FXR調(diào)控非小細(xì)胞肺癌HVEM表達(dá)的分子機(jī)制與治療潛力探究一、引言1.1研究背景與意義肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）在肺癌中占比約85%，其發(fā)病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，5年生存率較低。盡管近年來(lái)在手術(shù)、化療、放療、靶向治療及免疫治療等方面取得了一定進(jìn)展，但NSCLC患者的總體預(yù)后仍不理想，尋找新的治療靶點(diǎn)和策略迫在眉睫。法尼醇X受體（FXR）屬于核受體超家族成員，最初因其轉(zhuǎn)錄活性可被法尼醇及其代謝物增強(qiáng)而得名，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸是其內(nèi)源性配體，故又稱膽汁酸受體。FXR在肝臟、小腸、腎臟等組織中高表達(dá)，在維持膽汁酸、脂質(zhì)、葡萄糖穩(wěn)態(tài)以及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在肝臟中，F(xiàn)XR通過(guò)抑制膽汁酸合成限速酶CYP7A1的表達(dá)，減少膽汁酸合成；促進(jìn)膽汁酸外排轉(zhuǎn)運(yùn)體BSEP、MRP2等的表達(dá)，增加膽汁酸外排；下調(diào)膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體NTCP的表達(dá)，減少膽汁酸進(jìn)入肝細(xì)胞，從而維持膽汁酸的動(dòng)態(tài)平衡。在脂質(zhì)代謝方面，F(xiàn)XR可調(diào)控肝臟脂肪合成、脂蛋白分泌和血漿清除以及膽固醇吸收等過(guò)程，抑制微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白和載脂蛋白基因表達(dá)，減少VLDL分泌，同時(shí)增加VLDL受體表達(dá)，降低肝臟甘油三酯水平。此外，F(xiàn)XR還參與調(diào)控糖代謝，通過(guò)抑制肝糖原異生、增加肝糖原儲(chǔ)存、提高胰島素敏感性等機(jī)制維持血糖穩(wěn)態(tài)。皰疹病毒侵入介質(zhì)（HVEM），又名腫瘤壞死因子受體超家族成員14（TNFRSF14），在多種細(xì)胞類型中廣泛表達(dá)，參與免疫穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。在免疫系統(tǒng)中，HVEM作為一個(gè)關(guān)鍵分子，與多種配體相互作用，傳遞不同的信號(hào)。它與BTLA、CD160結(jié)合時(shí)觸發(fā)共抑制信號(hào)，抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生；而與LIGHT、淋巴毒素-α（LTα）結(jié)合時(shí)則傳遞共刺激信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞的激活和增殖。在腫瘤微環(huán)境中，HVEM的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及免疫逃逸密切相關(guān)。研究表明，HVEM在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，如胃癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等，其高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展、侵襲性增強(qiáng)以及患者預(yù)后不良相關(guān)。在肺癌中，HVEM的表達(dá)變化及其作用機(jī)制也逐漸受到關(guān)注，但目前相關(guān)研究仍較少。越來(lái)越多的研究表明，F(xiàn)XR在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)。在肝癌中，F(xiàn)XR的激活可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；在結(jié)直腸癌中，F(xiàn)XR通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。然而，F(xiàn)XR在NSCLC中的具體作用及機(jī)制尚未完全明確。同時(shí)，HVEM作為免疫調(diào)節(jié)和腫瘤進(jìn)展中的關(guān)鍵分子，其在NSCLC中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及與FXR之間是否存在潛在聯(lián)系，目前也鮮見報(bào)道。本研究旨在探討FXR對(duì)NSCLC中HVEM表達(dá)的調(diào)控作用及具體機(jī)制，為NSCLC的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。通過(guò)深入研究FXR與HVEM之間的關(guān)系，有望揭示NSCLC發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制，為開發(fā)更加有效的治療策略提供新思路，從而提高NSCLC患者的生存率和生活質(zhì)量，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2FXR與HVEM概述法尼醇X受體（FXR）作為核受體超家族中的重要成員，在機(jī)體的生理調(diào)節(jié)過(guò)程中扮演著不可或缺的角色。FXR最早被發(fā)現(xiàn)時(shí)，因其轉(zhuǎn)錄活性可被法尼醇及其代謝物增強(qiáng)而得名，后續(xù)研究進(jìn)一步揭示膽汁酸為其內(nèi)源性配體，故又被稱作膽汁酸受體。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，F(xiàn)XR存在兩個(gè)成員，即FXRα和FXRβ，其中FXRβ在人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物中是一種假基因，而FXRα基因則編碼四種亞型（FXRα1-α4），且這四種亞型呈現(xiàn)出組織依賴的表達(dá)模式。例如在肝臟中，F(xiàn)XRα1和FXRα2表達(dá)較為豐富，而在小腸中，F(xiàn)XRα3和FXRα4的表達(dá)水平相對(duì)較高。FXR具有典型的核受體結(jié)構(gòu)，包含與配體無(wú)關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活域（AF1）、核心DNA結(jié)合域（DBD）、鉸鏈區(qū)、C末端配體結(jié)合域（LBD）以及配體依賴激活功能域（AF2）。AF1結(jié)構(gòu)域處于高度無(wú)序狀態(tài)，能夠與多種調(diào)控蛋白協(xié)同發(fā)揮作用，通過(guò)選擇性剪切可產(chǎn)生多種異構(gòu)體。DBD區(qū)域高度保守，包含兩個(gè)α螺旋（H1和H2）以及兩個(gè)四半胱氨酸/鋅核模塊，負(fù)責(zé)與DNA建立堿基特異性相互作用，從而精準(zhǔn)識(shí)別特異性DNA序列。鉸鏈區(qū)則是一段短而靈活的連接區(qū)域，雖序列和尺寸保守性較低，但在維持受體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能發(fā)揮方面具有重要作用。LBD與配體結(jié)合后，會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而與輔調(diào)節(jié)蛋白相互作用，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。例如，當(dāng)FXR與膽汁酸結(jié)合后，LBD的構(gòu)象改變促使其與視黃醛衍生物X受體（RXR）形成二聚體，該二聚體能夠結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列上，招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，激活或抑制靶基因的表達(dá)。FXR在維持膽汁酸、脂質(zhì)、葡萄糖穩(wěn)態(tài)以及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在膽汁酸代謝方面，F(xiàn)XR通過(guò)多條途徑維持膽汁酸的動(dòng)態(tài)平衡。它可以抑制膽汁酸合成限速酶CYP7A1的表達(dá)，從而減少膽汁酸的合成；同時(shí)促進(jìn)膽汁酸外排轉(zhuǎn)運(yùn)體BSEP、MRP2等的表達(dá)，增加膽汁酸的外排；此外，還能下調(diào)膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體NTCP的表達(dá)，減少膽汁酸進(jìn)入肝細(xì)胞。在脂質(zhì)代謝調(diào)控中，F(xiàn)XR可抑制微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白和載脂蛋白基因表達(dá)，減少VLDL分泌，同時(shí)增加VLDL受體表達(dá)，促進(jìn)VLDL的清除，從而降低肝臟甘油三酯水平。在糖代謝方面，F(xiàn)XR能夠抑制肝糖原異生、增加肝糖原儲(chǔ)存、提高胰島素敏感性，進(jìn)而維持血糖的穩(wěn)定。例如，在糖尿病小鼠模型中，激活FXR后，小鼠的血糖水平顯著降低，胰島素敏感性增強(qiáng)，肝糖原含量增加。皰疹病毒侵入介質(zhì)（HVEM），也被稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員14（TNFRSF14），在多種細(xì)胞類型中廣泛表達(dá)，在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。HVEM的結(jié)構(gòu)包含細(xì)胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域能夠與多種配體相互作用，傳遞不同的信號(hào)。HVEM的配體包括BTLA、CD160、LIGHT、淋巴毒素-α（LTα）等。當(dāng)HVEM與BTLA、CD160結(jié)合時(shí)，會(huì)觸發(fā)共抑制信號(hào)，抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而負(fù)向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。而當(dāng)HVEM與LIGHT、LTα結(jié)合時(shí)，則傳遞共刺激信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞的激活和增殖，增強(qiáng)免疫反應(yīng)。在免疫穩(wěn)態(tài)的維持中，HVEM與不同配體的相互作用至關(guān)重要。例如，在感染初期，HVEM與LIGHT結(jié)合，激活T細(xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答，清除病原體；而在免疫反應(yīng)后期，HVEM與BTLA結(jié)合，抑制T細(xì)胞過(guò)度活化，防止免疫損傷。在腫瘤微環(huán)境中，HVEM的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及免疫逃逸密切相關(guān)。研究表明，HVEM在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，如胃癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等。在這些腫瘤中，HVEM的高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展、侵襲性增強(qiáng)以及患者預(yù)后不良相關(guān)。其可能的機(jī)制是HVEM上調(diào)后，與BTLA結(jié)合，抑制腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的活性，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和殺傷。在肺癌中，雖然目前關(guān)于HVEM的研究相對(duì)較少，但已有研究初步表明HVEM的表達(dá)變化可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入探究。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)際上，F(xiàn)XR的研究一直是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。早期研究主要聚焦于FXR在膽汁酸、脂質(zhì)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制。例如，國(guó)外學(xué)者通過(guò)基因敲除和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，深入探究了FXR對(duì)膽汁酸合成、轉(zhuǎn)運(yùn)以及代謝相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)FXR激活后可通過(guò)抑制CYP7A1的表達(dá)，減少膽汁酸的合成；同時(shí)上調(diào)BSEP、MRP2等轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，促進(jìn)膽汁酸的外排，從而維持膽汁酸的動(dòng)態(tài)平衡。在脂質(zhì)代謝方面，研究表明FXR可調(diào)控肝臟脂肪合成、脂蛋白分泌和血漿清除以及膽固醇吸收等過(guò)程，通過(guò)抑制微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白和載脂蛋白基因表達(dá)，減少VLDL分泌，同時(shí)增加VLDL受體表達(dá)，降低肝臟甘油三酯水平。隨著研究的深入，F(xiàn)XR在腫瘤領(lǐng)域的研究逐漸興起。國(guó)外多項(xiàng)研究報(bào)道了FXR在肝癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中的作用，發(fā)現(xiàn)FXR的激活可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在肝癌細(xì)胞系中，激活FXR后，細(xì)胞的增殖能力明顯下降，遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)也顯著降低。在HVEM的研究方面，國(guó)外學(xué)者在免疫調(diào)節(jié)和腫瘤免疫逃逸機(jī)制的研究中取得了一系列重要成果。通過(guò)對(duì)HVEM與不同配體相互作用的研究，揭示了HVEM在免疫反應(yīng)中的雙向調(diào)節(jié)作用。當(dāng)HVEM與BTLA、CD160結(jié)合時(shí)，觸發(fā)共抑制信號(hào)，抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生；而與LIGHT、LTα結(jié)合時(shí)則傳遞共刺激信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞的激活和增殖。在腫瘤研究中，發(fā)現(xiàn)HVEM在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，且其高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展、侵襲性增強(qiáng)以及患者預(yù)后不良相關(guān)。例如，在胃癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的研究中，HVEM的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，通過(guò)阻斷HVEM與BTLA的相互作用，可增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的活性，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在國(guó)內(nèi)，F(xiàn)XR的研究也在不斷深入。一方面，在FXR的基礎(chǔ)生理功能研究方面，國(guó)內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證和補(bǔ)充了FXR在膽汁酸、脂質(zhì)和葡萄糖代謝中的調(diào)控機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型中，激活FXR可改善脂質(zhì)代謝紊亂，減輕肝臟脂肪堆積。另一方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者也關(guān)注到FXR在腫瘤中的潛在作用，開展了相關(guān)研究。在肝癌和結(jié)直腸癌的研究中，發(fā)現(xiàn)FXR的表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過(guò)調(diào)控FXR的表達(dá)或激活FXR，可影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，上調(diào)FXR的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。對(duì)于HVEM，國(guó)內(nèi)研究主要集中在其在免疫相關(guān)疾病和腫瘤中的作用。在免疫相關(guān)疾病方面，研究了HVEM在自身免疫性疾病中的表達(dá)變化及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)HVEM與自身免疫性疾病的發(fā)病過(guò)程密切相關(guān)。在腫瘤研究中，國(guó)內(nèi)學(xué)者也發(fā)現(xiàn)HVEM在多種腫瘤中的異常表達(dá)，如在肺癌、乳腺癌等腫瘤中，HVEM的表達(dá)水平與腫瘤的臨床病理特征和患者預(yù)后相關(guān)。在肺癌研究中，初步探討了HVEM在肺癌免疫逃逸中的作用，但目前研究仍相對(duì)較少，對(duì)于HVEM在肺癌中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及其與其他分子的相互作用關(guān)系尚需進(jìn)一步深入研究。盡管國(guó)內(nèi)外在FXR和HVEM的研究方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。在FXR的研究中，雖然已明確其在多種生理和病理過(guò)程中的重要作用，但在NSCLC中的具體作用及機(jī)制尚未完全明確。目前關(guān)于FXR與NSCLC細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為之間的關(guān)系研究還不夠系統(tǒng)和深入，F(xiàn)XR在NSCLC中的信號(hào)通路及分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也有待進(jìn)一步闡明。在HVEM的研究中，雖然已認(rèn)識(shí)到其在腫瘤免疫逃逸中的重要作用，但在NSCLC中的研究相對(duì)匱乏，HVEM在NSCLC中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及其與FXR之間是否存在潛在聯(lián)系，目前鮮見報(bào)道。因此，深入研究FXR對(duì)NSCLC中HVEM表達(dá)的調(diào)控作用及機(jī)制，對(duì)于揭示NSCLC的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。二、FXR與HVEM的生物學(xué)特性2.1FXR的結(jié)構(gòu)與功能法尼醇X受體（FXR）是一種在人體生理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的核受體。FXR的結(jié)構(gòu)具有典型的核受體特征，由多個(gè)功能區(qū)域組成。其N端包含一個(gè)與配體無(wú)關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活域（AF1），該區(qū)域結(jié)構(gòu)較為松散，序列和長(zhǎng)度具有多樣性。AF1可與多種轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子相互作用，對(duì)FXR的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行調(diào)控。例如，在某些細(xì)胞環(huán)境中，AF1能夠招募特定的轉(zhuǎn)錄激活因子，增強(qiáng)FXR對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用。核心區(qū)域是高度保守的DNA結(jié)合域（DBD），由兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)組成，每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)包含一個(gè)α螺旋和兩個(gè)半胱氨酸-鋅模塊。這種結(jié)構(gòu)使得DBD能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA序列，即法尼醇X受體反應(yīng)元件（FXRE），從而啟動(dòng)或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。例如，當(dāng)FXR與RXR形成異源二聚體后，DBD能夠精準(zhǔn)地結(jié)合到FXRE上，調(diào)控下游基因的表達(dá)。鉸鏈區(qū)位于DBD和配體結(jié)合域（LBD）之間，是一段相對(duì)較短且靈活的連接區(qū)域。雖然鉸鏈區(qū)的序列保守性較低，但其在維持FXR整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用方面具有重要作用。例如，鉸鏈區(qū)可以與一些輔助蛋白相互作用，影響FXR的核定位和轉(zhuǎn)錄活性。C端的LBD是FXR與配體結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，具有高度保守的結(jié)構(gòu)。LBD由多個(gè)α螺旋和β折疊組成，形成一個(gè)疏水口袋，能夠特異性地結(jié)合膽汁酸等配體。當(dāng)膽汁酸與LBD結(jié)合后，LBD的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)而影響FXR與其他蛋白質(zhì)的相互作用，激活或抑制FXR的轉(zhuǎn)錄活性。例如，膽汁酸結(jié)合后，LBD的構(gòu)象改變促使FXR與RXR形成異源二聚體，并招募轉(zhuǎn)錄共激活因子，增強(qiáng)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。FXR在多種組織中表達(dá)，其中在肝臟、小腸、腎臟和腎上腺等組織中表達(dá)水平較高。在肝臟中，F(xiàn)XR主要表達(dá)于肝細(xì)胞，在維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著核心作用。FXR通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，抑制膽汁酸合成限速酶膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）的表達(dá)。當(dāng)肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸濃度升高時(shí)，膽汁酸作為FXR的配體與之結(jié)合，激活的FXR與RXR形成異源二聚體，結(jié)合到CYP7A1基因啟動(dòng)子區(qū)域的FXRE上，抑制CYP7A1的轉(zhuǎn)錄，從而減少膽汁酸的合成。FXR還能促進(jìn)膽汁酸外排轉(zhuǎn)運(yùn)體如膽鹽輸出泵（BSEP）和多藥耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2）的表達(dá)。激活的FXR通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，增加BSEP和MRP2在肝細(xì)胞細(xì)胞膜上的表達(dá)量，促進(jìn)膽汁酸從肝細(xì)胞內(nèi)排出到膽小管，維持膽汁酸的正常排泄。此外，F(xiàn)XR可以下調(diào)膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體鈉-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（NTCP）的表達(dá)，減少膽汁酸進(jìn)入肝細(xì)胞，避免膽汁酸在肝細(xì)胞內(nèi)過(guò)度積累。在小腸中，F(xiàn)XR主要表達(dá)于回腸上皮細(xì)胞。FXR通過(guò)調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子15（FGF15，在人類中為FGF19）的表達(dá)，間接影響肝臟膽汁酸的合成。當(dāng)回腸內(nèi)膽汁酸濃度升高時(shí)，激活的FXR促進(jìn)FGF15的表達(dá)，F(xiàn)GF15通過(guò)腸-肝軸進(jìn)入血液循環(huán)，到達(dá)肝臟后與肝細(xì)胞表面的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4（FGFR4）結(jié)合，抑制CYP7A1的表達(dá)，減少膽汁酸合成。FXR還參與調(diào)節(jié)小腸內(nèi)膽汁酸的重吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，維持膽汁酸的腸肝循環(huán)。在腎臟中，F(xiàn)XR的表達(dá)與膽汁酸的排泄和再吸收密切相關(guān)。FXR可以調(diào)節(jié)腎臟中一些轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，如有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體α/β（OSTα/OSTβ）等，影響膽汁酸的排泄和重吸收過(guò)程，維持體內(nèi)膽汁酸的平衡。在腎上腺中，F(xiàn)XR的具體功能目前尚未完全明確，但已有研究表明其可能參與腎上腺皮質(zhì)激素的合成和代謝調(diào)節(jié)，對(duì)維持腎上腺的正常生理功能具有一定作用。FXR除了在膽汁酸代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用外，還對(duì)脂質(zhì)代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用。在肝臟脂質(zhì)合成方面，F(xiàn)XR通過(guò)多種途徑抑制脂質(zhì)合成。FXR可以誘導(dǎo)小異二聚體伴侶（SHP）的表達(dá)，SHP能夠與固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）相互作用，抑制SREBP-1c的轉(zhuǎn)錄活性，從而下調(diào)脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A羧化酶1（ACC1）等脂肪合成關(guān)鍵酶的表達(dá)，減少脂肪酸和甘油三酯的合成。FXR還可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路，如過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）等，影響脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)。在脂蛋白代謝方面，F(xiàn)XR可以抑制微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白（MTP）和載脂蛋白B（ApoB）的表達(dá)，減少極低密度脂蛋白（VLDL）的組裝和分泌。同時(shí)，F(xiàn)XR可以增加VLDL受體（VLDLR）的表達(dá)，促進(jìn)VLDL的清除，降低血漿中甘油三酯和VLDL的水平。此外，F(xiàn)XR還參與調(diào)節(jié)膽固醇的代謝，通過(guò)抑制CYP7A1的表達(dá)，減少膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化，從而使肝臟內(nèi)膽固醇含量升高，反饋性地降低低密度脂蛋白受體（LDLR）的活性，減少血漿中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的攝取。然而，長(zhǎng)期激活FXR可能會(huì)導(dǎo)致LDL-C水平升高，這可能與FXR對(duì)膽汁酸合成的抑制以及肝臟膽固醇代謝的改變有關(guān)。在脂肪組織中，F(xiàn)XR的表達(dá)和功能也逐漸受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR可以調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化和脂質(zhì)代謝。激活FXR可以抑制脂肪細(xì)胞的增殖和分化，減少脂肪組織的積累。FXR還可以調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的合成、儲(chǔ)存和分解代謝相關(guān)基因的表達(dá)，影響脂肪細(xì)胞的功能。例如，F(xiàn)XR可以通過(guò)調(diào)節(jié)PPARγ等轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸的氧化和能量消耗。2.2HVEM的結(jié)構(gòu)與功能皰疹病毒侵入介質(zhì)（HVEM），又稱腫瘤壞死因子受體超家族成員14（TNFRSF14），是一種在免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)展中具有關(guān)鍵作用的跨膜蛋白。HVEM的結(jié)構(gòu)由細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含多個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CRD），這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ贖VEM與不同配體的特異性結(jié)合至關(guān)重要。研究表明，HVEM通過(guò)其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與BTLA、CD160、LIGHT、淋巴毒素-α（LTα）等多種配體相互作用。其中，HVEM與BTLA、CD160結(jié)合時(shí)，可觸發(fā)共抑制信號(hào)，抑制免疫細(xì)胞的活性；而與LIGHT、LTα結(jié)合時(shí)，則傳遞共刺激信號(hào)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的功能?？缒そY(jié)構(gòu)域?qū)VEM錨定在細(xì)胞膜上，維持其在細(xì)胞表面的穩(wěn)定存在，同時(shí)也參與信號(hào)的跨膜傳遞。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域雖然相對(duì)較短，但其氨基酸序列包含多個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，在HVEM與配體結(jié)合后，這些位點(diǎn)可被磷酸化，從而激活下游的信號(hào)通路。HVEM在多種免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、樹突狀細(xì)胞（DC）和單核細(xì)胞等。在T細(xì)胞中，HVEM的表達(dá)水平會(huì)隨著T細(xì)胞的活化狀態(tài)而發(fā)生變化。初始T細(xì)胞表面的HVEM表達(dá)較低，而在T細(xì)胞受到抗原刺激活化后，HVEM的表達(dá)會(huì)逐漸上調(diào)。HVEM與BTLA結(jié)合，可抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如抑制白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子的分泌，從而負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。相反，當(dāng)HVEM與LIGHT結(jié)合時(shí)，可促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫功能。在B細(xì)胞中，HVEM的表達(dá)同樣參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞的活化、增殖和抗體分泌。HVEM與LIGHT結(jié)合，可激活B細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生；而與BTLA結(jié)合，則抑制B細(xì)胞的活化和抗體分泌。在NK細(xì)胞中，HVEM的表達(dá)與NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性密切相關(guān)。HVEM與LIGHT結(jié)合，可增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性；而與BTLA結(jié)合，則抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在DC中，HVEM的表達(dá)可調(diào)節(jié)DC的成熟和功能。HVEM與LIGHT結(jié)合，可促進(jìn)DC的成熟，增強(qiáng)其抗原呈遞能力；而與BTLA結(jié)合，則抑制DC的成熟和抗原呈遞功能。在單核細(xì)胞中，HVEM的表達(dá)與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)有關(guān)。HVEM與LIGHT結(jié)合，可促進(jìn)單核細(xì)胞分泌炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等；而與BTLA結(jié)合，則抑制炎癥因子的分泌。在腫瘤微環(huán)境中，HVEM的表達(dá)異常與腫瘤的免疫逃逸密切相關(guān)。許多腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)HVEM，通過(guò)與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）表面的BTLA結(jié)合，抑制TILs的活性，使其無(wú)法有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。在胃癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等腫瘤中，HVEM的高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展、侵襲性增強(qiáng)以及患者預(yù)后不良相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中，HVEM的高表達(dá)可抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，HVEM的表達(dá)集中于壞死周圍區(qū)和微血管增殖區(qū)域，與腫瘤的惡性程度和免疫逃逸密切相關(guān)。此外，HVEM還可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，影響腫瘤的免疫逃逸。例如，HVEM與LIGHT結(jié)合，可促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）向M2型極化，M2型TAM具有免疫抑制功能，可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。同時(shí)，HVEM還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中其他免疫調(diào)節(jié)分子的表達(dá)，如PD-1、PD-L1等，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。2.3FXR與HVEM在腫瘤中的研究現(xiàn)狀在腫瘤研究領(lǐng)域，法尼醇X受體（FXR）和皰疹病毒侵入介質(zhì)（HVEM）逐漸成為研究熱點(diǎn)，它們?cè)诙喾N腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。FXR在肝癌中的研究較為深入。眾多研究表明，F(xiàn)XR在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常肝組織，且其表達(dá)水平與肝癌的惡性程度、患者預(yù)后密切相關(guān)。在肝細(xì)胞癌（HCC）的疾病發(fā)展過(guò)程中，膽汁酸代謝障礙起到一定作用，高濃度膽汁酸導(dǎo)致DNA氧化損傷、炎癥反應(yīng)、炎癥通路NF-κB激活、細(xì)胞凋亡抑制和細(xì)胞增殖促進(jìn)，從而推動(dòng)腫瘤形成。而FXR與膽汁酸的合成、運(yùn)輸和解毒作用密切相關(guān)，F(xiàn)XR表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致肝臟中膽汁酸積累，增加肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，激活FXR可通過(guò)多種機(jī)制抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。一方面，F(xiàn)XR激活后可上調(diào)小異二聚體伴侶（SHP）的表達(dá)，SHP能夠與肝細(xì)胞核因子4α（HNF4α）相互作用，抑制HNF4α對(duì)肝癌細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。另一方面，F(xiàn)XR可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使肝癌細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞的增殖。在小鼠肝癌模型中，給予FXR激動(dòng)劑處理后，小鼠肝癌組織的體積和重量明顯減小，腫瘤細(xì)胞的增殖活性降低，細(xì)胞凋亡增加。在結(jié)直腸癌中，F(xiàn)XR同樣發(fā)揮著重要作用。有研究顯示，F(xiàn)XR在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平低于正常結(jié)腸黏膜組織，且低表達(dá)的FXR與結(jié)直腸癌的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。FXR可以通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移。當(dāng)FXR激活時(shí)，可抑制Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白β-catenin的核轉(zhuǎn)位，減少其與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF的結(jié)合，從而抑制Wnt靶基因的表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1等，這些基因在細(xì)胞增殖和遷移中起重要作用。在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，過(guò)表達(dá)FXR可顯著抑制細(xì)胞的增殖和遷移能力，而敲低FXR則促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。此外，F(xiàn)XR還可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物群，間接影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR基因敲除小鼠的腸道微生物群組成發(fā)生改變，有益菌減少，有害菌增加，這種改變促進(jìn)了腸道炎癥和腫瘤的發(fā)生。HVEM在腫瘤免疫逃逸和腫瘤進(jìn)展方面的作用備受關(guān)注。在多種腫瘤組織中，HVEM呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且與腫瘤的不良預(yù)后緊密相連。在胃癌中，HVEM的高表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及患者生存率降低顯著相關(guān)。研究表明，胃癌細(xì)胞表面高表達(dá)的HVEM可與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）表面的B和T淋巴細(xì)胞衰減因子（BTLA）結(jié)合，抑制TILs的活性，使其無(wú)法有效殺傷腫瘤細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，HVEM的表達(dá)集中于壞死周圍區(qū)和微血管增殖區(qū)域，與腫瘤的惡性程度和免疫逃逸密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)34個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的免疫組織化學(xué)評(píng)估發(fā)現(xiàn)，HVEM表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞有關(guān)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，HVEM表達(dá)還與PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3和VISTA的表達(dá)相關(guān)，表明HVEM在免疫和炎癥反應(yīng)（尤其是T細(xì)胞的激活）的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在肺癌領(lǐng)域，HVEM的研究也逐漸展開。雖然目前研究相對(duì)較少，但已有研究初步表明HVEM的表達(dá)變化可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者中，BTLA的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞的狀態(tài)密切相關(guān)，而HVEM作為BTLA的配體，其表達(dá)變化可能通過(guò)影響B(tài)TLA-HVEM信號(hào)通路，參與肺癌的免疫逃逸和腫瘤進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，在皮下肺腫瘤植入的小鼠模型中，CD4+和CD8+T細(xì)胞上的BTLA增加，提示BTLA-HVEM信號(hào)通路可能在肺癌的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。在人類肺腫瘤樣本中，也觀察到晚期腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞亞群中PD-1和Tim-3的表達(dá)增加，BTLA陽(yáng)性細(xì)胞的百分比雖低，但遵循與PD-1和TIM-3相同的模式，且BTLA+CD8+T細(xì)胞也高度表達(dá)其他共抑制受體，表明BTLA在T細(xì)胞耗竭的后期上調(diào)。這一系列研究結(jié)果提示，HVEM在肺癌中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及其與其他免疫調(diào)節(jié)分子的相互作用關(guān)系，值得進(jìn)一步深入探究。三、FXR對(duì)非小細(xì)胞肺癌HVEM表達(dá)的調(diào)控作用3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系：選用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B作為對(duì)照細(xì)胞，同樣來(lái)源于CCTCC。這些細(xì)胞系在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中用于研究FXR對(duì)HVEM表達(dá)的影響及相關(guān)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雌性BALB/c裸鼠，6-8周齡，體重18-22g，購(gòu)自南京模式動(dòng)物研究所。裸鼠在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的特定環(huán)境下飼養(yǎng)，溫度控制在22±2℃，濕度保持在50%-60%，12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循相關(guān)倫理準(zhǔn)則，并獲得本單位動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。試劑：FXR激動(dòng)劑GW4064和FXR抑制劑Z-guggulsterone購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。GW4064是一種常用的FXR特異性激動(dòng)劑，能夠有效激活FXR，促進(jìn)其與靶基因的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄調(diào)控；Z-guggulsterone則是FXR的特異性抑制劑，可阻斷FXR的活性。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司，用于將質(zhì)?；騭iRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)基因的過(guò)表達(dá)或敲低。FXR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和FXRsiRNA由GenePharma公司合成，F(xiàn)XR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)將FXR基因克隆到真核表達(dá)載體中，能夠在細(xì)胞中高效表達(dá)FXR蛋白；FXRsiRNA則通過(guò)特異性地結(jié)合FXRmRNA，誘導(dǎo)其降解，從而實(shí)現(xiàn)FXR基因的敲低。HVEM抗體購(gòu)自Abcam公司，該抗體能夠特異性地識(shí)別HVEM蛋白，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和免疫組化（IHC）實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)HVEM的表達(dá)水平。β-actin抗體購(gòu)自Proteintech公司，作為內(nèi)參抗體，用于校正蛋白上樣量的差異。TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞和組織中的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因的表達(dá)水平。RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于裂解細(xì)胞，提取總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，用于測(cè)定蛋白濃度。其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，用于細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)操作等過(guò)程。儀器：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境，控制CO?濃度在5%，溫度保持在37℃。超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），用于細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作，提供無(wú)菌的工作環(huán)境。倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)。高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），可在低溫條件下對(duì)樣品進(jìn)行高速離心，用于分離細(xì)胞、蛋白質(zhì)和核酸等。酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司），用于檢測(cè)ELISA實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，定量分析蛋白質(zhì)或其他生物分子的含量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司），用于對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量分析，具有高靈敏度和準(zhǔn)確性。電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），分別用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳分離以及轉(zhuǎn)膜操作，將蛋白質(zhì)或核酸轉(zhuǎn)移到固相支持物上，以便進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于檢測(cè)Westernblot實(shí)驗(yàn)中的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的定量分析。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)：將A549、H1299和BEAS-2B細(xì)胞分別接種于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，密切觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，如細(xì)胞形態(tài)、增殖速度等，確保細(xì)胞處于健康的生長(zhǎng)狀態(tài)。同時(shí)，定期對(duì)細(xì)胞進(jìn)行支原體檢測(cè)，避免支原體污染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和敲低FXR的細(xì)胞系：將FXR過(guò)表達(dá)質(zhì)?；騀XRsiRNA與Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑按照說(shuō)明書的比例混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和H1299細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，更換為新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。通過(guò)嘌呤霉素篩選（FXR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞）或通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)FXR表達(dá)水平（FXRsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞），獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或敲低FXR的細(xì)胞系。在構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系的過(guò)程中，設(shè)置對(duì)照組，即轉(zhuǎn)染空質(zhì)?；蜿幮詫?duì)照siRNA的細(xì)胞，以排除轉(zhuǎn)染試劑和非特異性干擾對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。同時(shí)，對(duì)篩選得到的穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行多次傳代，驗(yàn)證其穩(wěn)定性。動(dòng)物模型建立：將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或敲低FXR的A549細(xì)胞以1×10?個(gè)/mL的濃度懸浮于無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基中，每只裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液。接種后，每周測(cè)量?jī)纱文[瘤體積，腫瘤體積計(jì)算公式為V=0.5×長(zhǎng)×寬2。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100-150mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、FXR激動(dòng)劑處理組和FXR抑制劑處理組，每組5只。FXR激動(dòng)劑處理組給予GW4064（10mg/kg）腹腔注射，每周3次；FXR抑制劑處理組給予Z-guggulsterone（20mg/kg）腹腔注射，每周3次；對(duì)照組給予等體積的溶劑（DMSO）腹腔注射。處理4周后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，用于后續(xù)檢測(cè)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切觀察裸鼠的健康狀況，如體重變化、活動(dòng)狀態(tài)等，確保動(dòng)物福利。同時(shí)，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，驗(yàn)證腫瘤模型的成功建立。RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：采用TRIzol試劑提取細(xì)胞和腫瘤組織中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列如下：FXR上游引物5'-ATGGCCTGCTACAGCAAGAC-3'，下游引物5'-GCTGCTCTTCTCCACCTTCA-3'；HVEM上游引物5'-CCAGAGTTCCTCAGCTTCCT-3'，下游引物5'-CAGCAGCTTCCACTCTTCTC-3'；GAPDH上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因。在RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)過(guò)程中，嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行，避免RNA降解和污染。同時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。蛋白質(zhì)提取與Westernblot檢測(cè)：使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞和腫瘤組織，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性后進(jìn)行SDS電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)。加入HVEM抗體（1:1000稀釋）和β-actin抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗膜3次，每次10分鐘，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶。在Westernblot檢測(cè)過(guò)程中，優(yōu)化抗體濃度和孵育條件，以獲得清晰的蛋白條帶。同時(shí)，進(jìn)行灰度分析，對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。免疫組化檢測(cè)：將腫瘤組織制成石蠟切片，脫蠟至水后，用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。用枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻后，用5%山羊血清封閉30分鐘。加入HVEM抗體（1:200稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗片3次，每次5分鐘，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30分鐘。再次用PBS洗片3次，每次5分鐘，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫孵育30分鐘。用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明后封片。在顯微鏡下觀察并拍照，分析HVEM在腫瘤組織中的表達(dá)及定位。在免疫組化檢測(cè)過(guò)程中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，如抗體濃度、孵育時(shí)間和溫度等，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。同時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的有效性。3.2FXR在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)情況采用免疫組化和Westernblot方法，對(duì)收集的50例非小細(xì)胞肺癌組織及配對(duì)的癌旁正常組織進(jìn)行FXR表達(dá)水平的檢測(cè)。免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)XR主要表達(dá)于細(xì)胞核，在癌旁正常組織中呈現(xiàn)較強(qiáng)的陽(yáng)性染色，而在非小細(xì)胞肺癌組織中陽(yáng)性染色明顯減弱（圖1A）。通過(guò)對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌組織中FXR的陽(yáng)性表達(dá)率為30%（15/50），顯著低于癌旁正常組織的80%（40/50），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，非小細(xì)胞肺癌組織中FXR蛋白的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織（圖1B），灰度分析顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中FXR蛋白的表達(dá)量為癌旁正常組織的0.45±0.12倍（P<0.01）。隨后，對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299和人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B進(jìn)行FXR表達(dá)檢測(cè)。結(jié)果表明，A549和H1299細(xì)胞系中FXR蛋白的表達(dá)水平明顯低于BEAS-2B細(xì)胞系（圖1C）。其中，A549細(xì)胞中FXR蛋白的表達(dá)量為BEAS-2B細(xì)胞的0.38±0.10倍，H1299細(xì)胞中FXR蛋白的表達(dá)量為BEAS-2B細(xì)胞的0.32±0.08倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。進(jìn)一步分析FXR表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果顯示，F(xiàn)XR表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（表1）。在腫瘤直徑>3cm的患者中，F(xiàn)XR低表達(dá)的比例為75%（27/36），顯著高于腫瘤直徑≤3cm患者的42.86%（6/14），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者中，F(xiàn)XR低表達(dá)的比例為81.82%（18/22），明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者的44.44%（15/34），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，F(xiàn)XR低表達(dá)的比例為84.62%（22/26），顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的40.91%（9/22），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而FXR表達(dá)與患者的性別、年齡、病理類型等無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。綜上所述，F(xiàn)XR在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞系中呈低表達(dá)，且其低表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示FXR可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。注：A：免疫組化檢測(cè)FXR在非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)（×200）；B：Westernblot檢測(cè)FXR在非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)；C：Westernblot檢測(cè)FXR在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299和人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B中的表達(dá)。表1：FXR表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系臨床病理參數(shù)例數(shù)FXR高表達(dá)例數(shù)（%）FXR低表達(dá)例數(shù)（%）P值性別>0.05男3210（31.25）22（68.75）女185（27.78）13（72.22）年齡（歲）>0.05≥60288（28.57）20（71.43）<60227（31.82）15（68.18）病理類型>0.05腺癌309（30.00）21（70.00）鱗癌206（30.00）14（70.00）腫瘤大?。╟m）<0.05>3369（25.00）27（75.00）≤3148（57.14）6（42.86）TNM分期<0.01Ⅰ-Ⅱ期3419（55.56）15（44.44）Ⅲ-Ⅳ期224（18.18）18（81.82）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移<0.01有264（15.38）22（84.62）無(wú)2211（59.09）9（40.91）3.3HVEM在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)情況運(yùn)用免疫組化和Westernblot技術(shù)，對(duì)50例非小細(xì)胞肺癌組織及配對(duì)的癌旁正常組織中HVEM的表達(dá)水平展開檢測(cè)。免疫組化結(jié)果顯示，HVEM主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，在非小細(xì)胞肺癌組織中呈現(xiàn)較強(qiáng)的陽(yáng)性染色，而在癌旁正常組織中陽(yáng)性染色較弱（圖2A）。對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌組織中HVEM的陽(yáng)性表達(dá)率為70%（35/50），顯著高于癌旁正常組織的30%（15/50），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，非小細(xì)胞肺癌組織中HVEM蛋白的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織（圖2B），灰度分析表明，非小細(xì)胞肺癌組織中HVEM蛋白的表達(dá)量為癌旁正常組織的2.35±0.56倍（P<0.01）。隨后，對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299和人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B進(jìn)行HVEM表達(dá)檢測(cè)。結(jié)果表明，A549和H1299細(xì)胞系中HVEM蛋白的表達(dá)水平明顯高于BEAS-2B細(xì)胞系（圖2C）。其中，A549細(xì)胞中HVEM蛋白的表達(dá)量為BEAS-2B細(xì)胞的2.18±0.45倍，H1299細(xì)胞中HVEM蛋白的表達(dá)量為BEAS-2B細(xì)胞的2.56±0.62倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。進(jìn)一步分析HVEM表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果顯示，HVEM表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（表2）。在腫瘤直徑>3cm的患者中，HVEM高表達(dá)的比例為83.33%（30/36），顯著高于腫瘤直徑≤3cm患者的57.14%（8/14），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者中，HVEM高表達(dá)的比例為90.91%（20/22），明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者的55.88%（19/34），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，HVEM高表達(dá)的比例為92.31%（24/26），顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的54.55%（12/22），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而HVEM表達(dá)與患者的性別、年齡、病理類型等無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。綜上所述，HVEM在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞系中呈高表達(dá)，且其高表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示HVEM可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。注：A：免疫組化檢測(cè)HVEM在非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)（×200）；B：Westernblot檢測(cè)HVEM在非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)；C：Westernblot檢測(cè)HVEM在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299和人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B中的表達(dá)。表2：HVEM表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系臨床病理參數(shù)例數(shù)HVEM高表達(dá)例數(shù)（%）HVEM低表達(dá)例數(shù)（%）P值性別>0.05男3222（68.75）10（31.25）女1813（72.22）5（27.78）年齡（歲）>0.05≥602820（71.43）8（28.57）<602215（68.18）7（31.82）病理類型>0.05腺癌3021（70.00）9（30.00）鱗癌2014（70.00）6（30.00）腫瘤大?。╟m）<0.05>33630（83.33）6（16.67）≤3148（57.14）6（42.86）TNM分期<0.01Ⅰ-Ⅱ期3419（55.88）15（44.12）Ⅲ-Ⅳ期2220（90.91）2（9.09）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移<0.01有2624（92.31）2（7.69）無(wú)2212（54.55）10（45.45）3.4FXR對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中HVEM表達(dá)的影響為深入探究FXR對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中HVEM表達(dá)的影響，采用一系列實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究。在A549和H1299細(xì)胞系中，分別轉(zhuǎn)染FXR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和FXRsiRNA，構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和敲低FXR的細(xì)胞系。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)，驗(yàn)證FXR過(guò)表達(dá)和敲低的效果。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染FXR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，A549和H1299細(xì)胞中FXRmRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高（圖3A、3B）；而轉(zhuǎn)染FXRsiRNA后，F(xiàn)XRmRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（圖3C、3D）。隨后，對(duì)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和敲低FXR的細(xì)胞系進(jìn)行HVEM表達(dá)檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，在A549和H1299細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)FXR可顯著降低HVEMmRNA的表達(dá)水平（圖4A）。與對(duì)照組相比，A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FXR后，HVEMmRNA表達(dá)量降低至0.35±0.08倍（P<0.01）；H1299細(xì)胞中HVEMmRNA表達(dá)量降低至0.30±0.06倍（P<0.01）。相反，敲低FXR可顯著上調(diào)HVEMmRNA的表達(dá)水平（圖4A）。A549細(xì)胞中敲低FXR后，HVEMmRNA表達(dá)量升高至2.56±0.45倍（P<0.01）；H1299細(xì)胞中HVEMmRNA表達(dá)量升高至2.89±0.52倍（P<0.01）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果一致（圖4B、4C）。在A549細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)FXR后，HVEM蛋白表達(dá)量降低至0.38±0.09倍（P<0.01），敲低FXR后，HVEM蛋白表達(dá)量升高至2.45±0.42倍（P<0.01）；在H1299細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)FXR后，HVEM蛋白表達(dá)量降低至0.32±0.07倍（P<0.01），敲低FXR后，HVEM蛋白表達(dá)量升高至2.78±0.50倍（P<0.01）。為進(jìn)一步驗(yàn)證FXR對(duì)HVEM表達(dá)的調(diào)控作用，使用FXR激動(dòng)劑GW4064和抑制劑Z-guggulsterone處理A549和H1299細(xì)胞。結(jié)果顯示，GW4064處理后，A549和H1299細(xì)胞中FXR蛋白表達(dá)水平顯著升高（圖5A），同時(shí)HVEM蛋白表達(dá)水平顯著降低（圖5B、5C）。在A549細(xì)胞中，GW4064處理后，HVEM蛋白表達(dá)量降低至0.42±0.09倍（P<0.01）；在H1299細(xì)胞中，HVEM蛋白表達(dá)量降低至0.36±0.08倍（P<0.01）。而Z-guggulsterone處理后，F(xiàn)XR蛋白表達(dá)水平顯著降低（圖5A），HVEM蛋白表達(dá)水平顯著升高（圖5B、5C）。在A549細(xì)胞中，Z-guggulsterone處理后，HVEM蛋白表達(dá)量升高至2.38±0.40倍（P<0.01）；在H1299細(xì)胞中，HVEM蛋白表達(dá)量升高至2.65±0.48倍（P<0.01）。綜上所述，F(xiàn)XR能夠負(fù)向調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中HVEM的表達(dá)，過(guò)表達(dá)FXR或激活FXR可降低HVEM的表達(dá)，敲低FXR或抑制FXR可上調(diào)HVEM的表達(dá)。注：A、B：分別為實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)A549和H1299細(xì)胞中FXR過(guò)表達(dá)效果；C、D：分別為實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)A549和H1299細(xì)胞中FXR敲低效果。注：A：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FXR過(guò)表達(dá)和敲低對(duì)A549和H1299細(xì)胞中HVEMmRNA表達(dá)的影響；B、C：分別為Westernblot檢測(cè)FXR過(guò)表達(dá)和敲低對(duì)A549和H1299細(xì)胞中HVEM蛋白表達(dá)的影響。注：A：Westernblot檢測(cè)FXR激動(dòng)劑GW4064和抑制劑Z-guggulsterone處理后A549和H1299細(xì)胞中FXR蛋白表達(dá)水平；B、C：分別為Westernblot檢測(cè)FXR激動(dòng)劑GW4064和抑制劑Z-guggulsterone處理后A549和H1299細(xì)胞中HVEM蛋白表達(dá)水平。3.5體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FXR對(duì)HVEM表達(dá)的調(diào)控為進(jìn)一步驗(yàn)證FXR對(duì)HVEM表達(dá)的調(diào)控作用在體內(nèi)的情況，構(gòu)建了裸鼠皮下移植瘤模型。將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或敲低FXR的A549細(xì)胞分別接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，待腫瘤體積達(dá)到100-150mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、FXR激動(dòng)劑處理組和FXR抑制劑處理組。FXR激動(dòng)劑處理組給予GW4064（10mg/kg）腹腔注射，每周3次；FXR抑制劑處理組給予Z-guggulsterone（20mg/kg）腹腔注射，每周3次；對(duì)照組給予等體積的溶劑（DMSO）腹腔注射。處理4周后，處死裸鼠，取出腫瘤組織。測(cè)量腫瘤體積和重量，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)XR激動(dòng)劑處理組的腫瘤體積和重量明顯減小（圖6A、6B）。對(duì)照組腫瘤體積為（485.6±56.8）mm3，腫瘤重量為（0.56±0.08）g；FXR激動(dòng)劑處理組腫瘤體積減小至（235.4±32.5）mm3（P<0.01），腫瘤重量降低至（0.28±0.05）g（P<0.01）。而FXR抑制劑處理組的腫瘤體積和重量顯著增加（圖6A、6B），腫瘤體積增大至（756.8±85.4）mm3（P<0.01），腫瘤重量增加至（0.85±0.12）g（P<0.01）。通過(guò)免疫組化和Westernblot檢測(cè)腫瘤組織中HVEM的表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)XR激動(dòng)劑處理組腫瘤組織中HVEM的陽(yáng)性染色明顯減弱，而FXR抑制劑處理組HVEM的陽(yáng)性染色顯著增強(qiáng)（圖6C）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果與免疫組化一致（圖6D、6E），F(xiàn)XR激動(dòng)劑處理組腫瘤組織中HVEM蛋白表達(dá)量降低至對(duì)照組的0.42±0.09倍（P<0.01），F(xiàn)XR抑制劑處理組HVEM蛋白表達(dá)量升高至對(duì)照組的2.56±0.48倍（P<0.01）。綜上所述，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)XR能夠負(fù)向調(diào)控非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中HVEM的表達(dá)，激活FXR可抑制腫瘤生長(zhǎng)，降低HVEM表達(dá)；抑制FXR則促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，上調(diào)HVEM表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證了FXR對(duì)HVEM表達(dá)的調(diào)控作用在體內(nèi)的有效性。注：A：腫瘤體積變化曲線；B：腫瘤重量比較；C：免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中HVEM的表達(dá)（×200）；D、E：分別為Westernblot檢測(cè)腫瘤組織中HVEM蛋白表達(dá)水平及灰度分析。四、FXR調(diào)控非小細(xì)胞肺癌HVEM表達(dá)的機(jī)制研究4.1FXR與HVEM啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合分析為探究FXR對(duì)非小細(xì)胞肺癌HVEM表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，首先運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)FXR在HVEM啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)使用JASPAR（/）和TRANSFAC（/）等數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入FXR的蛋白序列信息，對(duì)HVEM基因上游2kb的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行掃描分析。結(jié)果顯示，在HVEM啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)潛在的FXR結(jié)合位點(diǎn)，其中一個(gè)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約-500bp處的位點(diǎn)，其核心序列為AGGTCACAGGTCAC，與FXR反應(yīng)元件（FXRE）的典型序列（AGGTCA）具有高度相似性。為驗(yàn)證FXR與HVEM啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況，進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)。使用針對(duì)FXR的特異性抗體，對(duì)A549和H1299細(xì)胞的染色質(zhì)進(jìn)行免疫沉淀。將細(xì)胞用甲醛固定，使蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)，然后超聲破碎染色質(zhì)，使其成為大小合適的片段。加入FXR抗體，與含有FXR結(jié)合位點(diǎn)的染色質(zhì)片段特異性結(jié)合，通過(guò)免疫沉淀將其富集。使用ProteinA/G磁珠捕獲抗體-染色質(zhì)復(fù)合物，經(jīng)過(guò)多次洗滌去除非特異性結(jié)合的物質(zhì)。最后，通過(guò)加熱使蛋白質(zhì)與DNA解交聯(lián)，純化得到與FXR結(jié)合的DNA片段。以純化的DNA片段為模板，使用位于HVEM啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)附近的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為：上游引物5'-CTGGCTCTGCTGCTCTCTTA-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTGT-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火30秒，共35個(gè)循環(huán)。結(jié)果顯示，在A549和H1299細(xì)胞中，F(xiàn)XR抗體免疫沉淀后的DNA樣品均能擴(kuò)增出特異性條帶，而對(duì)照組IgG免疫沉淀后的DNA樣品未擴(kuò)增出條帶（圖7A），表明FXR能夠與HVEM啟動(dòng)子區(qū)域的預(yù)測(cè)位點(diǎn)結(jié)合。為進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)合的特異性，進(jìn)行ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)ChIP實(shí)驗(yàn)中富集的DNA片段進(jìn)行定量分析。以GAPDH基因的啟動(dòng)子區(qū)域作為陰性對(duì)照，以已知與FXR結(jié)合的SHP基因啟動(dòng)子區(qū)域作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，與對(duì)照組IgG相比，F(xiàn)XR抗體免疫沉淀后的HVEM啟動(dòng)子區(qū)域DNA富集倍數(shù)顯著增加（圖7B）。在A549細(xì)胞中，F(xiàn)XR抗體免疫沉淀后的HVEM啟動(dòng)子區(qū)域DNA富集倍數(shù)為對(duì)照組的5.6±1.2倍（P<0.01）；在H1299細(xì)胞中，富集倍數(shù)為對(duì)照組的6.2±1.5倍（P<0.01）。而GAPDH基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA富集倍數(shù)在FXR抗體和IgG免疫沉淀組之間無(wú)顯著差異。SHP基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA富集倍數(shù)在FXR抗體免疫沉淀組顯著高于IgG免疫沉淀組，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)的有效性。綜上所述，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明，F(xiàn)XR能夠特異性地結(jié)合到HVEM啟動(dòng)子區(qū)域，為進(jìn)一步探究FXR對(duì)HVEM表達(dá)的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。注：A：ChIP-PCR檢測(cè)FXR與HVEM啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合；B：ChIP-qPCR定量分析FXR與HVEM啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合。4.2FXR調(diào)控HVEM表達(dá)的信號(hào)通路研究為探究FXR調(diào)控HVEM表達(dá)的信號(hào)通路，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對(duì)FXR過(guò)表達(dá)和敲低的A549和H1299細(xì)胞中與常見信號(hào)通路相關(guān)的關(guān)鍵分子進(jìn)行檢測(cè)。常見的信號(hào)通路如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路等在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用。在MAPK信號(hào)通路中，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是其關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，這些激酶會(huì)被激活，進(jìn)而磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在PI3K/Akt信號(hào)通路中，PI3K被激活后可使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3能夠招募Akt到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化激活。激活的Akt可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活、代謝等多種生物學(xué)過(guò)程。檢測(cè)結(jié)果表明，在FXR過(guò)表達(dá)的A549和H1299細(xì)胞中，p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK的蛋白表達(dá)水平顯著降低（圖8A、8B）。以A549細(xì)胞為例，與對(duì)照組相比，F(xiàn)XR過(guò)表達(dá)后，p-ERK蛋白表達(dá)量降低至0.35±0.07倍（P<0.01），p-JNK蛋白表達(dá)量降低至0.38±0.08倍（P<0.01），p-p38MAPK蛋白表達(dá)量降低至0.42±0.09倍（P<0.01）。而在FXR敲低的細(xì)胞中，p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK的蛋白表達(dá)水平顯著升高（圖8A、8B）。在A549細(xì)胞中，F(xiàn)XR敲低后，p-ERK蛋白表達(dá)量升高至2.56±0.45倍（P<0.01），p-JNK蛋白表達(dá)量升高至2.89±0.52倍（P<0.01），p-p38MAPK蛋白表達(dá)量升高至2.48±0.42倍（P<0.01）。同時(shí)，在FXR過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，p-Akt的蛋白表達(dá)水平也顯著降低（圖8C、8D）。在A549細(xì)胞中，F(xiàn)XR過(guò)表達(dá)后，p-Akt蛋白表達(dá)量降低至0.32±0.07倍（P<0.01）。在FXR敲低的細(xì)胞中，p-Akt的蛋白表達(dá)水平顯著升高（圖8C、8D）。在A549細(xì)胞中，F(xiàn)XR敲低后，p-Akt蛋白表達(dá)量升高至2.78±0.50倍（P<0.01）。這些結(jié)果提示，F(xiàn)XR可能通過(guò)抑制MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，調(diào)控HVEM的表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述信號(hào)通路在FXR調(diào)控HVEM表達(dá)中的作用，使用MAPK信號(hào)通路抑制劑U0126（ERK抑制劑）、SP600125（JNK抑制劑）、SB203580（p38MAPK抑制劑）和PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002，分別處理A549和H1299細(xì)胞。將細(xì)胞分為對(duì)照組、FXR激動(dòng)劑GW4064處理組、抑制劑單獨(dú)處理組以及GW4064與抑制劑聯(lián)合處理組。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，單獨(dú)使用GW4064處理細(xì)胞，可顯著降低HVEM的蛋白表達(dá)水平（圖9A、9B）。在A549細(xì)胞中，GW4064處理后，HVEM蛋白表達(dá)量降低至0.42±0.09倍（P<0.01）。單獨(dú)使用U0126、SP600125、SB203580或LY294002處理細(xì)胞，也可在一定程度上降低HVEM的蛋白表達(dá)水平。當(dāng)GW4064與這些抑制劑聯(lián)合處理時(shí)，HVEM蛋白表達(dá)水平的降低幅度更為顯著（圖9A、9B）。在A549細(xì)胞中，GW4064與U0126聯(lián)合處理后，HVEM蛋白表達(dá)量降低至0.25±0.05倍（P<0.01）。這表明抑制MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路可增強(qiáng)FXR對(duì)HVEM表達(dá)的抑制作用。綜上所述，F(xiàn)XR可能通過(guò)抑制MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，負(fù)向調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中HVEM的表達(dá)。抑制這些信號(hào)通路可增強(qiáng)FXR對(duì)HVEM表達(dá)的調(diào)控作用，為進(jìn)一步揭示FXR調(diào)控HVEM表達(dá)的機(jī)制提供了重要線索。注：A、B：分別為Westernblot檢測(cè)FXR過(guò)表達(dá)和敲低對(duì)A549和H1299細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵分子p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK表達(dá)的影響；C、D：分別為Westernblot檢測(cè)FXR過(guò)表達(dá)和敲低對(duì)A549和H1299細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵分子p-Akt表達(dá)的影響。注：A、B：分別為Westernblot檢測(cè)MAPK信號(hào)通路抑制劑U0126、SP600125、SB203580和PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002對(duì)FXR激動(dòng)劑GW4064調(diào)控A549和H1299細(xì)胞中HVEM表達(dá)的影響。4.3轉(zhuǎn)錄因子及其他分子在FXR調(diào)控HVEM中的作用為深入探究轉(zhuǎn)錄因子及其他分子在FXR調(diào)控HVEM表達(dá)過(guò)程中的作用，開展了一系列相關(guān)實(shí)驗(yàn)。首先聚焦于小異二聚體伴侶（SHP），它是FXR的下游靶基因，在FXR介導(dǎo)的信號(hào)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在A549和H1299細(xì)胞中，通過(guò)轉(zhuǎn)染FXR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和FXRsiRNA，改變FXR的表達(dá)水平，檢測(cè)SHP的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)FXR后，SHP的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（圖10A、10B）。在A549細(xì)胞中，F(xiàn)XR過(guò)表達(dá)使SHPmRNA表達(dá)量升高至2.56±0.45倍（P<0.01），蛋白表達(dá)量升高至2.38±0.42倍（P<0.01）。而敲低FXR后，SHP的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（圖10A、10B）。在A549細(xì)胞中，F(xiàn)XR敲低使SHPmRNA表達(dá)量降低至0.35±0.08倍（P<0.01），蛋白表達(dá)量降低至0.32±0.07倍（P<0.01）。這表明FXR能夠正向調(diào)控SHP的表達(dá)。為進(jìn)一步研究SHP在FXR調(diào)控HVEM表達(dá)中的作用，使用RNA干擾技術(shù)敲低SHP的表達(dá)。將針對(duì)SHP的siRNA轉(zhuǎn)染至A549和H1299細(xì)胞中，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)，驗(yàn)證SHP敲低效果。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SHPsiRNA后，SHP的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（圖10C、10D）。在A549細(xì)胞中，SHPmRNA表達(dá)量降低至0.25±0.05倍（P<0.01），蛋白表達(dá)量降低至0.28±0.06倍（P<0.01）。隨后，在敲低SHP的細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)FXR，檢測(cè)HVEM的表達(dá)變化。結(jié)果表明，敲低SHP后，過(guò)表達(dá)FXR對(duì)HVEM表達(dá)的抑制作用明顯減弱（圖10E、10F）。在A549細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)FXR使HVEM蛋白表達(dá)量降低至0.65±0.12倍（P<0.05），而在敲低SHP且過(guò)表達(dá)FXR的細(xì)胞中，HVEM蛋白表達(dá)量?jī)H降低至0.98±0.15倍（P>0.05）。這說(shuō)明SHP在FXR調(diào)控HVEM表達(dá)過(guò)程中起到重要的中介作用，F(xiàn)XR可能通過(guò)上調(diào)SHP的表達(dá)來(lái)抑制HVEM的表達(dá)。除SHP外，還研究了其他轉(zhuǎn)錄因子如肝細(xì)胞核因子4α（HNF4α）在FXR調(diào)控HVEM表達(dá)中的作用。HNF4α是一種在肝臟和腸道中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在A549和H1299細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)FXR后，HNF4α的蛋白表達(dá)水平顯著降低（圖11A、11B）。在A549細(xì)胞中，F(xiàn)XR過(guò)表達(dá)使HNF4α蛋白表達(dá)量降低至0.38±0.08倍（P<0.01）。而敲低FXR后，HNF4α的蛋白表達(dá)水平顯著升高（圖11A、11B）。在A549細(xì)胞中，F(xiàn)XR敲低使HNF4α蛋白表達(dá)量升高至2.65±0.52倍（P<0.01）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)HNF4α可部分逆轉(zhuǎn)FXR對(duì)HVEM表達(dá)的抑制作用（圖11C、11D）。在A549細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)FXR使HVEM蛋白表達(dá)量降低至0.35±0.07倍（P<0.01），而過(guò)表達(dá)FXR同時(shí)過(guò)表達(dá)HNF4α?xí)r，HVEM蛋白表達(dá)量升高至0.68±0.10倍（P<0.05）。這表明HNF4α在FXR調(diào)控HVEM表達(dá)過(guò)程中可能起到負(fù)向調(diào)節(jié)作用，F(xiàn)XR可能通過(guò)抑制HNF4α的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)HVEM表達(dá)的抑制。綜上所述，轉(zhuǎn)錄因子SHP和HNF4α等分子在FXR調(diào)控HVEM表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。SHP作為FXR的下游靶基因，介導(dǎo)了FXR對(duì)HVEM表達(dá)的抑制作用；而HNF4α可能通過(guò)與FXR相互作用，負(fù)向調(diào)節(jié)FXR對(duì)HVEM表達(dá)的調(diào)控。這些結(jié)果為深入理解FXR調(diào)控HVEM表達(dá)的分子機(jī)制提供了新的線索。注：A、B：分別為實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)FXR過(guò)表達(dá)和敲低對(duì)A549和H1299細(xì)胞中SHP表達(dá)的影響；C、D：分別為實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)SHPsiRNA轉(zhuǎn)染對(duì)A549和H1299細(xì)胞中SHP表達(dá)的影響；E、F：分別為Westernblot檢測(cè)敲低SHP后過(guò)表達(dá)FXR對(duì)A549和H1299細(xì)胞中HVEM表達(dá)的影響。注：A、B：分別為Westernblot檢測(cè)FXR過(guò)表達(dá)和敲低對(duì)A549和H1299細(xì)胞中HNF4α表達(dá)的影響；C、D：分別為Westernblot檢測(cè)過(guò)表達(dá)HNF4α對(duì)FXR調(diào)控A549和H1299細(xì)胞中HVEM表達(dá)的影響。五、FXR調(diào)控HVEM表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌生物學(xué)行為的影響5.1對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響為深入探究FXR調(diào)控HVEM表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響，運(yùn)用CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。在A549和H1299細(xì)胞系中，分別轉(zhuǎn)染FXR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、FXRsiRNA、HVEM過(guò)表達(dá)質(zhì)粒以及相應(yīng)的對(duì)照質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種5000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，使CCK-8試劑與細(xì)胞中的線粒體脫氫酶反應(yīng)生成Formazan結(jié)晶。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度值（OD值），根據(jù)OD值繪制細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果顯示，在A549和H1299細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)FXR可顯著抑制細(xì)胞增殖（圖12A）。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)FXR的A549細(xì)胞在72小時(shí)時(shí)的OD值為0.56±0.08，顯著低于對(duì)照組的0.85±0.10（P<0.01）；過(guò)表達(dá)FXR的H1299細(xì)胞在72小時(shí)時(shí)的OD值為0.52±0.07，顯著低于對(duì)照組的0.88±0.12（P<0.01）。相反，敲低FXR可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖（圖12A）。敲低FXR的A549細(xì)胞在72小時(shí)時(shí)的OD值為1.25±0.15，顯著高于對(duì)照組（P<0.01）；敲低FXR的H1299細(xì)胞在72小時(shí)時(shí)的OD值為1.32±0.18，顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。為進(jìn)一步驗(yàn)證FXR對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用