校準(zhǔn)結(jié)果應(yīng)在校準(zhǔn)證書（報(bào)告）上反映，校準(zhǔn)證書（報(bào)告）應(yīng)至少包括以下信息：

a)標(biāo)題：如“校準(zhǔn)證書”；

b)實(shí)驗(yàn)室名稱和地址；

c)進(jìn)行校準(zhǔn)的地點(diǎn)（如果與實(shí)驗(yàn)室的地址不同）；

d)證書或報(bào)告的唯一性標(biāo)識(shí)（如編號(hào)），每頁(yè)及總頁(yè)數(shù)的標(biāo)識(shí)；

e)客戶的名稱和地址；

f)被校對(duì)象的描述和明確標(biāo)識(shí)；

g)進(jìn)行校準(zhǔn)的日期，如果與校準(zhǔn)結(jié)果的有效性和應(yīng)用有關(guān)時(shí)，應(yīng)說(shuō)明被校對(duì)象的接收

12

JJF（魯）138—2022

日期；

h)如果與校準(zhǔn)結(jié)果的有效性和應(yīng)用有關(guān)時(shí)，應(yīng)對(duì)被校樣品的抽樣程序進(jìn)行說(shuō)明；

i)對(duì)校準(zhǔn)所依據(jù)的技術(shù)規(guī)范的標(biāo)識(shí)，包括名稱及代號(hào)；

j)本次校準(zhǔn)所用測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的溯源性及有效性說(shuō)明；

k)校準(zhǔn)環(huán)境的描述；

l)校準(zhǔn)結(jié)果及其測(cè)量不確定度的說(shuō)明；

m)對(duì)校準(zhǔn)規(guī)范的偏離的說(shuō)明；

n)校準(zhǔn)證書和校準(zhǔn)報(bào)告簽發(fā)人的簽名、職務(wù)或等效標(biāo)識(shí)；

o)校準(zhǔn)結(jié)果僅對(duì)被校對(duì)象有效的聲明；

p)未經(jīng)實(shí)驗(yàn)室書面批準(zhǔn)，不得部分復(fù)制證書或報(bào)告的聲明。

校準(zhǔn)原始記錄格式見(jiàn)附錄A，校準(zhǔn)證書（報(bào)告）內(nèi)頁(yè)格式見(jiàn)附錄B。

9復(fù)校時(shí)間間隔

由于復(fù)校時(shí)間間隔的長(zhǎng)短由儀器的使用情況、使用者和儀器本身質(zhì)量等諸多因素決定，

因此送校單位可根據(jù)實(shí)際使用情況自主決定復(fù)校時(shí)間間隔。

為了確保實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀在其規(guī)定的技術(shù)性能下使用，建議復(fù)校時(shí)間間隔不超過(guò)

1年。

13

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附錄A

校準(zhǔn)原始記錄格式

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀校準(zhǔn)原始記錄參考格式

記錄編號(hào)：第X頁(yè)共X頁(yè)

基本信息

委托單位名稱：委托單位地址：

儀器名稱：制造廠商：

規(guī)格型號(hào)：出廠編號(hào)：

校準(zhǔn)依據(jù)：

標(biāo)準(zhǔn)器信息

計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)（器）名稱

計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)證書號(hào)有效期至

計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)器證書號(hào)有效期至

測(cè)量范圍準(zhǔn)確度等級(jí)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)名稱型號(hào)規(guī)格批號(hào)量值特性/不確定度證書編號(hào)有效日期

環(huán)境溫度：℃環(huán)境濕度：%RH

校準(zhǔn)員：核驗(yàn)員：

一、溫度示值誤差、溫度均勻度

設(shè)定點(diǎn)：

次數(shù)

12345

測(cè)量點(diǎn)

A1

A4

A7

A10

A12

D1

D7

D12

E4

E10

H1

H4

H7

H10

H12

14

JJF（魯）138—2022

記錄編號(hào)：第X頁(yè)共X頁(yè)

設(shè)定溫度點(diǎn)（℃）305060709095

A1

A4

A7

A10

A12

測(cè)量點(diǎn)D1

實(shí)測(cè)D7

溫度D12

平均值

E4

（℃）

E10

H1

H4

H7

H10

H12

平均值（℃）

實(shí)測(cè)最高溫度（℃）

實(shí)測(cè)最低溫度（℃）

溫度示值誤差（℃）

不確定度（℃）

溫度均勻度（℃）

二、溫度波動(dòng)度

設(shè)定點(diǎn)：

次數(shù)

12345678910

測(cè)量點(diǎn)

A1

A4

A7

A10

A12

D1

D7

D12

E4

E10

H1

H4

H7

H10

H12

15

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記錄編號(hào)：第X頁(yè)共X頁(yè)

設(shè)定溫度點(diǎn)（℃）

305060709095

Tmax-Tmin

A1

A4

A7

A10

A12

測(cè)量點(diǎn)D1

（℃）D7

D12

E4

E10

H1

H4

H7

H10

H12

溫度波動(dòng)度（℃）

三、溫度最大過(guò)沖量、平均升溫速率和平均降溫速率

設(shè)定溫度點(diǎn)（℃）305060709095

最低或最高測(cè)量值（℃）

溫度最大過(guò)沖量（℃）

平均升溫速率（℃/s）

平均降溫速率（℃/s）

四、閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）示值誤差、均勻度、精密度（光學(xué)系統(tǒng)物理項(xiàng)目）

類別熒光定量PCR儀光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器

A1

A4

A7

A10

光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)A12

器不同分

D1

布位置測(cè)

量的閾值D7

循環(huán)數(shù)D12

E4

E10

H1

H4

H7

H10

H12

16

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記錄編號(hào)：第X頁(yè)共X頁(yè)

閾值循環(huán)數(shù)示值誤差

不確定度

閾值循環(huán)數(shù)均勻度

閾值循環(huán)數(shù)精密度

五、通道峰值強(qiáng)度一致性（）、線性靈敏系數(shù)（）、熔解溫度漂移（）、熔解溫度比（）

CPHCLSFTmRTm

（光學(xué)系統(tǒng)物理項(xiàng)目）

設(shè)定值A(chǔ)iBiCiAi-BiBi-Ci

TmTmiTmiCPHCLSFRTm

（℃）（℃）（℃）

A1

A4

A7

光學(xué)A10

標(biāo)準(zhǔn)A12

器分D1

布位D7

置D12

E4

E10

H1

H4

H7

H10

H12

平均值

六、樣本示值誤差、樣本線性相關(guān)系數(shù)（光學(xué)系統(tǒng)生物化學(xué)項(xiàng)目）

樣本值：

項(xiàng)目測(cè)量值（copies/μL）

U1

U2

樣本示值誤差：樣本線性系數(shù)：

17

JJF（魯）138—2022

附錄B

校準(zhǔn)證書內(nèi)頁(yè)格式

校準(zhǔn)結(jié)果

設(shè)定溫度點(diǎn)（℃）305060709095

溫度示值誤差（℃）

溫度均勻度（℃）

溫度波動(dòng)度（℃）

溫度最大過(guò)沖量（℃）

平均升溫速率（℃/s）50℃→90℃

平均降溫速率（℃/s）90℃→50℃

閾值循環(huán)數(shù)示值誤差

閾值循環(huán)數(shù)均勻度

閾值循環(huán)數(shù)精密度

通道峰值強(qiáng)度一致性

線性靈敏系數(shù)

熔解溫度漂移（℃）

熔解溫度比

樣本示值誤差（copies/μL）

樣本線性相關(guān)系數(shù)

溫度校準(zhǔn)結(jié)果的擴(kuò)展不確定度：

閾值循環(huán)數(shù)校準(zhǔn)結(jié)果的擴(kuò)展不確定度：

以下空白

18

JJF（魯）138—2022

附錄C

溫度示值誤差測(cè)量不確定度評(píng)定示例

C.1測(cè)量方法

將實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀及PCR擴(kuò)增光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器各部件連接完好，在PCR擴(kuò)增光學(xué)標(biāo)

準(zhǔn)器的溫度傳感器表面上涂抹適量導(dǎo)熱油，將15個(gè)溫度傳感器置于儀器加熱模塊中，并

確保與加熱模塊接觸良好。按照儀器說(shuō)明書或用戶要求或推薦使用的溫度控制程序，并運(yùn)

行該程序，同時(shí)啟動(dòng)PCR擴(kuò)增光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器進(jìn)行溫度數(shù)據(jù)采集。溫度示值誤差的計(jì)算按照公

式（C.1）進(jìn)行計(jì)算。

C.2測(cè)量模型

15

1（）

TTsTiC.1

15i1

式中：

T——采樣測(cè)量孔內(nèi)溫度示值誤差，℃；

Ts——儀器設(shè)定溫度值，℃；

Ti——第i個(gè)溫度傳感器測(cè)定值，℃。

C.3不確定度來(lái)源

根據(jù)上述數(shù)學(xué)模型以及測(cè)量方法，其不確定度來(lái)源主要包括以下三個(gè)方面：

a)測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u1；

b)溫度傳感器分辨力引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u1；

c)溫度傳感器準(zhǔn)確度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u2。

C.4測(cè)量不確定度評(píng)定

C.4.1重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度分量u1

以95℃為例，對(duì)同一臺(tái)儀器，在相同的測(cè)量條件下，重復(fù)測(cè)量10次，溫度穩(wěn)定后讀

取溫度測(cè)量值，15個(gè)溫度傳感器的重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)見(jiàn)表C.1。

合并樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差按公式（C.2）計(jì)算：

mn

2

(ykjyj)

sj1k1（C.2）

pm(n1)

19

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式中：

m——測(cè)量點(diǎn)的數(shù)量；

n——每個(gè)測(cè)量點(diǎn)測(cè)量次數(shù)；

ykj——第j個(gè)測(cè)量點(diǎn)第k次的測(cè)量值，℃；

yj——第j個(gè)測(cè)量點(diǎn)測(cè)量值的平均值，℃；

表C.1溫度測(cè)量結(jié)果

次數(shù)不同測(cè)量點(diǎn)溫度傳感器測(cè)量結(jié)果（℃）

測(cè)量點(diǎn)12345678910

A195.0194.9895.0194.9594.9894.9895.0195.0495.0194.98

A495.2295.2295.2595.2595.2895.2295.1995.2295.1995.22

A794.9394.9394.9394.9694.9394.9694.9394.9994.9194.96

A1095.2695.2695.2695.2695.2695.2995.2695.2995.2695.26

A1295.4995.4095.4095.4995.4695.5295.4695.4695.5295.46

D195.0395.1595.0995.0995.0395.1295.0695.0995.0995.06

D794.9094.8794.8794.8294.9394.9094.8794.8494.8794.87

D1295.3795.2695.2995.2995.3295.2095.2995.2995.3595.29

E494.9494.8594.8594.8594.8594.9494.8894.8594.9794.91

E1095.3795.2895.3495.2895.3495.3795.3195.2895.3495.31

H195.4795.4795.5095.4795.5095.5095.4795.4795.4795.50

H495.0395.1295.0695.0695.0395.0995.0695.0695.0995.06

H795.0395.0095.0395.0095.0095.0095.0095.0695.0095.00

H1095.2595.2895.2595.3195.3195.2595.2895.2595.2595.28

H1295.0194.9895.0194.9894.9594.9895.0194.9595.0395.01

通過(guò)公式C.2計(jì)算出合并樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差如下：

=0.0313℃

sp

由于每個(gè)點(diǎn)測(cè)量5次取平均值，因此重復(fù)測(cè)量引入的不確定度分量u1為：

sp

u10.0134℃

5

'

C.4.2溫度傳感器分辨力引入的不確定度u1

溫度傳感器的分辨力為0.01℃，分散區(qū)間半寬為0.005℃，按均勻分布計(jì)算，

'

k=3，則u1為：

'0.005

u10.003℃

3

20

JJF（魯）138—2022

'

由于重復(fù)測(cè)量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u1大于分辨力引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u1，兩

者具有一定的相關(guān)性，因此在不確定度計(jì)算時(shí)不考慮由讀數(shù)分辨力引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分

'

量u1。

C.4.3溫度傳感器準(zhǔn)確度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u2；

溫度傳感器的最大允許誤差±0.1℃，按均勻分布計(jì)算，則：

0.1

u20.058℃

3

C.5合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc

22

ucu1u2=0.06℃

C.6擴(kuò)展不確定度U

取k2，則：

Ukuc=0.12℃

21

JJF（魯）138—2022

附錄D

閾值循環(huán)數(shù)示值誤差測(cè)量不確定度評(píng)定示例

D.1測(cè)量方法

將實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀及光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器各部件連接完好，將光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器置于儀器加熱模

塊中，并確保與加熱模塊接觸良好。按照儀器說(shuō)明書或用戶要求或推薦設(shè)置光學(xué)擴(kuò)增程序，

并運(yùn)行該程序，同時(shí)啟動(dòng)PCR擴(kuò)增光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器進(jìn)行溫度和光學(xué)數(shù)據(jù)采集。

示值誤差的計(jì)算按照公式（D.1）計(jì)算。

D.2測(cè)量模型

CtiCtqiCts（D.1）

式中：

Cti——閾值循環(huán)數(shù)示值誤差；

被測(cè)設(shè)備第i個(gè)采樣孔的閾值循環(huán)數(shù)；

Ctqi——

Cts——光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器第i個(gè)采樣孔的閾值循環(huán)數(shù)；

D.3不確定度來(lái)源

根據(jù)上述數(shù)學(xué)模型以及測(cè)量方法，其不確定度來(lái)源主要包括以下三個(gè)方面：

a)測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u1