DB13DB13/T1778—2013魚類鏈球菌病診斷技術(shù)規(guī)范Thenormofdiagnosistechniqueforstreptococcicosisinfish2013-09-05發(fā)布2013-09-30實(shí)施河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I12規(guī)范性引用文件GB/T4789.28食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)4設(shè)備和材料b)顯微鏡：10×~100×。25培養(yǎng)基和試劑h)酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）。E1:5′－GGACCAATGCCACAAACTCG－3′E2:5′－TGGAGTATGACGTCCACCTTC－3′n)DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（Marker）。o)無水乙醇：使用前預(yù)冷至-20℃。用75%酒精棉球擦拭魚體，在無菌條件下取樣品魚的腦、腎、肝、脾等器官的小塊組織,在潔凈載3苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合液抽提3次，然μL，E1、E2引物（10μmol／L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板DNA溶液2μL，用無菌生理鹽水稀釋至106～108CUF/mL（約麥?zhǔn)媳葷岫?.4），按6.5.2的方法提取細(xì)菌DNA做為PC應(yīng)的陽性模板。以DNA提取液代替陰性對照模板。以水替代空45A.2營養(yǎng)肉湯按上述成分混合，溶解后校正pH至7.4，分裝，每瓶225mL，125×TBE電泳緩沖液水6A.5EB(ethidiumbromide，核酸染色劑)A.6上樣緩沖液每100mL水溶液中含溴酚藍(lán)0.25g7B.1無乳鏈球菌延伸因子（EF-Tu1ggaccaatgccacaaactcgtgag61cttatcgtattcatgaacaaagttgaccttgttgatgatg121gaaatggaaattcg181atccaaggttcagctcttaaagcactt241gaattgatgagcactgttgatgagtacattccagaaccag301ttacttcttccagttgaagatgtattctcaatcac361cgtatcgaccgtggtactgttcgtgtcaacgacgaagt421gatatccaaaaagcagttgttactggtgttgaaatgttccgt481cttgcaggggacaacgttggtgttcttcttcgtggtgttcaacgtg541ggtcaagttcttgctaaaccaggttcaatcaacccacaca601tacatcctttctaaagaagaaggtggacgtcatact661caattctacttccgtacaactgacgtaacaggttcaatcgaactB.2海豚鏈球菌延伸因子（EF-Tu61cttatcgttttcatgaacaaaattgaccttgttgatgatg121gaaatggaaatccg181atccaaggttcagctcttaaagctctt241gaattgatggctactgttgattcatacattccagaaccag301ttgcttcttccagttgaggatgtattctcaatcac361cgtatcgaccgtggtactgttcgtgtcaacgacgaaat8421gaaactcaaaaagctatcgttactggtgttgaaatgttccgt481cttgcaggagacaacgtaggtatccttcttcgtggtgttcaacgtg541ggacaagttattgctaaaccaggttcaatcaacccacatac601t