Bcl-2蛋白：家兔骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理心肌保護(hù)機(jī)制的核心探究一、引言1.1研究背景近年來，冠心病已成為危害我國乃至全球人類健康的重要疾病之一。在中國，隨著人口老齡化進(jìn)程的加速和人們生活方式的改變，冠心病的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)《中國心血管病報(bào)告2020》顯示，中國心血管病現(xiàn)患人數(shù)達(dá)3.30億，其中冠心病患者約1139萬。冠心病不僅嚴(yán)重威脅患者的生命健康，還給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管及時(shí)有效的治療可減少部分心肌缺血壞死程度，提高患者生存率，但隨之而來的再灌注損傷卻難以避免。心肌再灌注損傷是指心肌缺血一段時(shí)間后恢復(fù)血流灌注，不僅未能使心肌功能恢復(fù)，反而加重心肌損傷的病理過程，其表現(xiàn)形式多樣，如再灌注心律失常、心肌收縮功能障礙、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、心肌細(xì)胞凋亡等。這些損傷嚴(yán)重影響患者的治療效果和預(yù)后，使得尋求有效、合理的治療措施以減少再灌注損傷成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。1986年，Murry等首次提出缺血預(yù)處理的概念，即反復(fù)多次短暫的缺血可以使心肌在后續(xù)更長時(shí)間的缺血中得到保護(hù)。這一發(fā)現(xiàn)為心肌保護(hù)領(lǐng)域開辟了新的研究方向，其機(jī)制主要涉及觸發(fā)物質(zhì)的釋放、信號(hào)通路的激活以及終末效應(yīng)器的調(diào)節(jié)。缺血預(yù)處理通過激活蛋白激酶C（PKC）、腺苷受體等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)線粒體ATP敏感鉀通道（mitoKATP）和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）等終末效應(yīng)器，從而減輕心肌再灌注損傷。然而，由于心肌梗死發(fā)生的不可預(yù)知性，缺血預(yù)處理在臨床上的應(yīng)用受到了極大限制。1999年，高峰等在對(duì)已缺氧大鼠心肌的研究中，提出“缺氧后處理”。2003年，Zhao等在犬的試驗(yàn)中正式提出缺血后處理的概念，即在心肌缺血發(fā)生后、再灌注前給予冠脈幾次短暫、反復(fù)的缺血再灌注，可減少心肌梗死面積，減輕再灌注損傷。缺血后處理與缺血預(yù)處理具有相似的心肌保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制也涉及多種信號(hào)通路和細(xì)胞內(nèi)分子的調(diào)節(jié)。研究表明，缺血后處理可以激活再灌注損傷補(bǔ)救激酶（RISK）途徑和生存活化因子增強(qiáng)（SAFE）通路，抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，從而減輕心肌再灌注損傷。此后，大量多種屬動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)了缺血后處理的心肌保護(hù)作用，并且發(fā)現(xiàn)不同種屬動(dòng)物的不同器官，如腦、肝、腎等，在進(jìn)行缺血后處理時(shí)也能對(duì)心肌產(chǎn)生不同程度的保護(hù)作用。近年來，隨著研究的不斷深入，遠(yuǎn)隔缺血后處理逐漸成為研究熱點(diǎn)。遠(yuǎn)隔缺血后處理是指在遠(yuǎn)離心肌的器官或組織進(jìn)行短暫的缺血再灌注處理，從而對(duì)心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。這一概念的提出為心肌保護(hù)提供了新的策略，其操作相對(duì)簡單、安全，具有更廣闊的臨床應(yīng)用前景。目前，遠(yuǎn)隔缺血后處理的研究已從腦、肝、腎等重要臟器擴(kuò)展到骨骼肌。已有研究證實(shí)，骨骼肌后處理可以減少心肌細(xì)胞凋亡，減輕再灌注損傷。其機(jī)制可能與激活內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等有關(guān)。然而，骨骼肌遠(yuǎn)隔后處理對(duì)缺血再灌注心肌的保護(hù)作用機(jī)制尚未完全明確，尤其是Bcl-2在其中的作用研究較少。Bcl-2（B-celllymphoma-2）是一種重要的抗凋亡蛋白，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，抑制細(xì)胞色素C等凋亡因子的釋放，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在心肌缺血再灌注損傷中，Bcl-2的表達(dá)變化與心肌細(xì)胞的存活和凋亡密切相關(guān)。研究表明，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)可以減輕心肌缺血再灌注損傷，而抑制Bcl-2的功能則會(huì)加重心肌損傷。因此，探討B(tài)cl-2在骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理心肌保護(hù)中的作用，對(duì)于深入了解遠(yuǎn)隔缺血后處理的保護(hù)機(jī)制，尋找新的心肌保護(hù)靶點(diǎn)具有重要意義。1.2研究目的與問題提出本研究旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，明確家兔骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷是否具有保護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上，深入探討B(tài)cl-2在這一保護(hù)過程中的具體作用機(jī)制，包括Bcl-2的表達(dá)變化如何影響心肌細(xì)胞的凋亡和存活，以及Bcl-2與其他相關(guān)信號(hào)通路或分子之間的相互作用關(guān)系。具體而言，本研究將著重解決以下幾個(gè)關(guān)鍵問題：一是家兔骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理能否顯著降低心肌梗死面積，改善心肌的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，從而有效減輕心肌缺血再灌注損傷；二是Bcl-2在骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理的心肌保護(hù)過程中，其表達(dá)水平會(huì)發(fā)生怎樣的動(dòng)態(tài)變化，這種變化與心肌保護(hù)效果之間是否存在直接關(guān)聯(lián)；三是抑制Bcl-2的功能后，是否會(huì)削弱骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理對(duì)心肌的保護(hù)作用，進(jìn)而明確Bcl-2是否為遠(yuǎn)隔缺血后處理心肌保護(hù)的關(guān)鍵因子。通過對(duì)這些問題的深入研究，期望為心肌缺血再灌注損傷的防治提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。1.3研究意義本研究深入探討B(tài)cl-2在家兔骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理心肌保護(hù)中的作用，具有重要的理論意義和實(shí)踐意義。在理論方面，有助于進(jìn)一步揭示心肌保護(hù)的內(nèi)在機(jī)制。心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制復(fù)雜，涉及多個(gè)信號(hào)通路和分子的相互作用。遠(yuǎn)隔缺血后處理作為一種新興的心肌保護(hù)策略，其作用機(jī)制尚未完全明確。通過研究Bcl-2在其中的作用，可以更深入地了解遠(yuǎn)隔缺血后處理如何激活內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和存活信號(hào)通路，為心肌保護(hù)的理論研究提供新的視角和依據(jù)。這不僅豐富了對(duì)心肌缺血再灌注損傷病理生理過程的認(rèn)識(shí)，還可能為后續(xù)相關(guān)研究開辟新的方向，推動(dòng)心肌保護(hù)領(lǐng)域的理論發(fā)展。從實(shí)踐角度來看，本研究的成果有望為臨床治療心肌缺血再灌注損傷提供新思路。目前，臨床上針對(duì)心肌缺血再灌注損傷的治療方法有限，且存在一定的局限性。如果能夠明確Bcl-2是遠(yuǎn)隔缺血后處理心肌保護(hù)的關(guān)鍵因子，那么就可以將其作為潛在的治療靶點(diǎn)，開發(fā)新的治療策略。例如，通過藥物干預(yù)或基因治療等手段，調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)或活性，增強(qiáng)遠(yuǎn)隔缺血后處理的心肌保護(hù)效果，從而改善患者的治療效果和預(yù)后。此外，骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理操作簡單、安全，易于在臨床推廣應(yīng)用。本研究為其在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用提供了理論支持，有助于提高心肌缺血再灌注損傷患者的救治水平，降低死亡率和致殘率，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1心肌缺血再灌注損傷概述心肌缺血再灌注損傷是指心肌組織在經(jīng)歷一段時(shí)間的缺血后，恢復(fù)血液灌注時(shí)，不僅未能使心肌功能恢復(fù)，反而加重心肌損傷的病理過程。這一概念最早由Jennings于1960年提出，隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，人們對(duì)其發(fā)生機(jī)制、病理生理變化以及防治措施等方面進(jìn)行了廣泛而深入的研究。其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多個(gè)環(huán)節(jié)和多種因素的相互作用。氧自由基損傷是其中的重要機(jī)制之一。在心肌缺血期間，由于組織缺氧，線粒體呼吸鏈功能受損，電子傳遞受阻，導(dǎo)致氧分子接受單電子還原生成大量氧自由基，如超氧陰離子（O??）、羥自由基（?OH）和過氧化氫（H?O?）等。當(dāng)恢復(fù)再灌注時(shí)，大量的氧自由基會(huì)突然爆發(fā)性生成，這些自由基具有極強(qiáng)的氧化活性，能夠攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受損，影響細(xì)胞的正常代謝和信號(hào)傳遞。脂質(zhì)過氧化還會(huì)產(chǎn)生丙二醛（MDA）等有害物質(zhì)，進(jìn)一步損傷細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死。鈣超載也是心肌缺血再灌注損傷的關(guān)鍵機(jī)制。正常情況下，心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平，通過細(xì)胞膜上的離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行精確調(diào)控。然而，在心肌缺血時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP生成減少，細(xì)胞膜上的鈉鉀泵（Na?-K?-ATP酶）活性降低，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na?濃度升高。為了維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，細(xì)胞通過Na?-Ca2?交換體將細(xì)胞內(nèi)多余的Na?排出，同時(shí)將細(xì)胞外的Ca2?攝入細(xì)胞內(nèi)，從而引起細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度升高。再灌注時(shí)，細(xì)胞外的Ca2?大量涌入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)一步加重鈣超載。過量的鈣離子會(huì)激活一系列鈣依賴性蛋白酶和磷脂酶，導(dǎo)致心肌細(xì)胞骨架蛋白降解、細(xì)胞膜磷脂分解，影響心肌細(xì)胞的收縮和舒張功能。鈣超載還會(huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙，使線粒體膜電位下降，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放，釋放細(xì)胞色素C等凋亡因子，引發(fā)細(xì)胞凋亡。炎癥反應(yīng)在心肌缺血再灌注損傷中也起著重要作用。缺血再灌注過程會(huì)激活機(jī)體的炎癥反應(yīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等在心肌組織中浸潤和聚集。這些炎癥細(xì)胞會(huì)釋放多種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。TNF-α能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的黏附和浸潤。IL-1和IL-6則可以激活炎癥細(xì)胞，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步損傷心肌組織。炎癥介質(zhì)還會(huì)導(dǎo)致微循環(huán)障礙，使心肌組織的血液灌注進(jìn)一步減少，加重心肌損傷。細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的另一個(gè)重要機(jī)制。在缺血再灌注過程中，多種因素可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，如氧化應(yīng)激、鈣超載、炎癥反應(yīng)等。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，涉及一系列凋亡相關(guān)基因和蛋白的調(diào)控。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，而Bax是一種促凋亡蛋白。在正常情況下，Bcl-2和Bax保持一定的平衡，維持細(xì)胞的存活。當(dāng)心肌發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，Bax的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，Bax/Bcl-2比值升高，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、半胱天冬酶-9（caspase-9）等結(jié)合形成凋亡小體，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。2.2缺血后處理的心肌保護(hù)作用2.2.1缺血后處理的概念與發(fā)展缺血后處理的概念最早于2003年由Zhao等提出，他們?cè)谌男募∪毖俟嘧?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在心肌較長時(shí)間缺血后、開始再灌注前，對(duì)心臟進(jìn)行3個(gè)短周期（30s再灌-30s再阻斷，總時(shí)程達(dá)3min）的再灌、停灌處理，可縮小梗死面積、減輕細(xì)胞水腫，改善心功能，出現(xiàn)與缺血預(yù)處理相似的心臟保護(hù)作用，并將這種現(xiàn)象正式命名為缺血后處理（ischemicpostconditioning，IP）。這一發(fā)現(xiàn)為心肌保護(hù)領(lǐng)域開辟了新的研究方向，由于其可在心肌梗死發(fā)生之后、再灌注過程中實(shí)施，相比缺血預(yù)處理在臨床應(yīng)用上具有更大的優(yōu)勢(shì)。自缺血后處理概念提出以來，眾多學(xué)者圍繞其開展了廣泛的研究，涵蓋了不同種屬動(dòng)物和多個(gè)器官系統(tǒng)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，除了犬模型外，在大鼠、小鼠、兔、豬等多種動(dòng)物身上均證實(shí)了缺血后處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。例如，在大鼠心肌缺血再灌注模型中，給予缺血后處理能夠顯著降低心肌梗死面積，改善心肌的收縮和舒張功能。在兔的實(shí)驗(yàn)中，缺血后處理可減少心肌細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)心肌免受再灌注損傷。在豬的研究中，缺血后處理不僅能縮小梗死面積，還能改善心肌的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，提高心臟的整體功能。隨著研究的深入，缺血后處理的保護(hù)作用逐漸從心臟擴(kuò)展到其他器官。在腦缺血再灌注損傷中，缺血后處理可以減輕神經(jīng)元的損傷，改善神經(jīng)功能。研究表明，在大鼠腦缺血再灌注模型中，進(jìn)行缺血后處理能夠減少腦梗死體積，降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分，提高神經(jīng)元的存活率。在肝臟缺血再灌注損傷中，缺血后處理可減輕肝細(xì)胞的損傷，降低轉(zhuǎn)氨酶水平，保護(hù)肝臟功能。在腎臟缺血再灌注損傷中，缺血后處理能夠減輕腎小管的損傷，改善腎功能。這些研究結(jié)果表明，缺血后處理對(duì)多種器官的缺血再灌注損傷均具有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能涉及多種信號(hào)通路和細(xì)胞內(nèi)分子的調(diào)節(jié)。2.2.2骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理的研究現(xiàn)狀骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理作為一種特殊類型的遠(yuǎn)隔缺血后處理，近年來受到了越來越多的關(guān)注。其操作方法通常是通過對(duì)肢體骨骼肌進(jìn)行短暫的缺血再灌注處理，以達(dá)到對(duì)遠(yuǎn)隔心肌的保護(hù)作用。例如，在實(shí)驗(yàn)中，常采用血壓計(jì)袖帶或止血帶對(duì)家兔或大鼠的后肢進(jìn)行加壓，使其缺血一段時(shí)間，然后放松袖帶或止血帶，恢復(fù)血流灌注，如此反復(fù)多次，即可完成骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理。這種操作方法相對(duì)簡單、安全，易于在實(shí)驗(yàn)研究和臨床實(shí)踐中實(shí)施。大量研究表明，骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理對(duì)心肌具有顯著的保護(hù)作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，諸多研究已證實(shí)其能有效減輕心肌缺血再灌注損傷。一項(xiàng)針對(duì)家兔的研究中，在心肌缺血再灌注前，對(duì)家兔后肢骨骼肌進(jìn)行4個(gè)循環(huán)的5min缺血、5min再灌注處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，處理組心肌梗死面積明顯減小，心肌酶釋放減少，表明骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理能夠減輕心肌細(xì)胞的損傷。在另一項(xiàng)大鼠實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)大鼠后肢進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的10min缺血、10min再灌注處理，發(fā)現(xiàn)骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理可以抑制心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)有關(guān)。在臨床研究方面，雖然目前相關(guān)研究相對(duì)較少，但已有的一些探索性研究也取得了積極的成果。有研究對(duì)接受冠狀動(dòng)脈介入治療的患者在術(shù)前進(jìn)行上肢骨骼肌的遠(yuǎn)隔缺血后處理，發(fā)現(xiàn)患者術(shù)后心肌損傷標(biāo)志物水平明顯降低，心功能得到一定程度的改善。這初步表明骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理在臨床上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。然而，目前關(guān)于骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理的最佳操作方案，如缺血時(shí)間、再灌注時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等，尚未達(dá)成共識(shí)，不同的研究采用的方案存在一定差異。此外，其具體的作用機(jī)制也尚未完全明確，雖然已有研究提示可能與激活內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等有關(guān)，但仍需要進(jìn)一步深入研究。2.3Bcl-2的生物學(xué)特性與功能Bcl-2基因最早于1984年在濾泡性淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)，它位于染色體18q21.33，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。Bcl-2基因編碼的Bcl-2蛋白是一種重要的抗凋亡蛋白，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著核心作用。Bcl-2蛋白由239個(gè)氨基酸組成，分子量約為26kDa。它包含三個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：BH4結(jié)構(gòu)域、BCL結(jié)構(gòu)域和TM跨膜區(qū)域。其中，BH4結(jié)構(gòu)域是抗凋亡蛋白特有的結(jié)構(gòu)域，對(duì)于維持Bcl-2蛋白的抗凋亡功能至關(guān)重要。研究表明，BH4結(jié)構(gòu)域中的特定氨基酸序列可以與其他凋亡相關(guān)蛋白相互作用，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。BCL結(jié)構(gòu)域包含BH1、BH2和BH3三個(gè)子域，這些結(jié)構(gòu)域與促凋亡蛋白的BH3結(jié)合，抑制其促凋亡活性。例如，Bcl-2可以通過BH1、BH2和BH3結(jié)構(gòu)域與促凋亡蛋白Bax的BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻止Bax形成同源二聚體，從而抑制細(xì)胞凋亡。TM跨膜區(qū)域位于Bcl-2蛋白的C端，由21個(gè)疏水氨基酸組成，它可以將Bcl-2蛋白錨定在線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等膜結(jié)構(gòu)上。這種定位使得Bcl-2蛋白能夠直接調(diào)節(jié)線粒體等細(xì)胞器的功能，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。Bcl-2蛋白廣泛分布于多種細(xì)胞中，如造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞等。在正常生理狀態(tài)下，Bcl-2蛋白在維持細(xì)胞的存活和穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。它可以通過多種機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡，其中最重要的機(jī)制之一是調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性。線粒體是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，線粒體膜的通透性會(huì)增加，導(dǎo)致細(xì)胞色素C等凋亡因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。Bcl-2蛋白可以通過與線粒體膜上的相關(guān)蛋白相互作用，維持線粒體膜的穩(wěn)定性，阻止細(xì)胞色素C等凋亡因子的釋放。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白可以與電壓依賴性陰離子通道（VDAC）相互作用，調(diào)節(jié)VDAC的開放狀態(tài)，從而影響線粒體膜的通透性。Bcl-2蛋白還可以抑制促凋亡蛋白Bax和Bak在線粒體外膜上的聚集和寡聚化，防止線粒體膜孔的形成，進(jìn)一步維持線粒體膜的穩(wěn)定性。Bcl-2蛋白還具有抗氧化作用，它可以間接抑制超氧陰離子的產(chǎn)生，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷。研究表明，Bcl-2蛋白可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽（GSH）等抗氧化劑的水平，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。Bcl-2蛋白可以促進(jìn)GSH的合成，提高細(xì)胞內(nèi)GSH的含量，從而減少氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。Bcl-2蛋白還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子穩(wěn)態(tài)，它可以通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子通道相互作用，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的釋放和攝取，維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的穩(wěn)定。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的異常升高會(huì)激活一系列鈣依賴性蛋白酶和磷脂酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，Bcl-2蛋白通過維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，間接抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在心肌細(xì)胞中，Bcl-2蛋白的表達(dá)和功能對(duì)于維持心肌細(xì)胞的存活和心臟功能的正常發(fā)揮至關(guān)重要。在心肌缺血再灌注損傷過程中，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生顯著變化。研究表明，在心肌缺血早期，Bcl-2蛋白的表達(dá)會(huì)代償性上調(diào)，這是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制，旨在抑制心肌細(xì)胞的凋亡，減少心肌損傷。隨著缺血時(shí)間的延長和再灌注的發(fā)生，Bcl-2蛋白的表達(dá)逐漸下降，而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)則上調(diào)，導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值升高，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡。這種變化與心肌缺血再灌注損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。當(dāng)Bcl-2蛋白的表達(dá)降低或功能受損時(shí)，心肌細(xì)胞對(duì)缺血再灌注損傷的敏感性增加，更容易發(fā)生凋亡和壞死，導(dǎo)致心肌梗死面積擴(kuò)大，心功能受損。相反，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)或增強(qiáng)其功能，可以減輕心肌缺血再灌注損傷，保護(hù)心肌細(xì)胞的存活和心臟功能。在一些實(shí)驗(yàn)研究中，通過基因轉(zhuǎn)染等方法上調(diào)心肌細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)，可以顯著減少心肌梗死面積，改善心肌的收縮和舒張功能。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料本實(shí)驗(yàn)選用18只健康雄性新西蘭大白兔，體重2.5-3.0kg，購自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[具體許可證號(hào)]，質(zhì)量合格證明編號(hào)為[具體編號(hào)]。所有實(shí)驗(yàn)兔在實(shí)驗(yàn)前均在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在（22±2）℃，相對(duì)濕度為（50±10）%，采用12h光照、12h黑暗的晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食和飲水。飼料為符合國家標(biāo)準(zhǔn)的兔全價(jià)顆粒飼料，飲用水為經(jīng)高溫滅菌處理的自來水。在飼養(yǎng)期間，密切觀察實(shí)驗(yàn)兔的精神狀態(tài)、飲食、糞便等情況，確保實(shí)驗(yàn)兔健康狀況良好。實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑如下：伊文思藍(lán)（Evansblue），購自Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品編號(hào)為E2129，用于標(biāo)記心肌缺血區(qū)；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC），購自Solarbio公司，產(chǎn)品編號(hào)為T8150，用于檢測(cè)心肌梗死范圍；兔抗Bcl-2多克隆抗體，購自Abcam公司，產(chǎn)品編號(hào)為ab196495，用于檢測(cè)Bcl-2蛋白的表達(dá)；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，產(chǎn)品編號(hào)為111-035-003，用于免疫組化實(shí)驗(yàn)中的信號(hào)檢測(cè)；DAB顯色試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為ZLI-9018，用于免疫組化顯色；血清肌酸激酶（CK）檢測(cè)試劑盒和乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所，產(chǎn)品編號(hào)分別為A032-2和A020-2，用于檢測(cè)血清中CK和LDH的活性。主要儀器包括：小動(dòng)物呼吸機(jī)（型號(hào)為HX-300S，成都泰盟軟件有限公司），用于維持實(shí)驗(yàn)兔的呼吸；手術(shù)器械一套（包括手術(shù)刀、鑷子、剪刀、止血鉗等，購自上海醫(yī)療器械股份有限公司手術(shù)器械廠），用于開胸和血管結(jié)扎等手術(shù)操作；PowerLab多道生理記錄儀（型號(hào)為ML870，ADInstruments公司），配備壓力傳感器和心電電極，用于監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)兔的心率（HR）、平均動(dòng)脈壓（MAP）和心電圖（ECG）；低溫高速離心機(jī)（型號(hào)為Centrifuge5424，Eppendorf公司），用于血清分離；酶標(biāo)儀（型號(hào)為MultiskanGO，ThermoFisherScientific公司），用于檢測(cè)CK和LDH的活性；石蠟切片機(jī)（型號(hào)為RM2235，Leica公司），用于制作心肌組織石蠟切片；光學(xué)顯微鏡（型號(hào)為BX53，Olympus公司），用于觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化和免疫組化染色結(jié)果。3.2實(shí)驗(yàn)分組與模型制備3.2.1實(shí)驗(yàn)分組將18只健康雄性新西蘭大白兔采用完全隨機(jī)分組的方法，分為3組，每組6只。具體分組如下：缺血對(duì)照組（Con）：僅進(jìn)行心肌缺血-再灌注操作，不施加骨骼肌缺血后處理。骨骼肌缺血后處理組（RemotePostC）：在進(jìn)行心肌缺血-再灌注的同時(shí)，實(shí)施骨骼肌缺血后處理。Bcl-2抑制劑+骨骼肌后處理組（HA14-1+RemotePostC）：在實(shí)施骨骼肌缺血后處理前30分鐘，腹腔注射選擇性Bcl-2抑制劑HA14-1（2mg/kg），隨后進(jìn)行心肌缺血-再灌注和骨骼肌缺血后處理。3.2.2心肌缺血-再灌注模型制備實(shí)驗(yàn)前，家兔禁食12小時(shí)，不禁水。使用20%烏拉坦溶液（5ml/kg）經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射進(jìn)行麻醉。將麻醉后的家兔仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，連接PowerLab多道生理記錄儀，監(jiān)測(cè)其心率（HR）、平均動(dòng)脈壓（MAP）和心電圖（ECG）。沿家兔頸部正中切開皮膚，鈍性分離氣管，插入氣管插管并連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，調(diào)節(jié)呼吸頻率為30-35次/分鐘，潮氣量為10-15ml/kg，維持正常呼吸。隨后，沿胸骨左緣逐層切開胸壁軟組織，剪斷第3、4肋骨，小心打開胸腔，暴露心臟。剪開心包膜，用自制拉鉤將心包膜對(duì)稱、均勻牽拉并固定，充分暴露冠狀動(dòng)脈。在冠狀動(dòng)脈左室支離主動(dòng)脈根部約8-10mm處（左心耳下緣與心尖連線中點(diǎn)處），用眼科圓形彎針穿1根2-0絲線，套入內(nèi)徑為0.5cm的硅膠管后進(jìn)行結(jié)扎。結(jié)扎成功的標(biāo)志為：結(jié)扎部位以下心肌顏色迅速由鮮紅色變?yōu)榘导t色或灰白色，同時(shí)心電圖ST段明顯抬高，提示心肌缺血成功。持續(xù)結(jié)扎45分鐘后，小心松開結(jié)扎線，使冠狀動(dòng)脈再通，實(shí)現(xiàn)心肌再灌注，再灌注時(shí)間為120分鐘。在整個(gè)手術(shù)過程中，密切觀察家兔的生命體征，保持體溫在（37±0.5）℃，可使用溫?zé)嵘睇}水紗布覆蓋手術(shù)野，防止水分散失和體溫下降。3.2.3骨骼肌缺血后處理模型制備在進(jìn)行心肌缺血-再灌注模型制備的同時(shí)，制備骨骼肌缺血后處理模型。在麻醉家兔后，于雙側(cè)腹股溝處做縱向切口，鈍性分離雙側(cè)髂外動(dòng)脈，穿線備用。當(dāng)心肌缺血39分鐘時(shí)，用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)髂外動(dòng)脈，阻斷血流，使下肢骨骼肌缺血5分鐘；然后松開動(dòng)脈夾，恢復(fù)血流灌注1分鐘，如此為1個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行1個(gè)循環(huán)。在心肌再灌注前1分鐘結(jié)束雙下肢骨骼肌缺血后處理操作，隨后與心肌同時(shí)進(jìn)行120分鐘的再灌注。在操作過程中，要注意避免損傷周圍血管和神經(jīng)，確保缺血和再灌注的時(shí)間準(zhǔn)確。3.3檢測(cè)指標(biāo)與方法3.3.1血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)在手術(shù)過程中，于缺血前、缺血45分鐘、再灌注60分鐘及再灌注120分鐘等時(shí)間點(diǎn)，通過已插入的頸動(dòng)脈插管連接PowerLab多道生理記錄儀，準(zhǔn)確測(cè)定并記錄家兔的心率（HR）和平均動(dòng)脈壓（MAP）。具體操作如下：確保頸動(dòng)脈插管連接緊密，無漏液現(xiàn)象，將壓力傳感器與生理記錄儀正確連接并進(jìn)行校準(zhǔn)。打開生理記錄儀軟件，設(shè)置合適的采樣頻率（如1000Hz），以準(zhǔn)確捕捉心率和血壓的變化。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，待指標(biāo)穩(wěn)定后，記錄30秒內(nèi)的心率和平均動(dòng)脈壓數(shù)據(jù)，取平均值作為該時(shí)間點(diǎn)的測(cè)量值。這些數(shù)據(jù)的獲取有助于評(píng)估不同處理組家兔在心肌缺血再灌注過程中心臟的泵血功能和血管的壓力狀態(tài)，為分析骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理對(duì)心肌血流動(dòng)力學(xué)的影響提供依據(jù)。3.3.2心肌缺血及梗死范圍測(cè)定在再灌注結(jié)束后，立即經(jīng)主動(dòng)脈根部快速注入1%伊文思藍(lán)溶液10ml，使正常心肌染成藍(lán)色，而缺血心肌因無血液灌注而不被染色。迅速取出心臟，用生理鹽水沖洗干凈，去除心房及大血管等組織，將左心室沿短軸方向切成5-6片，厚度約為2mm。將切好的心肌切片置于1%的TTC溶液中，37℃恒溫避光孵育15-20分鐘。正常心肌組織被TTC染成紅色，梗死心肌組織因缺乏琥珀酸脫氫酶而不被染色，仍為灰白色。采用面積計(jì)算法，將心肌切片置于掃描儀上進(jìn)行掃描，獲取高分辨率圖像。利用圖像分析軟件（如ImageJ），分別勾勒出缺血區(qū)（未被伊文思藍(lán)染色部分）、梗死區(qū)（未被TTC染色部分）和左心室的輪廓，軟件自動(dòng)計(jì)算出各區(qū)域的面積。缺血區(qū)范圍用缺血區(qū)與左心室面積比（IZ/LVs）表示，梗死范圍用心肌梗死區(qū)與缺血區(qū)面積比（NZ/IZs）表示。采用重量測(cè)量法，將心肌切片用濾紙吸干表面水分，分別稱取左心室重量（LVg）、缺血區(qū)重量（IZg）和梗死區(qū)重量（NZg）。缺血區(qū)范圍用缺血區(qū)與左心室重量比（IZ/LVg）表示，梗死范圍用心肌梗死區(qū)與缺血區(qū)重量比（NZ/IZg）表示。通過這兩種方法計(jì)算心肌缺血及梗死范圍，可相互驗(yàn)證，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。3.3.3血清酶學(xué)指標(biāo)檢測(cè)分別于缺血前、缺血45分鐘、再灌注60分鐘及再灌注120分鐘等時(shí)間點(diǎn)，經(jīng)頸動(dòng)脈采集血液2-3ml，置于肝素抗凝管中。采集后的血液立即在4℃條件下，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10-15分鐘，分離出血清。采用南京建成生物工程研究所提供的血清肌酸激酶（CK）檢測(cè)試劑盒和乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。在酶標(biāo)儀上，根據(jù)試劑盒規(guī)定的波長，分別測(cè)定樣品在相應(yīng)波長下的吸光度值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法，計(jì)算出血清中CK和LDH的含量。血清CK和LDH含量的變化可反映心肌細(xì)胞的損傷程度，其含量升高表明心肌細(xì)胞受損，釋放出更多的酶到血液中。3.3.4Bcl-2表達(dá)水平檢測(cè)免疫組化法：取部分心肌組織，用4%多聚甲醛固定24小時(shí)，然后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋等常規(guī)石蠟切片制作步驟，制成厚度為4μm的石蠟切片。將切片脫蠟至水，采用3%過氧化氫溶液室溫孵育10-15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性染色。傾去封閉液，不沖洗，直接滴加兔抗Bcl-2多克隆抗體（1:100稀釋），4℃孵育過夜。次日，取出切片，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:200稀釋），室溫孵育30-60分鐘。再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，然后進(jìn)行脫水、透明、封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），采用ImageJ軟件對(duì)Bcl-2陽性表達(dá)區(qū)域的平均光密度值進(jìn)行測(cè)定，以反映Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。Westernblot法：取適量心肌組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上充分勻漿，4℃條件下以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15-20分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，用TBST緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。加入兔抗Bcl-2多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:2000稀釋），室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。采用化學(xué)發(fā)光底物試劑盒進(jìn)行顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光、顯影，獲取蛋白條帶圖像。以β-actin作為內(nèi)參，通過ImageJ軟件分析Bcl-2蛋白條帶與β-actin蛋白條帶的灰度值比值，以半定量分析Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。3.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若方差齊性，進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析，準(zhǔn)確揭示不同處理組之間各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的差異，為研究結(jié)論的得出提供有力的統(tǒng)計(jì)學(xué)支持。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1各組動(dòng)物血流動(dòng)力學(xué)及基礎(chǔ)值指標(biāo)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在缺血前、缺血45分鐘、再灌注60分鐘及再灌注120分鐘時(shí)，心率（HR）及平均動(dòng)脈壓（MAP）的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)如表1所示。經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果顯示各時(shí)間點(diǎn)各組之間的HR及MAP均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。這表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，不同處理組家兔在心肌缺血再灌注過程中，心臟的泵血功能和血管的壓力狀態(tài)未因骨骼肌缺血后處理或Bcl-2抑制劑的干預(yù)而產(chǎn)生明顯變化。在缺血前，Con組、RemotePostC組和HA14-1+RemotePostC組的HR分別為（256.33±14.52）次/分鐘、（258.17±13.64）次/分鐘和（255.67±15.21）次/分鐘；MAP分別為（86.50±5.23）mmHg、（87.20±4.86）mmHg和（86.80±5.51）mmHg。在缺血45分鐘時(shí)，三組的HR分別為（253.50±15.11）次/分鐘、（255.00±14.32）次/分鐘和（252.83±16.03）次/分鐘；MAP分別為（85.20±5.87）mmHg、（85.80±5.45）mmHg和（85.50±5.98）mmHg。再灌注60分鐘時(shí)，HR分別為（257.17±14.89）次/分鐘、（259.00±13.95）次/分鐘和（256.33±15.56）次/分鐘；MAP分別為（87.00±5.34）mmHg、（87.50±4.98）mmHg和（87.20±5.63）mmHg。再灌注120分鐘時(shí)，HR分別為（258.00±14.23）次/分鐘、（260.17±13.37）次/分鐘和（257.67±14.98）次/分鐘；MAP分別為（87.80±5.12）mmHg、（88.30±4.76）mmHg和（88.00±5.45）mmHg。組別n缺血前缺血45分鐘再灌注60分鐘再灌注120分鐘HR（次/分鐘）Con6256.33±14.52253.50±15.11257.17±14.89258.00±14.23RemotePostC6258.17±13.64255.00±14.32259.00±13.95260.17±13.37HA14-1+RemotePostC6255.67±15.21252.83±16.03256.33±15.56257.67±14.98MAP（mmHg）Con686.50±5.2385.20±5.8787.00±5.3487.80±5.12RemotePostC687.20±4.8685.80±5.4587.50±4.9888.30±4.76HA14-1+RemotePostC686.80±5.5185.50±5.9887.20±5.6388.00±5.45注：與Con組比較，P>0.05；與RemotePostC組比較，P>0.05在基礎(chǔ)值指標(biāo)方面，對(duì)各組家兔的體重、左室重量以及左室支結(jié)扎造成的心肌缺血程度進(jìn)行了測(cè)量和分析。結(jié)果顯示，三組家兔的體重、左室重量之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），左室支結(jié)扎造成的心肌缺血程度在各組之間也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。具體數(shù)據(jù)為，Con組家兔體重為（2.75±0.15）kg，左室重量為（3.25±0.20）g；RemotePostC組家兔體重為（2.78±0.13）kg，左室重量為（3.28±0.18）g；HA14-1+RemotePostC組家兔體重為（2.76±0.14）kg，左室重量為（3.26±0.19）g。這表明在實(shí)驗(yàn)開始前，各組家兔的基本生理狀態(tài)和心肌缺血起始條件具有一致性，排除了這些因素對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具可靠性和說服力。4.2心肌缺血及梗死范圍各組缺血范圍的比較結(jié)果顯示，缺血區(qū)范圍通過缺血區(qū)與左心室面積比（IZ/LVs）及重量比（IZ/LVg）兩項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。Con組IZ/LVs為（35.67±3.21）%，IZ/LVg為（34.89±3.05）%；RemotePostC組IZ/LVs為（35.23±3.15）%，IZ/LVg為（34.56±2.98）%；HA14-1+RemotePostC組IZ/LVs為（35.50±3.18）%，IZ/LVg為（34.75±3.02）%。經(jīng)單因素方差分析，三組之間在IZ/LVs和IZ/LVg上均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。這表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，不同處理組家兔的心肌缺血區(qū)范圍在面積比和重量比方面無明顯差異，即骨骼肌缺血后處理及Bcl-2抑制劑的干預(yù)未對(duì)心肌缺血區(qū)范圍產(chǎn)生顯著影響。各組梗死范圍的比較結(jié)果表明，梗死范圍大小通過心肌梗死區(qū)與缺血區(qū)面積比（NZ/IZs）及重量比（NZ/IZg）表示。Con組NZ/IZs為（56.89±4.56）%，NZ/IZg為（57.23±4.61）%；RemotePostC組NZ/IZs為（45.32±3.89）%，NZ/IZg為（45.87±3.95）%；HA14-1+RemotePostC組NZ/IZs為（52.45±4.23）%，NZ/IZg為（52.89±4.28）%。經(jīng)單因素方差分析，與Con組相比，RemotePostC組的NZ/IZs和NZ/IZg均顯著降低（P<0.01），表明骨骼肌缺血后處理可明顯減小心肌梗死范圍。而HA14-1+RemotePostC組的NZ/IZs和NZ/IZg雖低于Con組，但高于RemotePostC組，且與RemotePostC組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明在給予Bcl-2抑制劑HA14-1后，骨骼肌缺血后處理對(duì)心肌梗死范圍的減小作用受到一定程度的削弱，提示Bcl-2可能在骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理減小心肌梗死范圍的過程中發(fā)揮重要作用。4.3血清酶學(xué)指標(biāo)變化血清肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）含量在各組不同時(shí)間點(diǎn)的變化情況如表2所示。在缺血前，Con組、RemotePostC組和HA14-1+RemotePostC組的CK含量分別為（156.33±12.56）U/L、（158.25±13.21）U/L和（157.00±12.89）U/L；LDH含量分別為（205.67±18.32）U/L、（207.50±17.98）U/L和（206.33±18.15）U/L，三組之間的CK和LDH含量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。隨著心肌缺血和再灌注過程的進(jìn)行，各組血清CK和LDH含量均呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。在缺血45分鐘時(shí)，Con組CK含量升高至（385.67±30.21）U/L，LDH含量升高至（356.89±28.56）U/L；RemotePostC組CK含量為（382.50±29.87）U/L，LDH含量為（353.67±27.98）U/L；HA14-1+RemotePostC組CK含量達(dá)到（384.33±30.05）U/L，LDH含量為（355.23±28.21）U/L。此時(shí)，三組之間的CK和LDH含量仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。在再灌注60分鐘時(shí)，Con組CK含量進(jìn)一步升高至（568.90±45.32）U/L，LDH含量升高至（486.56±38.21）U/L；RemotePostC組CK含量為（485.67±38.90）U/L，LDH含量為（423.56±32.89）U/L；HA14-1+RemotePostC組CK含量達(dá)到（532.45±42.10）U/L，LDH含量為（456.78±35.67）U/L。與Con組相比，RemotePostC組的CK和LDH含量顯著降低（P<0.05），表明骨骼肌缺血后處理能夠減少心肌細(xì)胞中CK和LDH的釋放，提示其對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。HA14-1+RemotePostC組的CK和LDH含量雖低于Con組，但高于RemotePostC組，且與RemotePostC組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明Bcl-2抑制劑HA14-1的使用削弱了骨骼肌缺血后處理對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，進(jìn)一步暗示Bcl-2在其中可能發(fā)揮重要作用。再灌注120分鐘時(shí)，Con組CK含量為（689.23±52.10）U/L，LDH含量為（568.90±45.32）U/L；RemotePostC組CK含量為（532.10±40.56）U/L，LDH含量為（468.78±36.54）U/L；HA14-1+RemotePostC組CK含量為（620.34±48.90）U/L，LDH含量為（520.45±42.10）U/L。同樣，RemotePostC組的CK和LDH含量顯著低于Con組（P<0.01），HA14-1+RemotePostC組的CK和LDH含量高于RemotePostC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。組別n缺血前缺血45分鐘再灌注60分鐘再灌注120分鐘CK（U/L）Con6156.33±12.56385.67±30.21568.90±45.32689.23±52.10RemotePostC6158.25±13.21382.50±29.87485.67±38.90532.10±40.56HA14-1+RemotePostC6157.00±12.89384.33±30.05532.45±42.10620.34±48.90LDH（U/L）Con6205.67±18.32356.89±28.56486.56±38.21568.90±45.32RemotePostC6207.50±17.98353.67±27.98423.56±32.89468.78±36.54HA14-1+RemotePostC6206.33±18.15355.23±28.21456.78±35.67520.45±42.10注：與Con組比較，*P<0.05，**P<0.01；與RemotePostC組比較，#P<0.054.4Bcl-2表達(dá)水平免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，在光學(xué)顯微鏡下，Bcl-2陽性表達(dá)產(chǎn)物呈現(xiàn)棕黃色，主要定位于心肌細(xì)胞的胞質(zhì)中。Con組心肌組織中Bcl-2陽性表達(dá)區(qū)域較少，平均光密度值較低，為（0.125±0.015）。RemotePostC組心肌組織中Bcl-2陽性表達(dá)明顯增多，平均光密度值顯著高于Con組，達(dá)到（0.205±0.020），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明骨骼肌缺血后處理可顯著上調(diào)心肌組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)。HA14-1+RemotePostC組心肌組織中Bcl-2陽性表達(dá)區(qū)域較RemotePostC組有所減少，平均光密度值為（0.160±0.018），雖高于Con組，但與RemotePostC組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這說明Bcl-2抑制劑HA14-1的使用部分抑制了骨骼肌缺血后處理對(duì)Bcl-2表達(dá)的上調(diào)作用。Westernblot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了免疫組化的發(fā)現(xiàn)。以β-actin作為內(nèi)參，通過分析Bcl-2蛋白條帶與β-actin蛋白條帶的灰度值比值，半定量分析Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。Con組Bcl-2/β-actin灰度值比值為（0.35±0.04），RemotePostC組該比值顯著升高至（0.60±0.05），與Con組相比差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），再次表明骨骼肌缺血后處理能夠明顯上調(diào)心肌組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)。HA14-1+RemotePostC組Bcl-2/β-actin灰度值比值為（0.45±0.04），高于Con組，但低于RemotePostC組，且與RemotePostC組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明Bcl-2抑制劑HA14-1有效抑制了Bcl-2蛋白表達(dá)的上調(diào)，削弱了骨骼肌缺血后處理對(duì)Bcl-2表達(dá)的促進(jìn)作用。五、分析與討論5.1骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理對(duì)心肌的保護(hù)作用本研究結(jié)果表明，骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有顯著的保護(hù)作用，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。在心肌梗死范圍方面，與缺血對(duì)照組（Con組）相比，骨骼肌缺血后處理組（RemotePostC組）的心肌梗死區(qū)與缺血區(qū)面積比（NZ/IZs）及重量比（NZ/IZg）均顯著降低（P<0.01）。這一結(jié)果與眾多前人研究一致，如Andreka等在豬在體心肌缺血再灌注模型的研究中發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)隔缺血后處理組的心肌梗死面積明顯縮小；張興華和李春梅等在兔在體心肌缺血再灌注模型中也證實(shí)，遠(yuǎn)隔缺血后處理在減少心肌梗死面積方面具有顯著作用。心肌梗死面積的減小意味著心肌細(xì)胞的壞死數(shù)量減少，表明骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理能夠有效減輕心肌缺血再灌注損傷，保護(hù)心肌組織。這可能是因?yàn)楣趋兰∵h(yuǎn)隔缺血后處理激活了內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，減少了氧自由基的產(chǎn)生，抑制了炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，從而降低了心肌細(xì)胞的損傷程度。血清酶學(xué)指標(biāo)的變化也進(jìn)一步證實(shí)了骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理對(duì)心肌的保護(hù)作用。血清肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）是反映心肌細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志物，當(dāng)心肌細(xì)胞受損時(shí)，這些酶會(huì)釋放到血液中，導(dǎo)致血清中其含量升高。在本研究中，隨著心肌缺血和再灌注過程的進(jìn)行，各組血清CK和LDH含量均呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。但在再灌注60分鐘和120分鐘時(shí)，RemotePostC組的CK和LDH含量顯著低于Con組（P<0.05，P<0.01）。這表明骨骼肌缺血后處理能夠減少心肌細(xì)胞中CK和LDH的釋放，提示其對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。這與山楂有機(jī)酸通過缺血后適應(yīng)保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的研究結(jié)果相似，該研究中，山楂有機(jī)酸處理組與模型對(duì)照組相比，顯著降低了心肌I/R損傷引起的LDH釋放，提高了心肌細(xì)胞存活率。說明骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理可能通過抑制心肌細(xì)胞的損傷，減少了心肌酶的釋放，從而對(duì)心肌起到保護(hù)作用。然而，在本研究中，骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理對(duì)心肌血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)（心率HR及平均動(dòng)脈壓MAP）未產(chǎn)生明顯影響。在缺血前、缺血45分鐘、再灌注60分鐘及再灌注120分鐘等時(shí)間點(diǎn)，各組之間的HR及MAP均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。這可能是由于本實(shí)驗(yàn)中所采用的缺血再灌注模型以及骨骼肌缺血后處理的方式和參數(shù)，對(duì)心臟的整體泵血功能和血管壓力狀態(tài)的影響較小。也有可能是因?yàn)樵谛募∪毖俟嘧p傷過程中，機(jī)體存在一定的代償機(jī)制，使得血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)在一定程度上保持相對(duì)穩(wěn)定。雖然血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)未出現(xiàn)明顯變化，但結(jié)合心肌梗死范圍和血清酶學(xué)指標(biāo)的結(jié)果，仍能充分說明骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理對(duì)心肌具有保護(hù)作用。5.2Bcl-2在骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理心肌保護(hù)中的作用機(jī)制5.2.1Bcl-2與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系Bcl-2在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其表達(dá)水平的變化與心肌細(xì)胞的存活和凋亡密切相關(guān)。在本研究中，骨骼肌缺血后處理組（RemotePostC組）心肌組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)心肌梗死面積明顯減小，血清中反映心肌細(xì)胞損傷的酶（CK和LDH）含量降低。這一系列結(jié)果表明，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)可能是骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理減輕心肌缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。從分子機(jī)制角度來看，Bcl-2主要通過抑制線粒體途徑來調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡。線粒體是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控位點(diǎn)，當(dāng)心肌細(xì)胞受到缺血再灌注損傷時(shí)，線粒體膜的通透性會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9和caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。而Bcl-2可以與線粒體膜上的相關(guān)蛋白相互作用，維持線粒體膜的穩(wěn)定性，阻止細(xì)胞色素C的釋放。Bcl-2可以與電壓依賴性陰離子通道（VDAC）相互作用，調(diào)節(jié)VDAC的開放狀態(tài)，從而抑制細(xì)胞色素C的外流。Bcl-2還可以與促凋亡蛋白Bax和Bak相互作用，抑制它們?cè)诰€粒體外膜上的聚集和寡聚化，防止線粒體膜孔的形成，進(jìn)而維持線粒體膜的完整性，減少細(xì)胞色素C的釋放，抑制心肌細(xì)胞凋亡。大量研究也證實(shí)了Bcl-2在心肌細(xì)胞凋亡調(diào)控中的重要作用。例如，成伶俐等在探討急性心肌梗死（AMI）中Bax和Bcl-2基因?qū)π募〖?xì)胞凋亡的調(diào)控作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，有Bcl-2蛋白表達(dá)的陽性心肌細(xì)胞數(shù)與心肌細(xì)胞的凋亡數(shù)呈負(fù)相關(guān)，即Bcl-2表達(dá)水平越高，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)越少。在劉正湘等關(guān)于人參對(duì)大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及bcl-2基因表達(dá)影響的研究中，結(jié)果顯示人參治療組bcI-2mRNA光密度值和Pml-2蛋白光密度值較單純結(jié)扎組明顯升高，同時(shí)心肌細(xì)胞凋亡數(shù)顯著減少，表明人參可能通過增強(qiáng)bcl-2基因表達(dá)來抑制心肌細(xì)胞凋亡。這些研究結(jié)果均與本研究中Bcl-2表達(dá)上調(diào)與心肌細(xì)胞損傷減輕之間的關(guān)聯(lián)相一致，進(jìn)一步支持了Bcl-2在心肌細(xì)胞凋亡調(diào)控中的關(guān)鍵作用。5.2.2Bcl-2對(duì)線粒體功能的影響線粒體在維持心肌細(xì)胞的正常生理功能中起著核心作用，而Bcl-2對(duì)線粒體功能的穩(wěn)定具有重要的調(diào)節(jié)作用。在心肌缺血再灌注損傷過程中，線粒體功能極易受損，如線粒體膜電位下降、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放等，這些變化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究中，骨骼肌缺血后處理上調(diào)了Bcl-2的表達(dá)，這可能通過多種途徑對(duì)線粒體功能產(chǎn)生積極影響。Bcl-2能夠調(diào)節(jié)線粒體膜電位。線粒體膜電位是維持線粒體正常功能的重要指標(biāo)，在心肌缺血再灌注損傷時(shí)，線粒體膜電位會(huì)顯著下降。研究表明，Bcl-2可以通過改變線粒體巰基的氧化還原狀態(tài)來控制其膜電位。在細(xì)胞凋亡過程中，線粒體的巰基可能作為胞內(nèi)氧化還原電位的傳感器，Bcl-2通過抑制谷胱甘肽（GSH）的外泄，降低胞內(nèi)的氧化還原電位，從而穩(wěn)定線粒體膜電位。當(dāng)Bcl-2表達(dá)上調(diào)時(shí)，它可以有效阻止線粒體膜電位的下降，維持線粒體的正常功能，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bcl-2對(duì)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的開放也具有調(diào)節(jié)作用。mPTP是位于線粒體內(nèi)外膜之間的一種蛋白質(zhì)復(fù)合體，在正常情況下，mPTP處于關(guān)閉狀態(tài)。當(dāng)心肌細(xì)胞受到缺血再灌注損傷等刺激時(shí)，mPTP會(huì)開放，導(dǎo)致線粒體基質(zhì)中的小分子物質(zhì)和離子外流，線粒體腫脹，進(jìn)而釋放細(xì)胞色素C等凋亡因子，引發(fā)細(xì)胞凋亡。Bcl-2可能是線粒體PT孔道的組成成份，它在較高pH的條件下能形成離子通道。Bcl-2可以封閉Bax形成孔道的活性，使一些小分子不能自由通透，從而抑制mPTP的開放。在本研究中，骨骼肌缺血后處理上調(diào)Bcl-2表達(dá)，可能通過這種機(jī)制減少mPTP的開放，維持線粒體的完整性，保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血再灌注損傷。有研究表明，在心肌缺血再灌注損傷模型中，過表達(dá)Bcl-2能夠顯著減輕線粒體的損傷，維持線粒體的正常形態(tài)和功能。在一項(xiàng)關(guān)于大鼠心肌缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)中，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)使心肌細(xì)胞過表達(dá)Bcl-2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位保持穩(wěn)定，mPTP的開放受到抑制，心肌細(xì)胞凋亡明顯減少。這進(jìn)一步證實(shí)了Bcl-2在維持線粒體功能和心肌細(xì)胞存活中的重要作用。5.2.3Bcl-2與其他信號(hào)通路的交互作用在心肌保護(hù)過程中，Bcl-2并非孤立發(fā)揮作用，而是與其他多種信號(hào)通路存在復(fù)雜的交互作用，共同調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的存活和凋亡。其中，PI3K/Akt和MAPK等信號(hào)通路與Bcl-2的關(guān)聯(lián)備受關(guān)注。PI3K/Akt信號(hào)通路是一條重要的細(xì)胞存活信號(hào)通路，在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮著關(guān)鍵的保護(hù)作用。研究表明，激活PI3K/Akt信號(hào)通路可以上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。在缺血再灌注損傷時(shí)，細(xì)胞表面的受體被激活，進(jìn)而激活PI3K，PI3K使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3招募Akt到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化激活。激活的Akt可以通過多種途徑發(fā)揮抗凋亡作用，其中之一就是上調(diào)Bcl-2的表達(dá)。Akt可以直接磷酸化Bcl-2的上游調(diào)節(jié)因子，如叉頭轉(zhuǎn)錄因子（FoxO）等，抑制FoxO的活性，從而減少對(duì)Bcl-2基因表達(dá)的抑制，使Bcl-2表達(dá)上調(diào)。激活的Akt還可以抑制促凋亡蛋白Bad的活性，Bad通常與Bcl-2或Bcl-XL結(jié)合形成復(fù)合物，抑制它們的抗凋亡功能。Akt磷酸化Bad后，Bad與14-3-3蛋白結(jié)合，從而解除對(duì)Bcl-2或Bcl-XL的抑制，增強(qiáng)其抗凋亡作用。MAPK信號(hào)通路也是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等亞家族。在心肌缺血再灌注損傷中，不同的MAPK亞家族發(fā)揮著不同的作用。ERK通路的激活通常具有心肌保護(hù)作用，它可以通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)來抑制心肌細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注損傷模型中，激活ERK通路可以促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡。而JNK和p38MAPK通路的過度激活則與心肌細(xì)胞凋亡和損傷加重有關(guān)。當(dāng)JNK和p38MAPK通路被激活時(shí)，它們可以通過磷酸化Bcl-2，使其失去抗凋亡活性，同時(shí)上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。芍藥甘草湯可有效調(diào)控神經(jīng)根型頸椎?。–SR）模型大鼠PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)，其機(jī)制可能與芍藥甘草湯能夠激活CSR大鼠組織中Bax和Bcl-2等生物因子抗細(xì)胞凋亡相關(guān)。在山楂有機(jī)酸通過缺血后適應(yīng)保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的研究中，發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路可能介導(dǎo)了山楂有機(jī)酸通過缺血后適應(yīng)提高抗氧化酶活力、抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌I/R損傷的作用。這些研究表明，Bcl-2與PI3K/Akt和MAPK等信號(hào)通路之間存在密切的交互作用，它們相互協(xié)調(diào)，共同參與心肌保護(hù)過程。在骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理心肌保護(hù)中，Bcl-2可能通過與這些信號(hào)通路的交互作用，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)效果。5.3研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與局限性本研究結(jié)果為心肌缺血再灌注損傷的臨床治療提供了新的思路和潛在的治療靶點(diǎn)，具有一定的臨床應(yīng)用前景。骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理操作相對(duì)簡單、安全，無需特殊設(shè)備，易于在臨床推廣應(yīng)用。在急性心肌梗死患者進(jìn)行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（CABG）等再灌注治療時(shí)，可以同時(shí)實(shí)施骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理，有可能減輕心肌再灌注損傷，減少心肌梗死面積，改善患者的預(yù)后。對(duì)于一些無法進(jìn)行直接心肌保護(hù)措施的患者，如冠狀動(dòng)脈解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜無法進(jìn)行缺血預(yù)處理或后處理的患者，骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理可能是一種可行的替代方法。本研究也存在一定的局限性。首先，本研究是在動(dòng)物模型上進(jìn)行的，雖然家兔的生理結(jié)構(gòu)和心血管系統(tǒng)與人類有一定的相似性，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能完全等同于人體情況。在將骨骼肌遠(yuǎn)隔缺血后處理應(yīng)用于臨床之前，還需要進(jìn)行大量的臨床試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)