課題1微生物試驗室培養(yǎng)第一課時專題2:微生物培養(yǎng)與應用第1頁到當前為止，幾十項Nobel生理學和醫(yī)學獎，化學獎都與微生物學相關第2頁微生物包含哪五類：病毒細菌放線菌真菌原生動物原核生物界原生生物界真菌界病毒界微生物基礎知識第3頁微生物類群原生生物：原核生物:真菌:病毒:如酵母菌單細胞動植物如草履蟲、單細胞藻類等微生物包含了除植物界和動物界以外全部生物無細胞結構真核細胞細菌、藍藻、放線菌原核細胞特點：結構都相當簡單,個體多數(shù)十分微小.通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有甚至沒有細胞結構.且體內普通不含有葉綠素.不能進行光合作用.第4頁細菌外形與大小細菌：單細胞不分枝原核微生物。細菌細胞微小而透明，通慣用適當染料染色后顯微鏡觀察圖1-1常見三種細菌經典形態(tài)A.球菌

B.桿菌C.弧菌第5頁細菌細胞由外向里依次有鞭毛、菌（纖）毛、莢膜、細胞壁、細胞膜、細胞質，細胞質中又有液泡、儲存性顆粒、核質等。細菌結構圖1-3細菌結構第6頁*細胞壁結構特點：堅韌且有彈性細胞壁有哪些功效？①固定細胞外形；

②保護細胞免受外力損傷；

③阻攔大分子物質進人細胞；④使細胞含有致病性及對噬菌體敏感性。傷寒桿菌細胞壁中含毒素第7頁芽孢有些細菌在一定條件下，細胞里面形成一個橢圓形休眠體，叫做芽孢。芽孢壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣環(huán)境有很強抵抗力。比如，有細菌芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，能夠隨風飄散。當環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）時候，芽孢又能夠萌發(fā)，形成一個細菌.第8頁菌落：單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見，含有一定形態(tài)結構子細胞群體，叫做菌落。菌落是判定菌種主要依據。第9頁菌落細菌菌落特征因種而異第10頁放線菌1、結構：單細胞原核分支狀菌絲（基內菌絲、氣生菌絲）第11頁鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素

微生物中發(fā)覺了幾千種抗生素，其中2/3是由放線菌產生

應用:第12頁病毒結構第13頁病毒

第14頁SARS病毒、禽流感病毒第15頁朊病毒（蛋白質病毒）第16頁2、病毒增殖：第17頁真菌第18頁如圖是酵母菌電子顯微鏡下形態(tài)結構酵母菌和霉菌青霉第19頁生殖直立菌絲營養(yǎng)菌絲腐生生活孢子生殖第20頁細菌營養(yǎng)類型依據細菌所利用能源和碳源不一樣，將細菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)菌（autotroph）異養(yǎng)菌（heterotroph）腐生菌寄生菌大部分病原菌第21頁微生物包含哪五類：病毒細菌放線菌真菌原生動物特點：結構都相當簡單,個體多數(shù)十分微小。通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有甚至沒有細胞結構，且體內普通不含有葉綠素，不能進行光合作用。原核生物界原生生物界真菌界病毒界第22頁第23頁1、了解培養(yǎng)基基礎知識，掌握培養(yǎng)基配制、分裝方法。2、掌握慣用消毒和滅菌方法，進行無菌技術操作

一、教學目標無菌技術操作。二、課題重點和難點：第24頁一、基礎知識：（一）培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成，專供微生物生長繁殖使用混合營養(yǎng)液。不論哪種培養(yǎng)基，普通都含有水、碳源、和氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質，另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質,比如:生長因子(即細菌生長必需，而本身不能合成化合物,如維生素、一些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等要求。第25頁（一）.培養(yǎng)基：微生物生存環(huán)境和營養(yǎng)物質1.基本成份：思索：微生物“吃”什么？水、無機鹽、碳源、氮源⑴碳源無機碳源：有機碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含CHON有機物為異養(yǎng)型微生物提供碳源、氮源、能源第26頁（一）.培養(yǎng)基：1.基本成份：水、無機鹽、碳源、氮源2.特殊營養(yǎng)：維生素、堿基等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）3.pH、氧氣需求：4.種類：固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基有無凝固劑瓊脂分離判定工業(yè)生產化學成份：物理性質：天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基第27頁培養(yǎng)基類型配制特點主要應用物理性質固體培養(yǎng)基加入瓊脂較多微生物分離、計數(shù)等半固體培養(yǎng)基加入瓊脂較少觀察微生物運動、判定菌種、保藏菌種等液體培養(yǎng)基不加入瓊脂工業(yè)生產，連續(xù)培養(yǎng)化學組成合成培養(yǎng)基由已知成份配制而成，培養(yǎng)基成份明確菌種分類、判定天然培養(yǎng)基由天然成份配制而成，培養(yǎng)基成份不明確工業(yè)生產目標用途判別培養(yǎng)基添加某種指示劑或化學藥品判別不一樣種類微生物選擇培養(yǎng)基添加（或缺乏）某種化學物質培養(yǎng)、分離出特定微生物第28頁選擇培養(yǎng)基加入青霉素培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源無氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌不加含碳有機物無碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素培養(yǎng)基:

分離導入了目標基因受體細胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷培養(yǎng)基:

分離雜交瘤細胞第29頁

這些營養(yǎng)成份是組成細胞結構元素和化合物基本元素，碳源：如CO2、糖類、脂肪酸等有機物，組成微生物結構物質和分泌物，并提供能量。氮源：如N2、氨鹽、硝酸鹽、牛肉膏、蛋白胨等，主要用來合成蛋白質、核酸及含氮代謝物等。1、從細胞化學元素組成來看，培養(yǎng)基中為何都含有這些營養(yǎng)成份？課堂探究第30頁牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一個應用最廣泛和最普通細菌基礎培養(yǎng)基。1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g分析營養(yǎng)組成？第31頁（二）無菌技術無菌技術概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物操作中，全部預防雜菌污染方法。

取得純凈培養(yǎng)物關鍵是預防外來雜菌入侵，無菌技術就是預防雜菌污染操作技術。第32頁消毒1、無菌技術種類滅菌使用較為溫和物理和化學方法（酒精、紫外線）來殺死部分對人體有害微生物（不包含芽孢和孢子。使用較為強烈理化原因殺死物體內外全部微生物（包含芽孢和孢子）。以化學劑或物理方法毀滅全部微生物，包含全部細菌繁殖體、芽孢、霉菌及病毒，而到達完全無菌之過程。第33頁

對試驗操作空間、操作者衣著和手進行清潔消毒；將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌；接種過程要在酒精燈火焰附近進行。防止已經滅菌處理材料用具與周圍物品接觸第34頁1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min9(牛奶）3、化學藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源（酒精擦拭雙手4、紫外線消毒：（工作臺、接種室）(能使蛋白質變性，還能損傷DNA結構）……(1)消毒方法3.慣用消毒與滅菌方法第35頁（1）、灼燒滅菌：接種用具和接種過程中試管口或瓶口放在酒精燈火焰充分燃燒層中進行灼燒滅菌。試管口或瓶口等輕易被污染部位3、慣用消毒與滅菌方法（2）、干熱滅菌：將玻璃器皿、金屬用具等能耐高溫并需要保持干燥物品放到干熱滅菌箱內，在160～170OC中加熱1～2h即可。（3）、高壓蒸汽滅菌：將需滅菌物品放到盛有水高壓蒸汽滅菌鍋內煮沸，待冷空氣排盡后，密閉繼續(xù)加熱至鍋內壓力到100kPa，溫度到121OC后，維持15～30min即可。第36頁1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.(2)滅菌方法：第37頁1.無菌技術除了用來預防試驗室培養(yǎng)物被其它外來微生物污染外，還有什么目標？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。假如需要，請選擇適當方法。（1）培養(yǎng)細菌用培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）試驗操作者雙手

無菌技術還能有效防止操作者本身被微生物感染。（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。P15-16旁欄思索第38頁4.無菌技術除了用來預防試驗室培養(yǎng)物被其它外來微生物污染外，還有什么目標？無菌技術還能有效防止操作者本身被微生物感染。課堂探究第39頁拓展延伸定義慣用方法微生物培養(yǎng)和組培應用消毒使用較為溫和物理或化學方法殺死物體表面或內部部分菌體,但不傷及活組織煮沸玻璃儀器紫外線試驗室、操作臺、衣物等酒精溶液手、外植體等次氯酸鈉溶液等外植體滅菌使用強烈理化原因殺死物體內外全部菌體、芽孢和孢子高壓蒸汽培養(yǎng)基、玻璃儀器、棉塞、牛皮紙等灼燒接種環(huán)、涂布器等干熱玻璃儀器第40頁單個或少數(shù)菌體2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。3.功效：1.定義：三.菌落判定菌種主要依據固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基上大量繁殖子細胞群體第41頁微生物試驗室培養(yǎng)基本操作程序1、器具滅菌2、培養(yǎng)基配制3、培養(yǎng)基滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種保留第42頁三、試驗操作

1.制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細菌）第43頁培養(yǎng)基配制標準①目標要明確：依據培養(yǎng)微生物種類、培養(yǎng)目標等確定培養(yǎng)基類型和配制量。②營養(yǎng)要協(xié)調：培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物質濃度和百分比要適宜。③pH要適宜：細菌培養(yǎng)基pH中性或偏堿性，霉菌培養(yǎng)基呈酸性。第44頁（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計算：（依據微生物生長時對營養(yǎng)物質需求）物質牛肉膏蛋白胨NaCl瓊脂水重量5g10g5g20g定溶至1000mL2.稱量

準確稱取各種成份，注意事項：牛肉膏要放在稱量紙上稱量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，稱取時動作要快速，稱后及時蓋上瓶蓋。三、試驗操作思索：該培養(yǎng)基從物理性質分屬于哪種？原因？含有幾個營養(yǎng)成份？牛肉膏提供上述哪幾個成份？第45頁3.溶化：先將牛肉膏連同稱量紙一起放入燒杯，加少許水，加熱至牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃棒取出稱量紙。加入蛋白胨和氯化鈉，用玻璃棒攪拌使之溶解，再加入瓊脂，不停用玻璃棒攪拌，原因：預防瓊脂糊底而造成燒杯破裂。待溶解后，加自來水定溶至100mL。（熔化后滅菌前應該調整PH)

4.滅菌：將配制好培養(yǎng)基放到錐形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮紙），連同培養(yǎng)皿（3～5套，用幾層報紙包好）一起放到高壓蒸汽滅菌鍋內滅菌。

5.倒平板：待培養(yǎng)基冷卻到50OC左右時倒平板。第46頁?思索3①溶化時為何要將牛肉膏連同稱量紙一起加熱?

②加瓊脂目標是什么?可確保粘附在稱量紙上牛肉膏也能溶于水中,降低誤差作為凝固劑第47頁思索4

①在滅菌前,用牛皮紙、舊報紙包緊盛有培養(yǎng)基錐形瓶目標是什么？②培養(yǎng)皿能否用高壓蒸汽滅菌？?在滅菌時能防止水蒸汽凝結時浸濕棉塞；在取出培養(yǎng)基錐形瓶時也能起到隔絕空氣中雜菌污染作用不能,因為培養(yǎng)皿要保持干燥,應該用干熱滅菌第48頁倒平板技術第49頁倒平板操作討論

1.培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到50OC時倒平板。用什么方法來預計培養(yǎng)基溫度？

用手觸摸錐形瓶，溫度下降到剛才不燙手時即可開始倒平板。

2.為何需要使錐形瓶瓶口經過火焰？

經過灼燒滅菌，預防瓶口微生物污染培養(yǎng)基。第50頁

3.平板冷凝后，為何要將平板倒置？

平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后培養(yǎng)基表面濕度也比較高，將平板倒置，既能夠使培養(yǎng)基表面水分更加好地揮發(fā)，又能夠預防皿蓋上水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

4.在倒平板過程中，假如不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為何？

空氣中微生物可能在皿蓋與皿底之間培養(yǎng)基上滋生，所以最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。第51頁1．計算、稱量2．溶化3．調pH：pH7．6

4．過濾：這一步能夠省去。5．分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引發(fā)污染。分裝三角燒瓶量以不超出三角燒瓶容積二分之一為宜。6．加塞7．包扎操作步驟第52頁8．滅菌:

將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養(yǎng)皿用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內，在160～170℃下滅菌2h。9．倒平板:

待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見書本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種.10．無菌檢驗：將滅菌培養(yǎng)基放入37℃溫室中培養(yǎng)24—48小時，以檢驗滅菌是否徹底