ICS?FORMTEXT65.020.20CCSBXXDBFORMTEXT23/TXXXX-XXXXFORMTEXT?????水稻稻瘟病抗譜鑒定技術規(guī)程（征求意見稿）主要起草單位：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所聯(lián)系人：馬軍韜聯(lián)系信箱：mmmjjjttt@163.com聯(lián)系電話XXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施黑龍江省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB23DB23DB23/TXXXX-XXXX前??言本文件按照GB/T1.1-2020《文件化工作導則第1部分：文件化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由黑龍江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件起草單位：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所。本文件主要起草人：張國民、馬軍韜、鄧凌韋、趙文生、宋顯東、彭友良、王春榮、胡亞軍、王永力、張齊鳳、高洪儒、張君、王南博、任洋。水稻稻瘟病抗譜鑒定技術規(guī)程范圍本文件規(guī)定了水稻稻瘟病抗譜鑒定技術的術語與定義、環(huán)境條件、技術流程、評價標準和技術檔案。本文件適用于水稻品種等材料對稻瘟病的抗譜鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用性文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB3095環(huán)境空氣質量標準GB5084農(nóng)田灌溉水質標準GB15618土壤環(huán)境質量農(nóng)用地土壤污染風險管控標準（試行）GB/T15790稻瘟病測報調查規(guī)范DB51/T714水稻抗稻瘟病性田間鑒定技術規(guī)范DB/T2735-2020水稻穗頸瘟人工接種鑒定技術規(guī)程術語與定義下列術語與定義適用于本文件。水稻稻瘟病由絲狀子囊真菌稻瘟病菌（有性態(tài)為Magnaportheoryzae，無性態(tài)為Pyriculariaoryzae）引起的水稻真菌病害。依據(jù)病害發(fā)生的時期和部位，稻瘟病可分為苗瘟、葉瘟、葉枕瘟、穗頸瘟、枝梗瘟、粒瘟和莖節(jié)瘟。3.2葉瘟葉瘟發(fā)生于三葉期后的秧苗或成株葉片上，一般從分蘗期至拔節(jié)期盛發(fā)，葉上病斑可分為慢性型、急性型、白點型和褐點型。3.3抗瘟性植物體所具有的能夠減輕或克服稻瘟病菌致病作用的可遺傳性狀。3.4抗譜根據(jù)采用的技術標準判別水稻品種等材料對稻瘟病的抵抗能力，抗譜計算公式為：A=（B/C）×100（3）式中：——抗譜，%；——接種后表現(xiàn)抗病反應型的菌株數(shù)，個；——總接種菌株數(shù)，個。3.5接種體能夠侵染水稻植株并引起病害的病原體。3.6人工接種在適宜條件下，通過人工操作將接種體置于水稻植株適當?shù)牟课徊⑹怪l(fā)病的過程。3.7番茄燕麥培養(yǎng)基用于稻瘟病菌的培養(yǎng)。1L培養(yǎng)基中含有燕麥片40g，番茄汁150mL，瓊脂粉20g。將燕麥片水煮20min，紗布濾去殘渣。番茄榨汁紗布過濾，取其汁液倒入過濾好的燕麥片汁液中，加入瓊脂粉，定溶至1L，滅菌后使用。4環(huán)境條件鑒定時的環(huán)境條件，環(huán)境空氣質量應符合GB3095規(guī)定；土壤環(huán)境質量應符合GB15618規(guī)定；育苗噴灌用水質量應符合GB5084規(guī)定。5技術流程5.1水稻苗的種植與管理5.1.1水稻品種的選擇以縣或縣級市為單位，以明確當?shù)厮酒贩N抗瘟性為目的，在擬開展水稻稻瘟病抗譜鑒定的縣或縣級市選擇主栽或高潛力水稻品種10份-15份用于試驗。同時，在開展試驗的縣或縣級市，選擇稻瘟病發(fā)生較重地塊，種植普感品種麗江新團黑谷或蒙古稻，用于采集、分離當?shù)氐牡疚敛【辍?.1.2浸種催芽稱取適量的供試水稻種子。先用自來水充分漂洗，去除癟籽和雜質；再用清水浸泡2-4d，每天換水，直至種子露白；接著于37℃催芽，至胚根長至約0.5cm時，用于播種。5.1.3播種選取發(fā)芽一致的種子，采用點播方式用鑷子將水稻種子穴播于128孔塑料育秧盤內(nèi)（54cm×28cm×4cm），每孔播種4-5粒，3次重復，播種后將育秧盤置于溫室苗床上。其上覆蓋約1cm厚的干細土。如果在冬季種植，覆蓋的干細土要稍厚，且要在苗床上覆蓋塑料薄膜保溫。5.1.4水稻苗管理水稻種植全過程進行常規(guī)管理，在3葉1心期可適當補施氮肥，全程不施用任何殺菌劑和殺蟲劑。5.2接種體制備稻瘟病菌分生孢子懸浮液可作為抗譜鑒定的接種體。5.2.1倒產(chǎn)孢板用微波爐融化番茄燕麥培養(yǎng)基，倒入6cm玻璃小皿（超過培養(yǎng)皿厚度的2/3），凝固后備用。5.2.2涂斷菌絲將供試稻瘟病菌株接種在番茄燕麥培養(yǎng)基上，于26℃-28℃條件下培養(yǎng)，待其菌落直徑長至接近培養(yǎng)基邊緣時，加入少量無菌水，用滅菌棉簽輕輕洗下菌絲和分生孢子，將其懸浮液均勻涂于另一新的平板培養(yǎng)基上（培養(yǎng)基要適當硬一些），超凈工作臺內(nèi)吹干，置于26℃-28℃培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)。5.2.3洗菌培養(yǎng)約36h-48h，待培養(yǎng)基表面長出一層稀疏的氣生菌絲體。向菌落上加少量無菌水，用滅菌棉簽輕輕擦去表面的氣生菌絲，并用無菌水將培養(yǎng)基表面的菌絲和分生孢子沖洗干凈，待培養(yǎng)基表面晾干后罩上2層紗布，用皮筋綁好，于26℃-28℃條件下光照培養(yǎng)至有大量分生孢子產(chǎn)生5.2.4分生孢子懸浮液制備將含0.025%Tween20的滅菌水輕輕倒入培養(yǎng)皿，用棉簽將菌落表面形成的分生孢子洗下，濾去殘渣后移至離心管中。充分混勻后用血球計數(shù)板測定孢子濃度，3次重復后取平均值。用含0.025%Tween20的滅菌水將分生孢子懸浮液濃度調至3×105個孢子/mL，供接種使用。注意：分生孢子懸浮液需現(xiàn)用現(xiàn)配，從配制到完成接種不得超過2h。5.3人工接種流程5.3.1葉片準備在水稻苗中選取充分展開的心葉（葉齡在5葉-7葉），取其中下部，剪成長約5cm、上下寬度基本一致的葉段，用滅菌昆蟲針在葉片正面、垂直于葉脈方向輕輕劃出微創(chuàng)點，每個葉段均勻劃出3個微創(chuàng)點，每個點長2mm-5mm。將2層略小于培養(yǎng)皿底且已滅菌的濾紙片平鋪于直徑9cm的玻璃或塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，加無菌水浸濕，確保表面無明水。將滅菌牙簽放入滅菌水浸泡10min-20min，取2根滅菌牙簽放在浸濕的濾紙片表面，將已劃出微創(chuàng)點的葉段擺放其上，注意微創(chuàng)點不要擺放在牙簽上。用0.025%Tween20水溶液對葉段均勻噴霧，培養(yǎng)皿蓋內(nèi)側同時噴霧。5.3.2人工接種用微量移液器吸取分生孢子懸浮液點接于葉段的微創(chuàng)點，每個微創(chuàng)點點接分生孢子懸浮液5μL-10μL，蓋上培養(yǎng)皿蓋。將接種后的葉段在26℃-28℃、完全黑暗和相對濕度100%的條件下24h-30h，然后在26℃-28℃、全光照條件下保濕培養(yǎng)，根據(jù)濕度情況每天噴水1次-2次，隨時觀察葉片發(fā)病情況，在發(fā)病最佳期完成調查和拍照。5.4病情調查5.4.1調查時間根據(jù)不同水稻品種接種葉段的具體發(fā)病情況，在接種后72h-168h進行調查和拍照。5.4.2抗感反應型調查標準主要進行葉瘟的評價。接種點部位無病斑或僅有很小的黑褐色壞死斑，不具備產(chǎn)生分生孢子能力，記為抗病反應型；接種點部位病斑較大，呈梭形，中心有灰色的崩潰部，可以產(chǎn)生菌絲和分生孢子，崩潰部邊緣可能有褐色壞死，最外層是黃色的中毒部，形狀不規(guī)則，記為感病反應型。5.4.3調查方法每個水稻品種接種供試稻瘟病菌株后的9個接種點全部調查，記錄抗感反應型，結果記入表A.1。6評價標準6.1接種有效性評價標準每次接種均以普感品種麗江新團黑谷為對照，對照表現(xiàn)為典型的感病反應型時，視為接種有效。6.2重復性接種判定標準在第一次接種后，供試菌株表現(xiàn)為抗病反應型或者不能準確判定其反應型，需要進行第二次和第三次接種，只有其中一次表現(xiàn)為感病反應型，則記為為感病反應型，否則記為抗病反應型。6.3供試菌株數(shù)量標準室內(nèi)鑒定水稻品種的抗瘟性，供試菌株必須為單孢菌株，且必須從適宜種植區(qū)內(nèi)種植的普感品種麗江新團黑谷或蒙古稻上分離獲得。為確保供試菌株具有足夠的地域代表性，建議菌株數(shù)量每個縣或縣級市不少于300株，或者連續(xù)3年、每年不少于100株。6.4抗瘟性評價標準依據(jù)各縣或縣級市水稻品種室內(nèi)抗譜的高低評價其在當?shù)靥镩g抗瘟性的優(yōu)劣，評價標準見表A.2。7技術檔案建立水稻稻瘟病抗譜鑒定技術檔案，內(nèi)容包括環(huán)境條件、技術流程、評價標準及試驗數(shù)據(jù)等。

附錄A資料性附錄水稻稻瘟病抗譜調查A.1水稻稻瘟病抗譜調查見表A.1和A.2。表A.1供試菌株抗感反應型調查記錄表調查時間：水稻品種名稱：生育期：供試菌株編號供試菌株名稱反應型12