DB13DB13/T1767—2013蘋果品種DNA指紋鑒定2013-09-05發(fā)布2013-09-30實施河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1本標(biāo)準(zhǔn)適用于蘋果品種鑒定及河北省蘋果品種DNA不同蘋果品種由于遺傳組成不同，基因組DNA中簡單重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)有差異，這種差異可經(jīng)過擴增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離（或通過DNA分析儀、測序儀進(jìn)行分離），并通過染色顯示DNA4溶液配制蘋果品種DNA指紋鑒定相關(guān)溶液配制方法5鑒定方法5.1樣品準(zhǔn)備5.1.1取樣量5.1.2品種比較方式送檢樣品提供兩份，一份為待檢品種，一份為對照品種。將待檢品種與對照品種直接進(jìn)行成對比2并加1mL洗滌液及30μLβ-巰基乙醇，充分搖勻后置冰上5min，于4℃,12000g離心8min后，洗滌5.2.2其它保證DNA質(zhì)量的方法也可采用5.3.2反應(yīng)體系225mmol/L2.5mmol/L22.5mmol/L0.15mmol/L20μmol/L0.25DNA15.3.3反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s,共30個循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保5.4.1清洗玻璃板用自來水沾洗滌靈將玻璃板反復(fù)擦洗干凈，雙蒸水擦洗兩遍，95%乙醇擦洗兩遍，干燥。在長板上涂上0.5mL親和硅烷工作液，帶凹槽的短板上涂0.5mL剝離硅烷工作5.4.2組裝電泳板35.4.3灌膠5.4.4預(yù)電泳在正極槽中加入1×TBE緩沖液600mL，在負(fù)極槽(上槽)加入預(yù)熱至65℃的I×TBE緩沖液600mL，拔5.4.5變性5.5.1銀染流程圖6結(jié)果及判定4譜帶記錄方式:每個核心引物的所有譜帶按擴增片段02..….)，并確定代表每條譜帶的一套標(biāo)準(zhǔn)品種。c)品種間差異位點數(shù)＝0，判定為相同c)品種間差異位點數(shù)＝0，判定為相同5A.1儀器設(shè)備A.1.1PCR核酸擴增儀:規(guī)格為96孔;A.1.2序列分析電泳槽;A.1.3高壓電泳儀:規(guī)格為3000VA.1.4水平搖床;A.1.5膠片觀察燈;A.1.7微量加樣器;A.1.8磁力攪拌器;A.1.9高速離心機A.1.10微量紫外分光光度計A.1.11高壓滅菌鍋;A.2試劑A.2.2Tris堿;A.2.3鹽酸;A.2.4氫氧化鈉;A.2.7TaqDNA聚合酶;A.2.8SSR引物;A.2.9礦物油;6A.2.10A.2.11A.2.12A.2.13A.2.14A.2.15A.2.16A.2.17A.2.18A.2.19A.2.20A.2.21A.2.22A.2.23A.2.247lmol/LTris-HC15rnL，0.5m82%二甲基二氯硅烷。91I2I3I4I5I6I7I8ICH01f03b9IIIIIIIIIHi02c0712MS14h0334CH05f06567CH01f0989CH02B03bCH04f10注：I型標(biāo)記含首先采用的17對引物，II型標(biāo)記含候補采用的1