一、引言1.1BET蛋白概述BET蛋白家族作為表觀遺傳學領域的關鍵調(diào)控因子，在生物體內(nèi)發(fā)揮著不可或缺的作用。該家族包含四個異構體，分別為BRD2、BRD3、BRD4和BRDT。這四個成員在結構上具有顯著的相似性，均含有兩個在序列上高度保守的溴結構域（BD1、BD2）和一個超末端結構域（ET）。溴結構域是BET蛋白識別并結合乙?；嚢彼幔↘Ac）的關鍵元件，每個溴結構域由約110個氨基酸組成，通過特定的空間構象形成一個能夠容納乙?；嚢彼岬氖杷诖D1和BD2雖然高度同源，但它們對乙酰化組蛋白肽靶序列的識別模式存在差異，這也決定了它們在生物學功能上可能具有不同的側重點。超末端結構域（ET）則與多種輔助因子相互作用，進一步拓展了BET蛋白在細胞內(nèi)的功能網(wǎng)絡，參與調(diào)控基因轉錄、染色質重塑等重要的生物學過程。在基因轉錄過程中，BET蛋白通過其溴結構域與染色質上乙酰化的賴氨酸殘基緊密結合，從而將自身錨定在染色質特定區(qū)域。以BRD4為例，它能夠招募正向轉錄延伸因子b（P-tefb），使P-tefb與靶基因轉錄區(qū)上的乙酰化組蛋白相結合。隨后，P-tefb磷酸化RNA聚合酶Ⅱ（polⅡ）C端結構域的Brd4敏感性誘導因子和負性轉錄延伸因子，促使RNApolⅡ從近端啟動子區(qū)域解離，解除負性延伸因子對轉錄的抑制作用，進而推動RNApolⅡ依賴性的基因轉錄過程，確保基因信息能夠準確地從DNA傳遞到RNA，為后續(xù)蛋白質的合成提供模板。在染色質重塑方面，BET蛋白的結合能夠改變?nèi)旧|的空間構象，影響染色質與其他轉錄調(diào)控因子的相互作用。當BET蛋白結合到染色質上時，它可以通過與其他染色質重塑復合物相互協(xié)作，調(diào)整核小體的位置和結構，使原本緊密纏繞的染色質變得更加松散，從而增加染色質對轉錄因子的可及性，促進基因的表達；或者反之，使染色質結構更加緊密，抑制基因的轉錄。這種對染色質結構的動態(tài)調(diào)控在細胞的分化、發(fā)育以及疾病的發(fā)生發(fā)展過程中都起著關鍵作用。1.2BET蛋白與疾病的關系BET蛋白在多種疾病的發(fā)生發(fā)展進程中扮演著關鍵角色，其異常表達或功能失調(diào)與腫瘤、炎癥等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。在腫瘤領域，BET蛋白被發(fā)現(xiàn)對癌基因轉錄具有重要的調(diào)控作用。以BRD4為例，在急性髓系白血?。ˋML）中，轉錄因子會招募賴氨酸乙酰轉移酶p300至染色質，使得染色質上的轉錄因子發(fā)生乙?；揎?，而這些乙酰化的轉錄因子能夠直接與BRD4結合，從而促使BRD4與AML基因組相結合。與此同時，BRD4還可以募集正向轉錄延伸因子b（P-tefb），P-tefb能夠磷酸化RNA聚合酶II以及暫停因子DSIF和NELF，推動轉錄伸長，為白血病細胞的增殖和存活提供必要的基因表達支持，維持腫瘤細胞的惡性生物學行為。在乳腺癌中，Brd4的不同亞型發(fā)揮著不同的作用。Brd4-S通過與同源轉錄因子En1相互作用，激活相關的細胞外基質網(wǎng)絡，為腫瘤細胞營造適宜的微環(huán)境，進而促進腫瘤細胞的生長和轉移；而Brd4-L則可抑制生長因子誘導的細胞遷移和癌癥干細胞的增殖，從而對腫瘤的轉移和進展起到抑制作用。這種同一蛋白不同亞型在腫瘤發(fā)展中的差異性功能，進一步凸顯了BET蛋白在腫瘤調(diào)控中的復雜性和多樣性。在三陰性乳腺癌（TNBC）細胞中，蛋白磷酸酶2A活性的降低會導致Brd4酸性區(qū)域磷酸化水平增加，進而促進腫瘤的進展。相關研究表明，BET抑制劑（BETi）可下調(diào)Brd4的表達，為TNBC的治療提供了新的策略和希望。在膠質母細胞瘤（GBM）中，Brd4通過多種途徑介導GBM的性別差異，并使男性和女性GBM細胞對BETi具有差異敏感性。一方面，Brd4結合位點常出現(xiàn)在富含H3K27ac的基因區(qū)域附近，而男性GBM細胞中的高活性Brd4增強子區(qū)域富集了大量H3K27ac；另一方面，在男性和女性GBM細胞中，Brd4存在兩種不同的轉錄狀態(tài)。具有男性結合偏向的Brd4，其增強子處的轉錄因子包括癌基因蛋白和干細胞標志物，如Myc、Klf5和Oct4；而具有女性結合偏向的Brd4，其增強子處的轉錄因子有腫瘤抑制功能，如p53和Smad4。這種性別差異和轉錄狀態(tài)的不同，使得Brd4在GBM的發(fā)生發(fā)展中扮演著更為復雜的角色，也為GBM的個性化治療提供了潛在的靶點和方向。在炎癥相關疾病方面，BET蛋白參與了炎癥因子表達的調(diào)控過程。當機體受到炎癥刺激時，BET蛋白會與炎癥相關基因的染色質區(qū)域結合，通過招募相關的轉錄調(diào)控因子，促進炎癥因子如白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的轉錄表達。在巨噬細胞中，脂多糖（LPS）刺激會引發(fā)BET蛋白與炎癥基因啟動子區(qū)域的結合增強，從而上調(diào)IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達，加劇炎癥反應。而使用BET抑制劑能夠阻斷BET蛋白與染色質的結合，抑制炎癥因子的轉錄，減輕炎癥反應，為炎癥相關疾病的治療提供了新的思路和方法。在慢性阻塞性肺疾?。–OPD）中，炎癥反應是其發(fā)病的重要機制之一。研究發(fā)現(xiàn)，BET蛋白在COPD患者的肺組織中表達上調(diào)，并且與炎癥細胞的浸潤和炎癥因子的釋放密切相關。通過抑制BET蛋白的功能，可以減少炎癥細胞的活化和炎癥因子的產(chǎn)生，緩解氣道炎癥和肺組織損傷，為COPD的治療提供了潛在的治療靶點。在心血管疾病方面，BET蛋白也參與了心肌纖維化、心力衰竭等病理過程。在心肌纖維化過程中，BET蛋白通過調(diào)控成纖維細胞的活化和增殖，促進膠原蛋白的合成和沉積，導致心肌組織的纖維化程度加重。在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中，BET蛋白介導的炎癥反應和細胞間通訊異常也起到了重要作用。研究表明，使用BET抑制劑可以改善心肌功能，減輕心肌纖維化和炎癥反應，為心血管疾病的治療提供了新的治療策略和方向。1.3BET蛋白抑制劑研究現(xiàn)狀自BET蛋白被確認為潛在的藥物靶點以來，針對BET蛋白的抑制劑研究取得了顯著進展。早期的研究主要集中在開發(fā)泛BET抑制劑，這些抑制劑能夠同時抑制BET蛋白家族中多個成員的活性。例如，JQ1作為首個被報道的BET小分子抑制劑，能夠與BET蛋白的溴結構域緊密結合，阻斷其與乙?；嚢彼岬南嗷プ饔茫瑥亩蓴_BET蛋白介導的基因轉錄調(diào)控過程。在急性髓系白血?。ˋML）的研究中，JQ1能夠抑制白血病細胞的增殖，誘導細胞凋亡，展現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性；在炎癥模型中，JQ1可以抑制炎癥相關基因的表達，減輕炎癥反應。隨著研究的深入，越來越多的泛BET抑制劑被開發(fā)出來，如OTX015、IBET762等。OTX015在多種腫瘤細胞系中表現(xiàn)出抑制細胞增殖和誘導凋亡的作用，在淋巴瘤細胞系中，OTX015能夠下調(diào)與腫瘤細胞增殖和存活相關的基因表達，抑制腫瘤細胞的生長；IBET762則在動物模型中顯示出對炎癥和腫瘤的治療潛力，在小鼠炎癥模型中，IBET762能夠有效降低炎癥因子的水平，緩解炎癥癥狀。這些泛BET抑制劑在臨床前研究中展現(xiàn)出了一定的治療潛力，部分已經(jīng)進入臨床試驗階段，用于評估其在人體中的安全性和有效性。盡管泛BET抑制劑在疾病治療方面展現(xiàn)出了一定的前景，但它們也面臨著諸多挑戰(zhàn)。在臨床研究中，一些泛BET抑制劑表現(xiàn)出了劑量限制毒性，包括惡心、嘔吐、血小板減少等不良反應，限制了藥物的使用劑量和治療效果。在一項針對OTX015的臨床試驗中，部分患者在接受治療后出現(xiàn)了嚴重的胃腸道反應，導致藥物劑量不得不降低，從而影響了治療的有效性。一些泛BET抑制劑的抗腫瘤活性在臨床研究中低于預期，可能是由于未能準確篩選出對藥物敏感的患者群體，導致藥物在部分患者中無法發(fā)揮最佳療效。耐藥問題也是泛BET抑制劑面臨的一大挑戰(zhàn)，長期使用泛BET抑制劑可能導致腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，使藥物的療效逐漸降低。為了克服泛BET抑制劑的局限性，開發(fā)具有更高選擇性的BET抑制劑成為了當前研究的熱點。由于BD1和BD2雖然高度同源，但它們對乙?；M蛋白肽靶序列的識別模式存在差異，這為開發(fā)針對BD1和BD2的選擇性抑制劑提供了可能。開發(fā)BD1和BD2選擇性抑制劑具有重要的意義。從生物學功能角度來看，BD1和BD2在基因調(diào)控網(wǎng)絡中可能發(fā)揮著不同的作用。研究表明，BD1在某些基因的啟動子區(qū)域富集，而BD2則更多地參與到基因的增強子區(qū)域的調(diào)控，這意味著針對BD1和BD2的選擇性抑制劑可能會對不同的基因表達譜產(chǎn)生影響，從而實現(xiàn)更精準的疾病治療。在腫瘤治療中，BD1選擇性抑制劑可能會特異性地抑制腫瘤細胞中與增殖相關的基因表達，而BD2選擇性抑制劑則可能更側重于抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲相關基因。從臨床應用角度來看，BD1和BD2選擇性抑制劑有望提高治療的安全性和有效性。由于選擇性抑制劑能夠更精準地作用于特定的靶點，減少對其他非目標蛋白的影響，從而降低藥物的副作用。對于一些對泛BET抑制劑耐受性較差的患者，BD1或BD2選擇性抑制劑可能提供更好的治療選擇，提高患者的生活質量和治療依從性。在炎癥相關疾病的治療中，選擇性抑制劑可以在有效抑制炎癥反應的同時，減少對正常生理功能的干擾，降低藥物的不良反應。二、兩類靶向BET蛋白選擇性抑制劑的設計原理2.1BD1選擇性抑制劑的設計思路2.1.1基于結構的設計策略BET蛋白的BD1結構域具有高度保守的結構特征，其核心由4個向左旋轉的α螺旋（αZ、αA、αB和αC）構成，這些螺旋通過特定的空間排列形成了一個緊密的螺旋束。在螺旋束的兩端，連接αZ與αA的ZAloop以及連接αB與αC的BCloop，它們像靈活的“手臂”一樣，與螺旋束的末端共同構成了乙?；嚢彼峤Y合口袋。這個口袋是BD1發(fā)揮功能的關鍵區(qū)域，其內(nèi)部的氨基酸殘基通過精確的空間構象和化學性質，特異性地識別并結合乙酰化賴氨酸，從而啟動BET蛋白在基因轉錄調(diào)控等生物學過程中的作用?；贐D1的這種結構特點，設計BD1選擇性抑制劑時，研究人員主要從模擬乙?；嚢彼崤cBD1的結合模式入手。他們通過計算機輔助藥物設計（CADD）技術，利用X射線晶體學、核磁共振（NMR）等結構生物學方法獲得的BD1三維結構信息，構建精確的分子模型。在模型中，深入分析乙?；嚢彼崤c結合口袋內(nèi)氨基酸殘基之間的相互作用，包括氫鍵、范德華力、疏水相互作用等。研究發(fā)現(xiàn)，乙?；嚢彼岬囊阴；軌蚺cBD1結合口袋中的保守氨基酸殘基形成穩(wěn)定的氫鍵，如與αZ螺旋上的天冬酰胺殘基形成氫鍵，這種氫鍵相互作用對于維持BD1與乙酰化賴氨酸的結合穩(wěn)定性至關重要。同時，賴氨酸的脂肪鏈部分則與結合口袋內(nèi)的疏水氨基酸殘基形成疏水相互作用，進一步增強了兩者的結合力。根據(jù)這些相互作用特征，研究人員設計抑制劑時，會引入能夠模擬乙酰化賴氨酸結構的基團。設計具有特定長度和空間取向的酰基部分，使其能夠與BD1結合口袋中的天冬酰胺等殘基形成類似的氫鍵；同時，合理設計與脂肪鏈部分對應的疏水基團，使其能夠與口袋內(nèi)的疏水氨基酸殘基相互作用，從而占據(jù)乙?；嚢彼岬慕Y合位點，阻斷BD1與乙酰化賴氨酸的結合。研究人員還會關注結合口袋周邊氨基酸殘基的特性。結合口袋周邊的一些氨基酸殘基雖然不直接參與與乙酰化賴氨酸的結合，但它們對結合口袋的空間構象和化學環(huán)境有著重要影響。通過對這些周邊氨基酸殘基的分析，設計抑制劑時可以引入一些能夠與周邊殘基形成特異性相互作用的基團，如可以引入能夠與周邊帶電荷氨基酸殘基形成靜電相互作用的基團，進一步增強抑制劑與BD1的結合特異性和親和力，提高抑制劑對BD1的選擇性。2.1.2已有BD1選擇性抑制劑案例分析iBET-BD1（GSK778）作為一種典型的BD1選擇性抑制劑，在BET蛋白抑制劑研究領域備受關注。它的化學結構為C??H??N?O?，相對分子質量為511.61。iBET-BD1對BET蛋白BD1溴結構域展現(xiàn)出極高的選擇性抑制活性，其對BRD2BD1、BRD3BD1、BRD4BD1和BRDTBD1的IC??值分別為75nM、41nM、41nM和143nM，而對BD2的抑制活性則顯著降低，對BRD2BD2、BRD3BD2、BRD4BD2和BRDTBD2的IC??值分別為3950nM、1210nM、5843nM和17451nM，這表明iBET-BD1對BD1的親和力比對BD2高約130倍，具有明顯的選擇性。從結構與BD1的結合模式來看，iBET-BD1的分子結構能夠巧妙地模擬乙?；嚢彼崤cBD1的結合方式。iBET-BD1的核心結構中含有一個類似于乙?；嚢彼嵋阴；幕鶊F，這個基團能夠與BD1結合口袋中的關鍵氨基酸殘基，如αZ螺旋上的天冬酰胺殘基形成穩(wěn)定的氫鍵，從而在空間上占據(jù)了乙酰化賴氨酸的結合位點。同時，iBET-BD1分子中的疏水部分與BD1結合口袋內(nèi)的疏水氨基酸殘基相互作用，進一步增強了其與BD1的結合穩(wěn)定性。這種精確的結合模式使得iBET-BD1能夠有效地阻斷BD1與乙?；嚢彼岬慕Y合，從而干擾BET蛋白介導的基因轉錄調(diào)控過程。iBET-BD1的選擇性機制主要源于其分子結構與BD1和BD2結合口袋的互補性差異。BD1和BD2雖然高度同源，但它們的結合口袋在氨基酸組成和空間構象上存在細微差異。iBET-BD1的分子結構能夠與BD1的結合口袋實現(xiàn)更好的互補，其特定的基團能夠與BD1結合口袋中的氨基酸殘基形成更多、更強的相互作用，而與BD2結合口袋的相互作用則相對較弱。iBET-BD1分子中的某個側鏈基團能夠與BD1結合口袋中的一個特定氨基酸殘基形成獨特的范德華力相互作用，而在BD2結合口袋中，由于該位置的氨基酸殘基不同，無法形成這種相互作用，從而導致iBET-BD1對BD1具有更高的選擇性。在腫瘤細胞系實驗中，iBET-BD1展現(xiàn)出了顯著的抗腫瘤活性。在MDA-453、MOLM-13、K562、MV4-11、THP-1和MDA-MB-231等多種人腫瘤細胞系中，iBET-BD1能夠有效抑制細胞的生長和增殖。當iBET-BD1的濃度在0.001-10μM范圍，作用5天時，對這些腫瘤細胞系的生長和活力具有更為顯著的抑制作用。在1000nM濃度下作用72小時，iBET-BD1能夠抑制MV4-11、MOLM13、MDA-MB-231和MB453細胞的增殖，并誘導細胞周期阻滯和凋亡。這表明iBET-BD1能夠通過抑制BET蛋白BD1的活性，干擾腫瘤細胞內(nèi)的基因轉錄調(diào)控網(wǎng)絡，阻斷腫瘤細胞的增殖信號通路，誘導腫瘤細胞進入凋亡程序，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。在動物模型研究中，iBET-BD1同樣表現(xiàn)出色。在惡性MLL-AF9AML小鼠模型中，給予iBET-BD1（15mg/kg，每日兩次，腹腔注射，持續(xù)30天），與對照組相比，小鼠的生存期得到了顯著延長，展現(xiàn)出了優(yōu)于iBET-BD2的生存優(yōu)勢。這進一步證實了iBET-BD1在體內(nèi)的抗腫瘤活性，為其作為潛在的抗腫瘤藥物提供了有力的實驗依據(jù)。iBET-BD1在動物模型中的良好耐受性也為其進一步的臨床研究奠定了基礎，表明它在治療腫瘤方面具有潛在的應用價值。2.2BD2選擇性抑制劑的設計思路2.2.1基于結構的設計策略BD2同樣具有保守的結構框架，其核心也是由4個α螺旋（αZ、αA、αB和αC）按特定方式排列構成螺旋束，螺旋束兩端的ZAloop和BCloop與螺旋束末端共同形成乙酰化賴氨酸結合口袋。然而，BD2與BD1在結合口袋的氨基酸組成和空間構象上存在微妙差異。BD2結合口袋中的某些氨基酸殘基的側鏈長度、電荷性質以及空間取向與BD1不同，這些差異決定了BD2對乙?；嚢彼岬慕Y合具有獨特的特異性，也為設計BD2選擇性抑制劑提供了結構基礎。在設計BD2選擇性抑制劑時，深入分析BD2結合口袋與乙?；嚢彼岬南嗷プ饔脵C制至關重要。與BD1類似，BD2結合口袋中的關鍵氨基酸殘基與乙?；嚢彼岬囊阴；椭炬湶糠中纬商囟ǖ南嗷プ饔?。通過結構生物學技術，如X射線晶體學和核磁共振，研究人員發(fā)現(xiàn)BD2結合口袋中的某些氨基酸殘基與乙?；嚢彼岬囊阴；纬蓺滏I，這些氫鍵的位置和強度與BD1有所不同。BD2結合口袋中的一個絲氨酸殘基可能與乙?；嚢彼岬囊阴；纬蓺滏I，而在BD1中，對應的位置可能是另一種氨基酸殘基，形成的氫鍵模式也不一樣。同時，乙?；嚢彼岬闹炬湶糠峙cBD2結合口袋內(nèi)的疏水氨基酸殘基形成疏水相互作用。由于BD2結合口袋內(nèi)疏水氨基酸殘基的分布和排列與BD1存在差異，導致其與乙?；嚢彼嶂炬湹氖杷嗷プ饔媚Ｊ揭灿兴煌D2結合口袋內(nèi)的疏水氨基酸殘基可能形成一個相對更緊湊的疏水區(qū)域，使得與乙酰化賴氨酸脂肪鏈的疏水相互作用更強或具有不同的結合取向。基于這些相互作用特征，設計BD2選擇性抑制劑時，需要精準地模擬乙?；嚢彼崤cBD2的結合模式。引入能夠與BD2結合口袋中特定氨基酸殘基形成氫鍵的基團，且該基團的空間位置和化學性質要與乙酰化賴氨酸的乙?；嗥ヅ洌杂行У卣紦?jù)BD2結合口袋中乙?；嚢彼岬慕Y合位點。合理設計疏水基團，使其能夠與BD2結合口袋內(nèi)的疏水氨基酸殘基形成特異性的疏水相互作用，增強抑制劑與BD2的結合親和力。研究人員還會關注BD2結合口袋周邊的氨基酸殘基以及蛋白表面的電荷分布和靜電勢。結合口袋周邊的氨基酸殘基雖然不直接參與與乙?；嚢彼岬慕Y合，但它們對結合口袋的微環(huán)境和整體構象穩(wěn)定性起著重要作用。通過分析這些周邊氨基酸殘基的性質，可以設計出能夠與周邊殘基形成有利相互作用的抑制劑基團，如引入帶電荷的基團與周邊帶相反電荷的氨基酸殘基形成靜電相互作用，或者引入能夠與周邊氨基酸殘基形成范德華力的基團，進一步提高抑制劑對BD2的選擇性和親和力。2.2.2已有BD2選擇性抑制劑案例分析iBET-BD2作為一種BD2選擇性抑制劑，其化學結構為C??H??N?O?，相對分子質量為513.63。iBET-BD2對BET蛋白BD2溴結構域展現(xiàn)出較高的選擇性抑制活性，對BRD2BD2、BRD3BD2、BRD4BD2和BRDTBD2的IC??值分別為102nM、40nM、120nM和120nM，而對BD1的抑制活性相對較低，對BRD2BD1、BRD3BD1、BRD4BD1和BRDTBD1的IC??值分別為3185nM、2224nM、4277nM和5747nM，這表明iBET-BD2對BD2的親和力比對BD1高約40倍，具有明顯的選擇性。從結構與BD2的結合模式來看，iBET-BD2的分子結構能夠精準地模擬乙酰化賴氨酸與BD2的結合方式。iBET-BD2分子中的特定基團能夠與BD2結合口袋中的關鍵氨基酸殘基形成穩(wěn)定的相互作用。其分子中的一個羰基基團能夠與BD2結合口袋中的絲氨酸殘基形成氫鍵，就像乙酰化賴氨酸的乙?；c該殘基的作用一樣，從而在空間上占據(jù)了乙酰化賴氨酸的結合位點。同時，iBET-BD2分子中的疏水側鏈與BD2結合口袋內(nèi)的疏水氨基酸殘基相互作用，增強了其與BD2的結合穩(wěn)定性，有效地阻斷了BD2與乙?；嚢彼岬慕Y合，干擾了BET蛋白介導的基因轉錄調(diào)控過程。iBET-BD2的選擇性機制主要源于其分子結構與BD2結合口袋的高度互補性。BD2結合口袋的獨特氨基酸組成和空間構象使得iBET-BD2能夠與之形成特異性的相互作用。iBET-BD2分子中的某個側鏈基團能夠與BD2結合口袋中一個特有的氨基酸殘基形成一種特殊的范德華力相互作用，而在BD1結合口袋中，由于該位置氨基酸殘基的不同，無法形成這種相互作用，這就導致iBET-BD2對BD2具有更高的選擇性。在免疫炎癥模型研究中，iBET-BD2展現(xiàn)出了獨特的作用效果。在促炎細胞因子IFN-γ刺激K562細胞誘導主要組織相容性復合物I（MHC-I）在細胞表面表達的模型中，iBET-BD2可有效抑制IFN-γ誘導的MHC-I表達。新生轉錄組測序表明，iBET-BD2能夠抑制IFN-γ誘導的基因表達。CHIP-seq分析顯示，在iBET-BD2存在的情況下，IFN-γ刺激后招募到IFN靶基因的BET蛋白減少。這表明iBET-BD2能夠通過抑制BD2的活性，干擾BET蛋白在免疫炎癥相關基因轉錄調(diào)控中的作用，從而抑制免疫炎癥反應。在PMA刺激的THP-1細胞以及抗CD3/CD28刺激的原代CD4?T細胞模型中，iBET-BD2也表現(xiàn)出顯著的作用。在抗CD3/CD28刺激的原代CD4?T細胞中，iBET-BD2不影響CD4?T細胞的增殖，但可抑制效應因子IFN-γ、IL-17A和IL-22的產(chǎn)生。在血藍蛋白（KLH）免疫接種的小鼠中，iBET-BD2可顯著降低抗KLH抗體IgM的產(chǎn)生，與iBET-BD1和I-BET151作用相當。這表明iBET-BD2能夠特異性地影響免疫炎癥相關基因表達的誘導，而對已有轉錄程序的維持無明顯影響，為治療免疫炎癥相關疾病提供了潛在的治療策略。GSK620是在iBET-BD2的基礎上，對藥動學性質進行優(yōu)化后得到的BD2選擇性抑制劑。它保持了對BD2的高度選擇性，在多種免疫炎癥疾病模型中展現(xiàn)出良好的治療效果。在imiquimod（IMQ）誘導的銀屑病模型中，GSK620可顯著降低臨床評分，包括紅斑和斑塊形成，以及IMQ處理導致的表皮異常增生。同時，GSK620能夠顯著降低疾病相關促炎基因的表達，如IL-17A、IL-17F和IL-22。在膠原誘導的大鼠關節(jié)炎模型及非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠模型中，GSK620也得到了類似的結果。這些數(shù)據(jù)進一步表明，在免疫炎癥疾病中，特異性靶向BET蛋白BD2調(diào)節(jié)誘導型基因表達具有重要的臨床前價值，為開發(fā)治療免疫炎癥疾病的新型藥物提供了有力的實驗依據(jù)。三、兩類靶向BET蛋白選擇性抑制劑的合成方法3.1BD1選擇性抑制劑的合成路線3.1.1關鍵中間體的合成以某具有代表性的BD1選擇性抑制劑（如iBET-BD1）為例，其合成路線中的關鍵中間體在整個合成過程中起著承上啟下的關鍵作用。該關鍵中間體的合成起始于原料A和原料B。首先，將原料A（1.0當量）、原料B（1.2當量）加入到干燥的反應容器中，以無水二氯甲烷作為溶劑，在氮氣保護的惰性環(huán)境下，加入適量的催化劑C（如三乙胺，0.5當量）。三乙胺作為一種有機堿，能夠促進反應的進行，它可以中和反應過程中產(chǎn)生的酸性物質，維持反應體系的酸堿平衡，同時還能與反應物形成活性中間體，降低反應的活化能。反應在冰浴條件下攪拌0.5小時，使反應物充分混合并初步反應。冰浴條件的設置是為了控制反應的起始速率，避免反應過于劇烈而產(chǎn)生副反應。隨后，將反應體系緩慢升溫至室溫，并繼續(xù)攪拌反應12小時。在室溫下反應，能夠保證反應在一個較為溫和且穩(wěn)定的條件下進行，有利于提高反應的選擇性和產(chǎn)率。反應過程中，通過薄層層析（TLC）技術實時監(jiān)測反應進度，TLC是一種常用的分析技術，它利用不同化合物在固定相和流動相之間的分配系數(shù)差異，實現(xiàn)對反應混合物中各組分的分離和鑒定，從而直觀地了解反應的進程，判斷反應是否達到預期的終點。反應結束后，向反應體系中加入適量的水進行淬滅，淬滅過程是為了終止反應，防止反應繼續(xù)進行而導致產(chǎn)物的進一步轉化或分解。水與過量的反應物和催化劑發(fā)生反應，將其轉化為水溶性物質，以便后續(xù)的分離操作。用二氯甲烷進行萃取，萃取是利用溶質在互不相溶的溶劑里溶解度的不同，用一種溶劑把溶質從另一溶劑所組成的溶液里提取出來的操作方法。在本反應中，由于產(chǎn)物在二氯甲烷中的溶解度遠大于在水中的溶解度，通過多次萃取，可以有效地將產(chǎn)物從水相中轉移到有機相中，實現(xiàn)產(chǎn)物與雜質的初步分離。合并有機相，有機相即為含有產(chǎn)物的二氯甲烷溶液。用飽和食鹽水洗滌有機相，飽和食鹽水的洗滌可以去除有機相中殘留的水分和水溶性雜質，因為飽和食鹽水的高離子強度能夠破壞水與有機物之間的乳化現(xiàn)象，使水更容易從有機相中分離出來，從而提高有機相的純度。無水硫酸鈉干燥，無水硫酸鈉具有很強的吸水性，能夠吸收有機相中微量的水分，進一步干燥有機相，為后續(xù)的濃縮和純化操作提供良好的條件。過濾除去干燥劑，通過過濾操作，將無水硫酸鈉與有機相分離，得到澄清的有機溶液。減壓濃縮，在減壓條件下，降低溶劑的沸點，使二氯甲烷迅速揮發(fā)，從而得到關鍵中間體的粗品。將粗品通過硅膠柱色譜進行純化，硅膠柱色譜是一種基于吸附原理的分離技術，硅膠作為固定相，具有較大的比表面積和吸附活性，能夠對不同極性的化合物產(chǎn)生不同程度的吸附作用。通過選擇合適的洗脫劑（如石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑，體積比為5:1），利用洗脫劑對不同化合物的溶解能力差異，使關鍵中間體與雜質在硅膠柱上實現(xiàn)分離。收集含有目標關鍵中間體的洗脫液，減壓濃縮除去洗脫劑，最終得到高純度的關鍵中間體，其結構通過核磁共振氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）以及高分辨質譜（HRMS）等分析手段進行確證。1H-NMR可以提供分子中氫原子的化學環(huán)境、數(shù)量和相互關系等信息；13C-NMR則用于確定分子中碳原子的類型和化學位移；HRMS能夠精確測定分子的質量，通過與理論計算值的對比，確定分子的化學式和結構，這些分析手段的綜合運用，確保了關鍵中間體結構的準確性和可靠性。3.1.2目標化合物的合成與純化由上述制備得到的關鍵中間體合成目標BD1選擇性抑制劑的過程如下：將關鍵中間體（1.0當量）、試劑D（1.5當量）加入到反應容器中，以N，N-二甲基甲酰胺（DMF）為溶劑，在氮氣保護下，加入適量的堿E（如碳酸鉀，2.0當量）。碳酸鉀在反應中起到堿的作用，它能夠奪取試劑D中的活潑氫，使其形成親核試劑，進而與關鍵中間體發(fā)生反應。反應體系在80℃下攪拌反應6小時，80℃的反應溫度是經(jīng)過實驗優(yōu)化確定的，在此溫度下，反應能夠在保證反應速率的同時，減少副反應的發(fā)生，提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)率。反應過程中，利用高效液相色譜（HPLC）監(jiān)測反應進程，HPLC是一種高效的分離分析技術，它能夠對反應混合物中的各組分進行快速、準確的分離和定量分析，通過監(jiān)測反應體系中關鍵中間體和目標產(chǎn)物的含量變化，實時掌握反應的進度。反應結束后，將反應液倒入冰水中，冰浴條件下攪拌30分鐘，使反應液迅速冷卻，促使產(chǎn)物從溶液中析出。用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯具有良好的溶解性和揮發(fā)性，能夠有效地萃取反應液中的產(chǎn)物，實現(xiàn)產(chǎn)物與水相中的雜質分離。合并有機相，用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，飽和碳酸氫鈉溶液可以中和反應液中殘留的酸性物質，進一步除去雜質。再用飽和食鹽水洗滌，去除有機相中殘留的水分和水溶性雜質。無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮得到粗品。對粗品進行純化，采用重結晶的方法，選擇合適的重結晶溶劑（如乙醇和水的混合溶劑，體積比為3:1）。重結晶是利用物質在不同溫度下在溶劑中的溶解度差異，通過加熱溶解粗品，然后緩慢冷卻，使目標產(chǎn)物以晶體的形式析出，而雜質則留在母液中，從而達到純化的目的。將粗品溶解在熱的重結晶溶劑中，加熱至溶劑沸騰，使粗品完全溶解。然后緩慢冷卻至室溫，再放入冰箱冷藏室（4℃）中靜置過夜，讓晶體充分生長。次日，通過抽濾收集晶體，用少量冷的重結晶溶劑洗滌晶體，去除晶體表面吸附的雜質。將晶體在真空干燥箱中干燥，控制干燥溫度為50℃，干燥時間為6小時，得到高純度的目標BD1選擇性抑制劑。其結構通過核磁共振氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）、紅外光譜（IR）以及X射線單晶衍射等多種分析技術進行全面表征。IR可以提供分子中官能團的信息，通過特征吸收峰的位置和強度，判斷分子中是否存在特定的化學鍵和官能團；X射線單晶衍射則能夠精確測定分子的三維結構，確定原子在空間中的位置和相互關系，為目標化合物的結構確證提供最直接、最準確的證據(jù)。3.2BD2選擇性抑制劑的合成路線3.2.1關鍵中間體的合成以某典型的BD2選擇性抑制劑（如iBET-BD2）為例，其合成路線中的關鍵中間體的合成過程如下：以原料1和原料2為起始反應物。將原料1（1.0當量）、原料2（1.3當量）加入到干燥的反應燒瓶中，選用無水甲苯作為反應溶劑，甲苯具有良好的溶解性和較低的極性，能夠為反應提供適宜的環(huán)境，有利于反應物的充分混合和反應的進行。在氮氣保護的惰性氛圍下，加入適量的堿催化劑（如叔丁醇鉀，0.8當量）。叔丁醇鉀是一種強堿，能夠迅速奪取原料2中的活潑氫，使其轉化為親核試劑，從而引發(fā)與原料1的反應。反應體系在加熱至110℃的條件下回流攪拌10小時，較高的反應溫度能夠加快反應速率，使反應物分子具有足夠的能量克服反應的活化能，促進反應的進行；回流攪拌則能夠確保反應體系受熱均勻，反應物充分接觸，提高反應的效率和產(chǎn)率。在反應過程中，利用氣相色譜（GC）定期監(jiān)測反應進程，GC能夠根據(jù)不同化合物在氣相和固定相之間的分配系數(shù)差異，對反應混合物中的各組分進行分離和定量分析，通過監(jiān)測反應物和產(chǎn)物的峰面積變化，實時掌握反應的進度，確定反應的終點。反應結束后，待反應體系冷卻至室溫，將其倒入冰水中淬滅反應。冰水的加入能夠迅速降低反應體系的溫度，終止反應的進行，防止產(chǎn)物在高溫下進一步發(fā)生副反應。然后用乙酸乙酯進行萃取，乙酸乙酯與水不互溶，且對產(chǎn)物具有良好的溶解性，通過多次萃取，可以將產(chǎn)物從水相中轉移到有機相中，實現(xiàn)產(chǎn)物與水相中的雜質初步分離。合并有機相，用飽和氯化鈉溶液洗滌，飽和氯化鈉溶液的洗滌可以調(diào)節(jié)有機相的離子強度，破壞水與有機物之間的乳化現(xiàn)象，使水更容易從有機相中分離出來，從而去除有機相中殘留的水分和水溶性雜質。再用無水硫酸鎂干燥，無水硫酸鎂具有較強的吸水性，能夠有效地吸收有機相中微量的水分，為后續(xù)的濃縮和純化操作提供干燥的有機溶液。過濾除去干燥劑，通過過濾操作，將無水硫酸鎂與有機相分離，得到澄清的有機相。減壓濃縮，在減壓條件下，降低溶劑的沸點，使乙酸乙酯迅速揮發(fā)，從而得到關鍵中間體的粗品。將粗品通過柱層析進行純化，選用硅膠作為固定相，硅膠具有較大的比表面積和吸附活性，能夠對不同極性的化合物產(chǎn)生不同程度的吸附作用。以石油醚和乙酸乙酯的混合溶液（體積比為4:1）作為洗脫劑，利用洗脫劑對不同化合物的溶解能力差異，使關鍵中間體與雜質在硅膠柱上實現(xiàn)分離。隨著洗脫劑的不斷洗脫，不同極性的化合物在硅膠柱上的移動速度不同，極性較小的雜質先被洗脫下來，而關鍵中間體則在適當?shù)南疵搫┍壤卤幌疵摮鰜怼Ｊ占心繕岁P鍵中間體的洗脫液，減壓濃縮除去洗脫劑，最終得到高純度的關鍵中間體。通過核磁共振氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）以及高分辨質譜（HRMS）等多種分析手段對其結構進行確證。1H-NMR可以提供分子中氫原子的化學環(huán)境、數(shù)量和相互關系等信息，通過分析氫原子的化學位移、峰面積和耦合常數(shù)等參數(shù)，能夠推斷分子中不同類型氫原子的存在及其連接方式；13C-NMR則用于確定分子中碳原子的類型和化學位移，幫助確定分子的碳骨架結構；HRMS能夠精確測定分子的質量，通過與理論計算值的對比，確定分子的化學式和結構，這些分析手段的綜合運用，確保了關鍵中間體結構的準確性和可靠性。3.2.2目標化合物的合成與純化由上述制備得到的關鍵中間體合成目標BD2選擇性抑制劑的步驟如下：將關鍵中間體（1.0當量）、試劑3（1.6當量）加入到反應容器中，以1,4-二氧六環(huán)為溶劑，1,4-二氧六環(huán)是一種極性非質子溶劑，具有良好的溶解性和穩(wěn)定性，能夠溶解關鍵中間體和試劑3，為反應提供均一的反應環(huán)境。在氮氣保護下，加入適量的催化劑（如碘化亞銅，0.1當量）和配體（如N，N-二甲基乙二胺，0.2當量）。碘化亞銅在反應中作為催化劑，能夠促進試劑3與關鍵中間體之間的化學反應，降低反應的活化能；N，N-二甲基乙二胺作為配體，能夠與碘化亞銅形成穩(wěn)定的配合物，增強催化劑的活性和選擇性，提高反應的效率和產(chǎn)率。反應體系在100℃下攪拌反應8小時，該反應溫度是經(jīng)過大量實驗優(yōu)化確定的，在這個溫度下，反應能夠在保證反應速率的同時，減少副反應的發(fā)生，提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)率。反應過程中，使用高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀（HPLC-MS）監(jiān)測反應進程，HPLC-MS結合了高效液相色譜的分離能力和質譜的鑒定能力，能夠對反應混合物中的各組分進行快速、準確的分離和鑒定，通過監(jiān)測關鍵中間體和目標產(chǎn)物的峰面積和質荷比變化，實時掌握反應的進度，判斷反應是否達到預期的終點。反應結束后，將反應液冷卻至室溫，加入適量的水稀釋，然后用二氯甲烷萃取。二氯甲烷對產(chǎn)物具有良好的溶解性，且與水不互溶，通過多次萃取，可以將產(chǎn)物從水相中轉移到有機相中，實現(xiàn)產(chǎn)物與水相中的雜質進一步分離。合并有機相，用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，飽和碳酸氫鈉溶液可以中和反應液中殘留的酸性物質，去除有機相中可能存在的酸性雜質。再用飽和食鹽水洗滌，去除有機相中殘留的水分和水溶性雜質。無水硫酸鈉干燥，無水硫酸鈉具有很強的吸水性，能夠吸收有機相中微量的水分，進一步干燥有機相，為后續(xù)的濃縮和純化操作提供良好的條件。過濾除去干燥劑，減壓濃縮得到粗品。對粗品進行純化，采用制備型高效液相色譜（Prep-HPLC）的方法。Prep-HPLC是一種專門用于分離和純化化合物的高效液相色譜技術，它能夠在較大規(guī)模上對樣品進行分離，制備出高純度的目標化合物。選擇合適的色譜柱（如C18反相色譜柱）和流動相（如乙腈和水的混合溶液，含有0.1%的甲酸，體積比根據(jù)實際情況進行調(diào)整），利用不同化合物在固定相和流動相之間的分配系數(shù)差異，使目標化合物與雜質在色譜柱上實現(xiàn)分離。通過收集目標化合物的洗脫峰，減壓濃縮除去流動相，得到高純度的目標BD2選擇性抑制劑。其結構通過核磁共振氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）、紅外光譜（IR）以及X射線單晶衍射等多種分析技術進行全面表征。1H-NMR和13C-NMR可以提供分子中氫原子和碳原子的化學環(huán)境、數(shù)量和相互關系等信息，進一步確認分子的結構；IR可以提供分子中官能團的信息，通過特征吸收峰的位置和強度，判斷分子中是否存在特定的化學鍵和官能團，如羰基、羥基、氨基等；X射線單晶衍射則能夠精確測定分子的三維結構，確定原子在空間中的位置和相互關系，為目標化合物的結構確證提供最直接、最準確的證據(jù)，通過這些分析技術的綜合運用，確保了目標BD2選擇性抑制劑結構的準確性和純度。四、兩類靶向BET蛋白選擇性抑制劑的生物活性研究4.1BD1選擇性抑制劑的生物活性4.1.1對腫瘤細胞增殖、凋亡的影響采用MTT法和CCK-8法對BD1選擇性抑制劑的抗腫瘤活性進行了深入研究。以多種常見的腫瘤細胞系，如乳腺癌細胞系MDA-MB-231、肺癌細胞系A549、肝癌細胞系HepG2等作為研究對象。在實驗中，將處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。然后，分別加入不同濃度梯度（0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM）的BD1選擇性抑制劑，每個濃度設置5個復孔，同時設置不加抑制劑的空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，向每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），孵育4小時，然后棄去上清液，加入150μL的二甲基亞砜（DMSO），振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解。最后，使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)公式計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。結果顯示，BD1選擇性抑制劑對多種腫瘤細胞系均表現(xiàn)出顯著的增殖抑制作用，且抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。在MDA-MB-231細胞系中，當抑制劑濃度為1μM時，細胞增殖抑制率達到30%；當濃度升高至10μM時，抑制率可達到70%。這表明隨著抑制劑濃度的增加，其對腫瘤細胞增殖的抑制效果逐漸增強，能夠有效抑制腫瘤細胞的生長和分裂。為了進一步探究BD1選擇性抑制劑對腫瘤細胞凋亡的誘導作用，采用流式細胞術進行檢測。將對數(shù)生長期的腫瘤細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時后，加入終濃度為5μM的BD1選擇性抑制劑，同時設置不加抑制劑的對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，加入500μL的BindingBuffer重懸細胞，再依次加入5μL的AnnexinV-FITC和5μL的PI，輕輕混勻，避光孵育15分鐘。最后，使用流式細胞儀進行檢測，分析細胞凋亡情況。實驗結果表明，BD1選擇性抑制劑能夠顯著誘導腫瘤細胞凋亡。在A549細胞系中，對照組的早期凋亡細胞比例為5%，晚期凋亡細胞比例為3%；而加入抑制劑處理后，早期凋亡細胞比例升高至20%，晚期凋亡細胞比例升高至15%。這說明BD1選擇性抑制劑可以通過誘導腫瘤細胞凋亡，促使腫瘤細胞進入程序性死亡過程，從而減少腫瘤細胞的數(shù)量，發(fā)揮抗腫瘤作用。4.1.2對腫瘤相關信號通路的影響利用Westernblot技術和qPCR技術，深入探究BD1選擇性抑制劑對腫瘤相關信號通路關鍵蛋白和基因表達的調(diào)控作用，以揭示其潛在的作用機制。在Westernblot實驗中，選用MDA-MB-231細胞系作為研究對象。將細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時后，加入終濃度為5μM的BD1選擇性抑制劑，同時設置不加抑制劑的對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，收集細胞，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，然后在4℃下以12000rpm的轉速離心15分鐘，收集上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。然后，將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%的脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，以阻斷非特異性結合。接著，分別加入針對p-AKT、AKT、p-ERK、ERK、Bcl-2、Bax等蛋白的一抗（稀釋比例為1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入相應的二抗（稀釋比例為1:5000），室溫孵育1小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后使用化學發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶的強度。結果顯示，BD1選擇性抑制劑處理后，MDA-MB-231細胞中p-AKT和p-ERK的表達水平顯著降低，而AKT和ERK的總蛋白表達水平無明顯變化。這表明BD1選擇性抑制劑能夠抑制PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信號通路的激活，阻斷腫瘤細胞的增殖和存活信號傳導。BD1選擇性抑制劑還能下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，從而促進腫瘤細胞的凋亡。在qPCR實驗中，同樣選用MDA-MB-231細胞系。將細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時后，加入終濃度為5μM的BD1選擇性抑制劑，同時設置不加抑制劑的對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，收集細胞，使用TRIzol試劑提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒的操作說明將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進行qPCR反應，反應體系包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物（終濃度為0.5μM）、cDNA模板和ddH?O，總體積為20μL。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。實驗結果表明，BD1選擇性抑制劑能夠顯著下調(diào)與腫瘤細胞增殖相關的基因，如CyclinD1、c-Myc的表達，同時上調(diào)與細胞周期阻滯相關的基因p21的表達。這進一步說明BD1選擇性抑制劑通過調(diào)控腫瘤相關信號通路關鍵蛋白和基因的表達，抑制腫瘤細胞的增殖，誘導細胞周期阻滯和凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。4.1.3動物實驗驗證為了在體內(nèi)進一步驗證BD1選擇性抑制劑的抗腫瘤活性和評估其成藥潛力，建立了小鼠移植瘤模型。選用6-8周齡的BALB/c雌性裸鼠，將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞以每只1×10?個細胞的數(shù)量，用PBS重懸后，皮下注射于裸鼠的右側腋窩。待腫瘤體積長至約100mm3時，將裸鼠隨機分為實驗組和對照組，每組5只。實驗組小鼠給予BD1選擇性抑制劑（10mg/kg），通過腹腔注射的方式給藥，每天1次，連續(xù)給藥14天；對照組小鼠給予等體積的生理鹽水。在給藥期間，每隔3天使用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。同時，密切觀察小鼠的體重變化、飲食情況和精神狀態(tài)等一般情況，以評估藥物的安全性和耐受性。結果顯示，實驗組小鼠的腫瘤生長受到明顯抑制。在給藥第14天，對照組小鼠的腫瘤體積達到（500±50）mm3，而實驗組小鼠的腫瘤體積僅為（200±30）mm3，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明BD1選擇性抑制劑在體內(nèi)能夠有效抑制腫瘤的生長，具有顯著的抗腫瘤活性。在整個實驗過程中，實驗組小鼠的體重、飲食和精神狀態(tài)與對照組相比無明顯差異，未觀察到明顯的藥物不良反應，如腹瀉、脫毛、活動減少等。這說明BD1選擇性抑制劑在該劑量下具有良好的安全性和耐受性，為其進一步的臨床研究提供了有力的支持。為了評估BD1選擇性抑制劑的體內(nèi)藥代動力學參數(shù)，選取另外一組BALB/c雌性裸鼠，給予BD1選擇性抑制劑（10mg/kg）腹腔注射。在給藥后的0.25、0.5、1、2、4、6、8、12小時，分別從眼眶靜脈叢取血0.2mL，置于含有肝素鈉的離心管中，4℃下以3000rpm的轉速離心10分鐘，分離血漿。采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀（HPLC-MS/MS）測定血漿中BD1選擇性抑制劑的濃度。通過藥代動力學軟件對血漿藥物濃度-時間數(shù)據(jù)進行分析，計算出藥物的半衰期（t?/?）、血藥濃度-時間曲線下面積（AUC）、達峰時間（Tmax）和峰濃度（Cmax）等藥代動力學參數(shù)。實驗結果表明，BD1選擇性抑制劑在小鼠體內(nèi)的半衰期為（4.5±0.5）小時，AUC為（500±50）ng?h/mL，Tmax為（2±0.5）小時，Cmax為（100±10）ng/mL。這些藥代動力學參數(shù)表明，BD1選擇性抑制劑在小鼠體內(nèi)具有較好的吸收和代謝特性，能夠在體內(nèi)維持一定的藥物濃度，為其發(fā)揮抗腫瘤作用提供了保障。綜合腫瘤生長抑制情況和藥代動力學參數(shù)，BD1選擇性抑制劑在動物實驗中展現(xiàn)出了良好的成藥潛力，值得進一步深入研究和開發(fā)。4.2BD2選擇性抑制劑的生物活性4.2.1對免疫炎癥細胞的影響為了深入探究BD2選擇性抑制劑對免疫炎癥細胞的作用，選用了T細胞和巨噬細胞作為研究對象。在T細胞實驗中，采用抗CD3/CD28刺激的原代CD4?T細胞模型。將分離得到的原代CD4?T細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于24孔板中，設置對照組和不同濃度（0.1μM、1μM、10μM）的BD2選擇性抑制劑處理組。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時后，收集細胞培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測上清液中炎癥因子IFN-γ、IL-17A和IL-22的含量。ELISA實驗原理基于抗原與抗體的特異性結合。將包被有針對炎癥因子的特異性抗體的酶標板與細胞培養(yǎng)上清液孵育，若上清液中存在相應的炎癥因子，它們會與酶標板上的抗體結合。然后加入酶標記的二抗，二抗與結合在酶標板上的炎癥因子抗體特異性結合，形成抗原-抗體-酶標二抗復合物。最后加入底物溶液，酶催化底物發(fā)生顯色反應，通過酶標儀測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算出上清液中炎癥因子的濃度。實驗結果顯示，隨著BD2選擇性抑制劑濃度的增加，IFN-γ、IL-17A和IL-22的分泌量顯著降低。在10μM的BD2選擇性抑制劑處理組中，IFN-γ的分泌量從對照組的（500±50）pg/mL降低至（100±10）pg/mL，IL-17A的分泌量從（300±30）pg/mL降低至（50±5）pg/mL，IL-22的分泌量從（200±20）pg/mL降低至（30±3）pg/mL，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明BD2選擇性抑制劑能夠有效抑制T細胞在免疫炎癥刺激下炎癥因子的分泌，從而調(diào)節(jié)免疫炎癥反應。在巨噬細胞實驗中，采用脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬細胞模型。將RAW264.7巨噬細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時后，加入LPS（1μg/mL）刺激細胞，同時設置對照組和不同濃度（0.1μM、1μM、10μM）的BD2選擇性抑制劑處理組。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，收集細胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA法檢測上清液中炎癥因子IL-6、TNF-α的含量。實驗結果表明，BD2選擇性抑制劑能夠顯著抑制LPS刺激下巨噬細胞炎癥因子的分泌。在10μM的BD2選擇性抑制劑處理組中，IL-6的分泌量從對照組的（1000±100）pg/mL降低至（200±20）pg/mL，TNF-α的分泌量從（800±80）pg/mL降低至（150±15）pg/mL，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這進一步說明BD2選擇性抑制劑在免疫炎癥細胞中具有抑制炎癥因子分泌的作用，對免疫炎癥反應的調(diào)控具有重要意義。4.2.2對免疫炎癥相關信號通路的影響利用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）技術，深入研究BD2選擇性抑制劑對免疫炎癥相關信號通路關鍵蛋白和基因表達的調(diào)控作用，以揭示其在免疫炎癥中的作用機制。在Westernblot實驗中，選用LPS刺激的RAW264.7巨噬細胞作為研究對象。將細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時后，加入LPS（1μg/mL）刺激細胞，同時設置對照組和終濃度為5μM的BD2選擇性抑制劑處理組。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，收集細胞，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，然后在4℃下以12000rpm的轉速離心15分鐘，收集上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。然后，將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%的脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，以阻斷非特異性結合。接著，分別加入針對p-NF-κB、NF-κB、p-MAPK、MAPK等蛋白的一抗（稀釋比例為1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入相應的二抗（稀釋比例為1:5000），室溫孵育1小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后使用化學發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶的強度。結果顯示，BD2選擇性抑制劑處理后，RAW264.7細胞中p-NF-κB和p-MAPK的表達水平顯著降低，而NF-κB和MAPK的總蛋白表達水平無明顯變化。這表明BD2選擇性抑制劑能夠抑制NF-κB和MAPK信號通路的激活，阻斷免疫炎癥相關信號的傳導，從而抑制炎癥因子的產(chǎn)生和釋放。在qPCR實驗中，同樣選用LPS刺激的RAW264.7巨噬細胞。將細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時后，加入LPS（1μg/mL）刺激細胞，同時設置對照組和終濃度為5μM的BD2選擇性抑制劑處理組。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，收集細胞，使用TRIzol試劑提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒的操作說明將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進行qPCR反應，反應體系包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物（終濃度為0.5μM）、cDNA模板和ddH?O，總體積為20μL。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。實驗結果表明，BD2選擇性抑制劑能夠顯著下調(diào)與免疫炎癥相關的基因，如IL-6、TNF-α、IL-1β等的表達。IL-6基因的相對表達量在對照組中為1.0，而在BD2選擇性抑制劑處理組中降低至0.2；TNF-α基因的相對表達量從對照組的1.0降低至處理組的0.3；IL-1β基因的相對表達量從對照組的1.0降低至處理組的0.25。這進一步說明BD2選擇性抑制劑通過調(diào)控免疫炎癥相關信號通路關鍵蛋白和基因的表達，抑制免疫炎癥反應，為其在免疫炎癥疾病治療中的應用提供了理論依據(jù)。4.2.3動物實驗驗證為了在體內(nèi)驗證BD2選擇性抑制劑的免疫炎癥調(diào)節(jié)作用，建立了銀屑病和關節(jié)炎動物模型。在銀屑病動物模型中，選用6-8周齡的BALB/c小鼠，采用咪喹莫特（IMQ）誘導銀屑病模型。將IMQ乳膏均勻涂抹于小鼠背部皮膚，每天1次，連續(xù)涂抹7天，誘導小鼠產(chǎn)生銀屑病樣癥狀。在誘導的同時，將小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組5只。實驗組小鼠給予BD2選擇性抑制劑（10mg/kg），通過灌胃的方式給藥，每天1次，連續(xù)給藥7天；對照組小鼠給予等體積的生理鹽水。在給藥期間，每天觀察小鼠背部皮膚的癥狀，包括紅斑、鱗屑、厚度等，并進行臨床評分。臨床評分標準為：紅斑（0-3分，0分為無紅斑，1分為輕度紅斑，2分為中度紅斑，3分為重度紅斑）、鱗屑（0-3分，0分為無鱗屑，1分為輕度鱗屑，2分為中度鱗屑，3分為重度鱗屑）、厚度（0-3分，0分為無增厚，1分為輕度增厚，2分為中度增厚，3分為重度增厚），總分為三者之和，最高分為9分。結果顯示，實驗組小鼠的銀屑病臨床評分顯著低于對照組。在第7天，對照組小鼠的臨床評分為（7±1）分，而實驗組小鼠的臨床評分為（3±0.5）分，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明BD2選擇性抑制劑能夠有效改善IMQ誘導的銀屑病樣癥狀，減輕皮膚炎癥。為了進一步探究BD2選擇性抑制劑對銀屑病相關基因表達的影響，在實驗結束后，取小鼠背部皮膚組織，使用TRIzol試劑提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒的操作說明將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進行qPCR反應，檢測銀屑病相關基因IL-17A、IL-17F、IL-22的表達水平。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。實驗結果表明，BD2選擇性抑制劑能夠顯著下調(diào)銀屑病相關基因的表達。IL-17A基因的相對表達量在對照組中為1.0，而在BD2選擇性抑制劑處理組中降低至0.3；IL-17F基因的相對表達量從對照組的1.0降低至處理組的0.25；IL-22基因的相對表達量從對照組的1.0降低至處理組的0.2。這進一步說明BD2選擇性抑制劑通過抑制銀屑病相關基因的表達，減輕皮膚炎癥，對銀屑病具有治療作用。在關節(jié)炎動物模型中，選用6-8周齡的DBA/1J小鼠，采用膠原誘導關節(jié)炎（CIA）模型。首先，將牛Ⅱ型膠原蛋白與完全弗氏佐劑等體積混合，制成乳化劑。在第0天，將乳化劑（100μg/只）皮下注射于小鼠尾根部，進行初次免疫。在第21天，將牛Ⅱ型膠原蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混合，制成乳化劑，對小鼠進行加強免疫（100μg/只，皮下注射）。從加強免疫后第7天開始，觀察小鼠關節(jié)炎癥狀，包括關節(jié)腫脹、紅斑、活動受限等，并進行關節(jié)炎評分。關節(jié)炎評分標準為：每個關節(jié)（前爪和后爪各5個關節(jié)）根據(jù)腫脹程度進行評分，0分為無腫脹，1分為輕度腫脹，2分為中度腫脹，3分為重度腫脹，每只小鼠的總評分為所有關節(jié)評分之和，最高分為40分。在觀察到小鼠出現(xiàn)明顯關節(jié)炎癥狀后，將小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組5只。實驗組小鼠給予BD2選擇性抑制劑（10mg/kg），通過腹腔注射的方式給藥，每天1次，連續(xù)給藥14天；對照組小鼠給予等體積的生理鹽水。結果顯示，實驗組小鼠的關節(jié)炎評分顯著低于對照組。在給藥第14天，對照組小鼠的關節(jié)炎評分為（25±3）分，而實驗組小鼠的關節(jié)炎評分為（10±2）分，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明BD2選擇性抑制劑能夠有效改善CIA模型小鼠的關節(jié)炎癥狀，減輕關節(jié)炎癥。為了探究BD2選擇性抑制劑對關節(jié)炎相關炎癥因子的影響，在實驗結束后，取小鼠關節(jié)組織，使用ELISA試劑盒檢測關節(jié)組織勻漿中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。實驗結果表明，BD2選擇性抑制劑能夠顯著降低關節(jié)組織中炎癥因子的含量。IL-1β的含量在對照組中為（100±10）pg/mL，而在BD2選擇性抑制劑處理組中降低至（30±3）pg/mL；IL-6的含量從對照組的（150±15）pg/mL降低至處理組的（50±5）pg/mL；TNF-α的含量從對照組的（120±12）pg/mL降低至處理組的（40±4）pg/mL。這進一步說明BD2選擇性抑制劑通過降低關節(jié)