1土壤和沉積物3種氯霉素類抗生素的測定液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法警告：實驗中使用的標準物質(zhì)和有機溶劑均為有毒化合物，試劑配制和樣品前處理過程應(yīng)在通風櫥內(nèi)進行；操作時應(yīng)按要求佩戴防護器具，避免吸入呼吸道或接觸皮膚和衣物。1適用范圍本標準規(guī)定了測定土壤和沉積物中3種氯霉素類抗生素的高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法。本標準適用于土壤和沉積物中氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素的測定。取樣量為1g，試樣定容體積1mL，進樣量2μl時，3種氯霉素類抗生素方法檢出限為0.4μg/kg~0.6μg/kg，測定下限為1.6μg/kg~2.4μg/kg，詳見附錄A。2規(guī)范性引用文件本標準引用了下列文件或其中的條款。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本標準。凡是未注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。其他文件被新文件廢止、修改、修訂的，新文件適用于本標準。GB17378.3海洋監(jiān)測規(guī)范第3部分：樣品采集、貯存與運輸GB17378.5海洋監(jiān)測規(guī)范第5部分：沉積物分析HJ/T91地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導HJ/T166土壤環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范HJ442.4近岸海域環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范第四部分近岸海域沉積物監(jiān)測HJ613土壤干物質(zhì)和水分的測定重量法HJ783土壤和沉積物有機物的提取加壓流體萃取法3方法原理土壤和沉積物中的氯霉素類抗生素經(jīng)甲醇-檸檬酸鹽緩沖溶液提取，固相萃取柱凈化、濃縮定容，用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜測定。根據(jù)保留時間、特征離子豐度比定性，內(nèi)標法定量。4干擾和消除當樣品中存在基質(zhì)效應(yīng)干擾時，可通過凈化樣品、優(yōu)化色譜條件、減少取樣量或進樣體積等方法2降低或消除干擾。5試劑和材料除非另有說明，分析時均使用符合國家標準的分析純試劑，實驗用水為不含目標化合物的蒸餾水或通過純水設(shè)備制備。5.1甲醇（CH3OH）：色譜純。5.2乙酸銨（NH4CH3COOH）：優(yōu)級純。5.3檸檬酸一水合物（C6H8O7·H2O）。5.4檸檬酸鈉二水合物（C6H5Na3O7·2H2O)。5.5檸檬酸溶液：0.1mol/L。稱量21.01g的檸檬酸一水合物（5.3），用水稀釋至1L。5.6檸檬酸鈉溶液：0.1mol/L。稱量29.41g的檸檬酸鈉二水合物（5.4），用水定容至1L。5.7檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液量取80mL的0.1mol/L檸檬酸溶液（5.5）和120mL的0.1mol/L檸檬酸鈉溶液（5.6），混合，即可得pH=5.0的檸檬酸-檸檬酸鈉的緩沖溶液。5.8甲醇-檸檬酸鹽緩沖溶液。量取100mL甲醇（5.1）和100mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（5.7）混勻。5.9乙酸銨溶液。稱取0.385g乙酸銨（5.2），溶于1L水中，混勻。5.10氯霉素類抗生素標準貯備液：ρ=100.0mg/L?？芍苯淤徺I市售有證標準溶液，3種氯霉素類抗生素，溶劑為甲醇，貯存液參照產(chǎn)品說明書保存。5.11氯霉素類抗生素標準使用液：ρ=1.00mg/L。移取適量抗生素標準貯備液（5.10用甲醇配制成各目標化合物質(zhì)量濃度均為1.00mg/L的標準使用液，于-18℃以下冷凍、密封、避光保存，保存期為90d。5.12替代物標準貯備液：ρ=100.0mg/L。替代物為甲砜霉素-d3，亦可選用其他性質(zhì)相近的同位素物質(zhì)作內(nèi)標。可直接購買市售有證標準溶液，溶劑為甲醇，貯備液參照產(chǎn)品說明書保存。5.13替代物標準使用液：ρ=1.00mg/L。移取適量替代物標準貯備液（5.12用甲醇配制成各目標化合物質(zhì)量濃度均為1.00mg/L的替代物使用液I，于-18℃以下冷凍、密封、避光，保存期為90d。5.14內(nèi)標貯備液：ρ=100mg/L。內(nèi)標物為氯霉素-d5，亦可選用其他性質(zhì)相近的同位素物質(zhì)作內(nèi)標。可直接購買市售有證標準溶液，溶劑為甲醇，貯備液參照產(chǎn)品說明書保存。5.15內(nèi)標使用液：ρ=1.00mg/L。移取適量內(nèi)標貯備液（5.14），用甲醇稀釋，于-18℃以下冷凍、密封、避光，保存期為90d。35.16硅藻土：粒徑250μm~850μm。（20目~60目）馬弗爐中450℃灼燒4h，稍冷卻后置于潔凈干燥器中備用。5.17石英砂：粒徑150μm～250μm（100目～60目）馬弗爐中450℃灼燒4h，稍冷卻后置于潔凈干燥器中備用。5.18固相萃取柱：填料為二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物，規(guī)格為500mg/6mL，或其他等效固相萃取柱。5.19針頭式過濾器：孔徑為0.22μm，聚四氟乙烯、聚醚砜或其他等效材質(zhì)濾膜。5.20氮氣：純度≥99.99%。5.21氬氣：純度≥99.999%。6儀器和設(shè)備6.1采樣瓶：棕色，具有聚四氟乙烯襯墊磨口玻璃瓶。6.2液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI），具備流動相梯度洗脫和質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測功能。6.3色譜柱：填料粒徑為1.7μm，柱長為100mm，內(nèi)徑為2.1mm的C18液相色譜柱，或其他等效色譜柱6.4萃取池：34mL或其他規(guī)格。6.5冷凍干燥儀。6.6提取裝置：加壓流體萃取儀等性能相當?shù)脑O(shè)備。6.7濃縮裝置：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、氮吹儀或其他同等性能的設(shè)備。6.8固相萃取裝置：自動或手動，流速可調(diào)節(jié)。6.9進樣瓶：棕色玻璃瓶，2mL。6.10樣品篩：不銹鋼材質(zhì)，孔徑為250μm（60目）。6.11一般實驗室常用儀器和設(shè)備。7樣品7.1樣品采集和保存分別按照HJ/T166、HJ/T91、HJ442.4、GB17378.3的相關(guān)要求采集和保存土壤和沉積物樣品。樣品應(yīng)置于潔凈的采樣瓶（6.1）中，4℃以下避光、冷藏保存，7d內(nèi)完成提取。7.2樣品的制備除去樣品中的異物（枝棒、葉片、石子等），自然陰干或冷凍干燥后，研磨、均質(zhì)、過樣品篩（6.10）。7.3水分的測定土壤樣品干物質(zhì)含量測定按照HJ613執(zhí)行，沉積物樣品含水率測定按照GB17378.5執(zhí)行。47.4試樣制備7.4.1提取稱取1g試樣（可根據(jù)試樣中待測化合物濃度適當增加或減少取樣量加入10μl替代物（5.13）混勻后，置于萃取池（6.4）中，將萃取池（6.4）置于提取裝置（6.6）中，以甲醇-檸檬酸鹽緩沖溶液（5.8）為提取溶劑，按以下參考條件進行提?。禾崛囟葹?0℃,提取壓力為10.34KPa，靜態(tài)提取時間為15min，淋洗體積為60%池體積，氮氣（5.20）吹掃時間為120s，循環(huán)次數(shù)為2次，收集提取液，并用實驗室水稀釋至500mL，待凈化。7.4.2凈化將固相萃取柱（5.18）固定在固相萃取裝置（6.8）上，依次用10mL甲醇（5.1）、10mL水活化固相萃取柱（5.18）。將提取液（7.4.1）以8ml/min～10ml/min的流速通過固相萃取柱后，用10mL水淋洗固相萃取柱（5.18），然后用真空泵抽氣干燥小柱或用氮氣（5.20）吹干小柱。再用10mL甲醇（5.1）以1ml/min～3ml/min的流速洗脫固相萃取柱，收集洗脫液。7.4.3濃縮定容用濃縮裝置（6.7）將洗脫液（7.4.2）濃縮至近干，用甲醇（5.1）定容至1.0mL，加入10.0μl內(nèi)標使用液（5.15），混勻后經(jīng)針頭式過濾器（5.19）過濾至進樣瓶（6.9）中，密封、避光，-18℃以下冷凍保存，15d內(nèi)完成分析。7.5空白試樣制備用石英砂（5.17）代替樣品，按照與試樣制備（7.4）相同步驟制備空白試樣。8分析步驟8.1儀器參考條件8.1.1液相色譜參考條件進樣體積：2μl；柱溫：40oC。表1梯度洗脫程序058.1.2質(zhì)譜參考條件離子源溫度：400℃；霧化氣壓力：50psi；輔助加熱氣壓力：50psi；氣簾氣壓力：35psi；多反應(yīng)監(jiān)測條件參見表2。表2質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測條件12345-8.1.3質(zhì)譜儀調(diào)諧按照儀器使用說明書調(diào)諧儀器并確認儀器性能，儀器性能正常后測定樣品。8.2校準8.2.1標準系列的配制分別移取適量的氯霉素類抗生素標準使用液（5.11）、替代物使用液（5.13），于進樣瓶（6.9）中，用甲醇（5.1）配制不少于5個濃度點的標準系列，目標化合物和替代物的質(zhì)量濃度分別為1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、和100μg/L（此為參考濃度）。1mL標準系列中加入10μL內(nèi)標使用液（5.15），混勻，待測。8.2.2標準系列的測定照儀器參考條件（8.1），由低濃度到高濃度依次對標準系列溶液進行測定。記錄各目標化合物、提取內(nèi)標、進樣內(nèi)標的保留時間和定量離子峰面積。各總離子色譜圖見圖1。6/4\/51——甲砜霉素；2——甲砜霉素-d3(替代物3——氟苯尼考；4——氯霉素；5——氯霉素-d5(內(nèi)標）。圖1各目標化合物、替代物及內(nèi)標物的總離子流圖8.2.3用最小二乘法繪制標準曲線以標準系列溶液中目標化合物物的質(zhì)量濃度為橫坐標，以其對應(yīng)峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值和內(nèi)標物濃度的乘積為縱坐標，建立標準曲線。8.2.4平均相對響應(yīng)因子計算標準系列中第j點目標化合物i的相對響應(yīng)因子（RRFij按照公式（1）計算。（1）式中：RRFij——標準系列中第j點目標化合物i的相對響應(yīng)因子；Aij——標準系列中第j點目標化合物i定量離子的峰面積；Ais,ij——標準系列中第j點目標化合物i相對應(yīng)的內(nèi)標物定量離子的峰面積；pis,ij——標準系列中第j點目標化合物i對應(yīng)內(nèi)標物的質(zhì)量濃度，μg/L；pij——標準系列中第j點目標化合物i的質(zhì)量濃度，μg/L。標準系列中目標化合物i的平均相對響應(yīng)因子（RRFi按照公式（2）計算。（2）式中：RRFi——標準系列中目標化合物i的平均相對響應(yīng)因子；RRFij——標準系列中第j點目標化合物i的相對響應(yīng)因子；n——標準系列點數(shù)。78.3試樣測定按照與標準系列的配制與測定（8.2.1）相同的儀器條件進行試樣（7.4）測定。8.4空白試驗按照與試樣測定（8.3）相同的儀器條件進行空白試樣（7.5）的測定。9結(jié)果計算與表示9結(jié)果計算與表示9.1定性分析根據(jù)保留時間與離子對豐度比例定性分析。在相同的實驗條件下，試樣中目標化合物的保留時間與標準溶液中該目標化合物的保留時間比較，相差±0.2min以內(nèi)；樣品中各目標化合物定性離子的相對豐度（Ksam,i）與濃度接近的標準溶液中對應(yīng)的定性離子相對豐度（Kstd,i）進行比較，所得偏差在表3規(guī)定的最大允許偏差范圍內(nèi)，則可判定樣品中存在該目標化合物。Kstd,i和Kstd,i分別按照公式（3）和公式（4）計算。（3）式中：Ksam,i——試樣中目標化合物i定性離子的相對豐度，%；Asam2,i——試樣中目標化合物i定性離子的響應(yīng)值；Asam1,i——試樣中目標化合物i定量離子的響應(yīng)值。（4）式中：Kstd,i——標準溶液中目標化合物i定性離子的相對豐度，%；Astd2,i——標準溶液中目標化合物i定性離子的響應(yīng)值；Astd1,i——標準溶液中目標化合物i定量離子的響應(yīng)值。表3相對離子豐度的最大允許偏差Kstd（%）Ksam最大允許偏差（%）Kstd,i＞5020＜Kstd,i≤5010＜Kstd,i≤20Kstd,i≤1089.2定量分析9.2.1平均相對響應(yīng)因子法土壤樣品中目標化合物i的質(zhì)量濃度按照公式（5）計算：式中：wi——樣品中目標化合物i的含量，μg/kg；Ac,i——樣品中目標化合物i定量離子的峰面積；ρis——內(nèi)標物的質(zhì)量濃度，μg/L；Vc——試樣定容的體積，ml；m——試樣稱樣量，g；wdm——試樣干物質(zhì)含量，%；A ——內(nèi)標物定量離子的峰面積；ARRFi——目標化合物i的平均相對響應(yīng)因子；D——稀釋倍數(shù)。沉積物樣品中目標化合物i的質(zhì)量濃度按照公式（6）計算：式中：wi——樣品中目標化合物i的含量，μg/kg；Ac,i——樣品中目標化合物i定量離子的峰面積；ρis——內(nèi)標物的質(zhì)量濃度，μg/L；Vc——試樣定容的體積，ml；m——試樣稱樣量，g；wH2O——試樣含水率，%；A ——內(nèi)標物定量離子的峰面積；ARRFi——目標化合物i的平均相對響應(yīng)因子；D——稀釋倍數(shù)。9.2.2最小二乘法土壤樣品中目標化合物i的質(zhì)量濃度按照公式（7）計算：（7）式中：wi——樣品中目標化合物i的含量，μg/kg；ρc，i——試樣中目標化合物i的質(zhì)量濃度，μg/L；Vc——試樣定容的體積，ml；m——試樣稱樣量，g；wdm——試樣干物質(zhì)含量，%；D——稀釋倍數(shù)。沉積物樣品中的目標化合物含量i的質(zhì)量濃度按照公式（8）進行計算：式中：wi——樣品中目標化合物i的含量，μg/kg；ρc，i——試樣中目標化合物i的質(zhì)量濃度，μg/L；Vc——試樣定容的體積，ml；m——試樣稱樣量，g；wH2O——試樣含水率，%；D——稀釋倍數(shù)。9.3結(jié)果表示測定結(jié)果小數(shù)點后位數(shù)的保留與方法檢出限一致，最多保留3位有效數(shù)字。10準確度10.1精密度6家實驗室，分別對2μg/kg、10μg/kg和90μg/kg的空白加標樣品進行了6次重復測定，實驗室內(nèi)相對標準偏差分別為6.3%~15%、3.2%~11%和1.3%~11%；實驗室間相對標準偏差分別為14%~33%、6.7%~17%和6.3%~10%；重復性限分別為：0.27μg/kg~0.34μg/kg、1.2μg/kg~1.6μg/kg6家實驗室，分別對2μg/kg、10μg/kg和90μg/kg的土壤樣品進行了6次重復測定，實驗室內(nèi)相對標準偏差分別為2.8%~20%、3.1%~19%和2.5%~9.9%；實驗室間相對標準偏差分別為13%~21%、8.6%~17%和6.4%~13%；重復性限分別為：0.26μg/kg~0.35μg/kg、1.7μg/kg~2.4μg/kg和9.8μg/kg~13μg/kg；再現(xiàn)性限分別為：0.49μg/kg~0.85μg/kg、2.4μg/kg~3.8μg/kg和16μg/kg~26μg/kg。~2.2μg/kg6家實驗室，分別對2μg/kg、10μg/kg和90μg/kg的沉積物加標樣品進行了6次重復測定，實驗室內(nèi)相對標準偏差分別為3.0%~19%、2.3%~15%和2.0%~13%；實驗室間相對標準偏差分別為14%~28%、10%~23%和7.0%~12%；重復性限分別為：0.29μg/kg~0.37μg/kg、1.7~2.2μg/kg9和8.9μg/kg~9.93μg/kg；再現(xiàn)性限分別為：0.50μg/kg~0.98μg/kg、3.0μg/kg~5.1μg/kg和14μg/kg~21μg/kg。精密度結(jié)果統(tǒng)計參見附錄C中表C.1。10.2正確度6家實驗室，分別對2μg/kg、10μg/kg和90μg/kg的空白加標樣品進行了6次重復測定，加標回收率分別為41.6%~98.6%、45.9%~108%和54.5%~87.4%；加標回收率最終值分別為54.3%±15%~60.8%±40%、66.6%±22%~83.3%±24%和66.1%±13%~77.6%±16%。6家實驗室，分別對2μg/kg、10μg/kg和90μg/kg的土壤樣品進行了6次重復測定，加標回收率分別為43.3%~97.7%、42.1%~92.4%和54.1%~89.1%；加標回收率最終值分別為55.4%±14%~69.1%±30%、63.1%±22%~76.1%±18%和65.8%±17%~79.4%±18%。6家實驗室，分別對2μg/kg、10μg/kg和90μg/kg的沉積物加標樣品進行了6次重復測定，加標回收率分別為41.9%~95.3%、4252.0%±14%~60.9%±34%、74.1%±34%~90.7%±28%和58.6%±14%~67.0%±15%。正確度統(tǒng)計結(jié)果參見附錄C中表C.2。11質(zhì)量保證和質(zhì)量控制11.1空白試驗每20個樣品或每批次(≤20個樣品/批）應(yīng)至少分析1個空白樣品，測定結(jié)果應(yīng)低于方法檢出限。11.2校準采用平