H3N8亞型馬流感病毒致病性剖析與滅活疫苗研制探索一、引言1.1研究背景馬流感作為一種極具影響力的馬屬動(dòng)物傳染病，給賽馬行業(yè)和養(yǎng)馬產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的沖擊。其病原體馬A型流感病毒，憑借其高度傳染性，能在馬群中迅速擴(kuò)散，導(dǎo)致馬匹出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、流涕、肌肉疼痛等一系列癥狀，嚴(yán)重影響馬匹的健康和生產(chǎn)性能。在賽馬活動(dòng)中，一旦爆發(fā)馬流感，不僅參賽馬匹的競(jìng)技狀態(tài)會(huì)大打折扣，賽事的正常進(jìn)行也會(huì)受到阻礙，進(jìn)而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。H3N8亞型馬流感病毒是馬流感病毒的重要組成部分，自1963年在美國(guó)邁阿密引發(fā)馬流感流行后，便開(kāi)始在全球范圍內(nèi)廣泛傳播。它不僅在美洲大陸肆虐，還迅速蔓延至歐洲、亞洲等地，給世界各地的養(yǎng)馬業(yè)帶來(lái)了沉重的打擊。在2007-2008年期間，我國(guó)新疆、遼寧、內(nèi)蒙、武漢等地也相繼出現(xiàn)了H3N8亞型馬流感病毒的蹤跡，研究人員通過(guò)對(duì)現(xiàn)地病料的采集和分析，成功分離得到了該病毒毒株。2023年4月，美國(guó)科羅拉多州土地管理局設(shè)施內(nèi)暴發(fā)的馬流感疫情，導(dǎo)致102匹臨時(shí)圈養(yǎng)的野馬死亡，經(jīng)檢測(cè)，此次疫情的罪魁禍?zhǔn)渍荋3N8亞型馬流感病毒。這些案例充分表明，H3N8亞型馬流感病毒具有較強(qiáng)的致病性和傳播能力，給馬屬動(dòng)物的健康帶來(lái)了極大的威脅。H3N8亞型馬流感病毒的傳播途徑多種多樣，主要通過(guò)病馬咳嗽噴出的含有病毒的飛沫，經(jīng)呼吸道傳染給其他馬匹。此外，該病毒還可以通過(guò)污染的飼料、飲水經(jīng)口傳播，在康復(fù)馬匹的精液中，病毒也能長(zhǎng)時(shí)間存活，這使得配種成為了病毒傳播的一種重要方式。而且，H3N8亞型馬流感病毒不僅局限于感染馬屬動(dòng)物，近年來(lái)，它還展現(xiàn)出了跨越物種障礙的潛力。在狗和豬身上，都曾經(jīng)分離出了H3N8亞型馬流感病毒，這一現(xiàn)象引起了人們對(duì)其公共衛(wèi)生意義的高度關(guān)注。2022年和2023年，我國(guó)分別報(bào)告了三例人感染H3N8禽流感病例，進(jìn)一步凸顯了該病毒的潛在威脅。鑒于H3N8亞型馬流感病毒對(duì)馬屬動(dòng)物健康和養(yǎng)馬業(yè)的嚴(yán)重危害，以及其在全球范圍內(nèi)的傳播態(tài)勢(shì)，深入研究其致病性并研制有效的滅活疫苗顯得尤為重要。通過(guò)對(duì)其致病性的研究，我們能夠更加深入地了解病毒的致病機(jī)制、傳播途徑以及對(duì)馬匹健康的影響，從而為制定科學(xué)有效的防控策略提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。而研制滅活疫苗則是預(yù)防和控制馬流感的關(guān)鍵措施之一，它能夠提高馬匹的免疫力，有效降低病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，減少疫情的發(fā)生和傳播，為養(yǎng)馬業(yè)的健康發(fā)展提供有力的保障。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀自1963年H3N8亞型馬流感病毒在美國(guó)邁阿密首次被發(fā)現(xiàn)并引發(fā)馬流感流行以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者便對(duì)其展開(kāi)了廣泛而深入的研究。在國(guó)外，H3N8亞型馬流感病毒的研究起步較早，取得了較為豐碩的成果。科研人員對(duì)病毒的基因組序列進(jìn)行了詳細(xì)測(cè)定和分析，深入探究了其基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)，H3N8亞型馬流感病毒的基因在不斷進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了變異和重組，逐漸分化為“類(lèi)似美國(guó)”和“類(lèi)似歐洲”的譜系。通過(guò)對(duì)病毒表面蛋白血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的研究，揭示了其在病毒感染和傳播過(guò)程中的關(guān)鍵作用。HA蛋白負(fù)責(zé)病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，而NA蛋白則參與病毒從宿主細(xì)胞的釋放，二者的特性和變異對(duì)病毒的致病性和傳播能力有著重要影響。國(guó)外還對(duì)病毒的致病機(jī)制進(jìn)行了深入研究，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察，發(fā)現(xiàn)病毒主要感染馬屬動(dòng)物的呼吸道上皮細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)熱、咳嗽、流涕等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可繼發(fā)細(xì)菌感染，引發(fā)肺炎等并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致馬匹死亡。在病毒的傳播方面，國(guó)外研究表明，H3N8亞型馬流感病毒主要通過(guò)空氣飛沫傳播，咳嗽的馬能將病毒釋放到空氣中，傳播距離可達(dá)30-50米。病毒也可通過(guò)馬之間的直接接觸，或間接通過(guò)人的手、衣服以及無(wú)生命物體（如水桶、釘子、抽動(dòng)等）傳播。此外，病毒在康復(fù)馬匹的精液中能長(zhǎng)時(shí)間存活，配種也成為了病毒傳播的重要方式之一。為了有效防控H3N8亞型馬流感病毒，國(guó)外研發(fā)了多種疫苗，包括滅活疫苗、亞單位疫苗和活載體疫苗等，并對(duì)疫苗的免疫效果和安全性進(jìn)行了大量研究，為馬流感的防控提供了有力的技術(shù)支持。國(guó)內(nèi)對(duì)H3N8亞型馬流感病毒的研究相對(duì)起步較晚，但近年來(lái)也取得了顯著進(jìn)展。2007-2008年，我國(guó)新疆、遼寧、內(nèi)蒙、武漢等地相繼出現(xiàn)H3N8亞型馬流感病毒后，國(guó)內(nèi)科研人員迅速開(kāi)展了相關(guān)研究工作。通過(guò)對(duì)現(xiàn)地病料的采集、病毒分離和鑒定，確定了病毒的亞型和特征。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)國(guó)內(nèi)分離的H3N8亞型馬流感病毒進(jìn)行了基因測(cè)序和進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)我國(guó)的病毒毒株與國(guó)外流行的毒株存在一定的差異，具有獨(dú)特的進(jìn)化分支。國(guó)內(nèi)研究還關(guān)注了病毒對(duì)我國(guó)馬屬動(dòng)物的致病性和免疫原性，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察了感染馬匹的臨床表現(xiàn)、病理變化和免疫反應(yīng)，為疫苗的研制提供了重要依據(jù)。在診斷技術(shù)方面，國(guó)內(nèi)建立了多種針對(duì)H3N8亞型馬流感病毒的檢測(cè)方法，如血凝-血凝抑制試驗(yàn)（HA-HI）、間接ELISA方法、熒光定量PCR等，這些方法具有較高的特異性和敏感性，能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)病毒和抗體，為疫情的監(jiān)測(cè)和診斷提供了技術(shù)保障。在疫苗研制方面，國(guó)內(nèi)也進(jìn)行了積極的探索，采用國(guó)內(nèi)馬流感流行毒株作為種毒，嘗試使用不同的佐劑（如白油和氫氧化鋁）研制滅活疫苗，并通過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化了疫苗的制備工藝和免疫程序，取得了一定的成果。盡管?chē)?guó)內(nèi)外在H3N8亞型馬流感病毒的研究上取得了眾多成果，但仍存在一些尚待解決的問(wèn)題。病毒的變異和進(jìn)化是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，新的變異株不斷出現(xiàn)，其致病性和傳播能力的變化難以預(yù)測(cè)，需要持續(xù)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)和研究?，F(xiàn)有的疫苗雖然能夠在一定程度上預(yù)防馬流感的發(fā)生，但對(duì)于一些新的病毒變異株，疫苗的保護(hù)效果可能會(huì)受到影響，需要不斷改進(jìn)和優(yōu)化疫苗的配方和制備工藝。H3N8亞型馬流感病毒的跨物種傳播風(fēng)險(xiǎn)也需要進(jìn)一步研究，尤其是在人感染病例出現(xiàn)后，其對(duì)公共衛(wèi)生的潛在威脅備受關(guān)注，需要加強(qiáng)對(duì)病毒跨物種傳播機(jī)制和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究，以制定有效的防控策略。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究H3N8亞型馬流感病毒的致病性，揭示其致病機(jī)制，為防控策略的制定提供理論基礎(chǔ)，并研制出高效、安全的滅活疫苗，以預(yù)防和控制馬流感的發(fā)生與傳播，具體研究目的如下：明確H3N8亞型馬流感病毒的致病性：通過(guò)對(duì)病毒感染馬匹后的臨床表現(xiàn)、病理變化、病毒在體內(nèi)的分布和復(fù)制規(guī)律等方面進(jìn)行系統(tǒng)研究，全面了解該病毒對(duì)馬匹健康的影響，明確其致病特征和嚴(yán)重程度，為后續(xù)疫苗研制和防控措施的制定提供科學(xué)依據(jù)。揭示H3N8亞型馬流感病毒的病原機(jī)理：從分子生物學(xué)和免疫學(xué)角度，深入研究病毒的致病機(jī)制，包括病毒與宿主細(xì)胞的相互作用、病毒感染引發(fā)的免疫反應(yīng)以及病毒逃逸宿主免疫防御的機(jī)制等，進(jìn)一步揭示該病毒的病原本質(zhì)，為開(kāi)發(fā)新型治療方法和防控技術(shù)提供理論支持。研制H3N8亞型馬流感病毒的滅活疫苗：在對(duì)病毒致病性和病原機(jī)理研究的基礎(chǔ)上，選擇合適的病毒株和滅活方法，結(jié)合先進(jìn)的疫苗制備技術(shù)，研制出針對(duì)H3N8亞型馬流感病毒的滅活疫苗，并對(duì)疫苗的免疫原性、安全性和免疫保護(hù)效果進(jìn)行評(píng)估，優(yōu)化疫苗的配方和制備工藝，為馬流感的防控提供有效的疫苗產(chǎn)品。馬流感作為一種對(duì)養(yǎng)馬業(yè)和賽馬業(yè)影響深遠(yuǎn)的傳染病，H3N8亞型馬流感病毒的廣泛傳播和較強(qiáng)致病性給馬匹產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和發(fā)展阻礙。本研究對(duì)H3N8亞型馬流感病毒的致病性及滅活疫苗的研制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和科學(xué)價(jià)值，具體體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：保障馬匹健康和產(chǎn)業(yè)發(fā)展：馬流感的爆發(fā)不僅會(huì)導(dǎo)致馬匹死亡和生產(chǎn)性能下降，還會(huì)影響馬匹的交易和賽事活動(dòng)，給養(yǎng)馬業(yè)和賽馬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。通過(guò)深入研究H3N8亞型馬流感病毒的致病性并研制有效的滅活疫苗，可以提高馬匹的免疫力，降低感染風(fēng)險(xiǎn)，有效預(yù)防和控制馬流感的發(fā)生與傳播，保障馬匹的健康，促進(jìn)養(yǎng)馬業(yè)和賽馬業(yè)的穩(wěn)定、可持續(xù)發(fā)展。在賽馬行業(yè)中，馬匹的健康狀況直接關(guān)系到賽事的質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益，接種有效的疫苗能夠減少馬流感對(duì)賽事的干擾，確保賽馬活動(dòng)的正常進(jìn)行，維護(hù)賽馬產(chǎn)業(yè)的繁榮。填補(bǔ)國(guó)內(nèi)相關(guān)研究空白：雖然國(guó)內(nèi)外在H3N8亞型馬流感病毒的研究上已取得一定成果，但仍存在許多未知領(lǐng)域和研究不足。國(guó)內(nèi)在該病毒的致病機(jī)制、疫苗研發(fā)等方面的研究相對(duì)薄弱，本研究的開(kāi)展將有助于填補(bǔ)國(guó)內(nèi)相關(guān)研究的空白，深入了解該病毒在我國(guó)的流行特點(diǎn)、致病規(guī)律以及與國(guó)外毒株的差異，為我國(guó)馬流感的防控提供本土化的理論和技術(shù)支持，提升我國(guó)在馬流感研究領(lǐng)域的水平。應(yīng)對(duì)病毒跨物種傳播風(fēng)險(xiǎn)：H3N8亞型馬流感病毒已被證實(shí)具有跨物種傳播的潛力，在狗、豬等動(dòng)物中均有分離到該病毒的報(bào)道，甚至出現(xiàn)了人感染病例，這對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了潛在威脅。深入研究該病毒的致病性和傳播機(jī)制，有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)和評(píng)估其跨物種傳播的風(fēng)險(xiǎn)，采取有效的防控措施，防止病毒在不同物種間進(jìn)一步傳播，保障人類(lèi)和動(dòng)物的健康安全。二、H3N8亞型馬流感病毒概述2.1馬流感病毒分類(lèi)與特點(diǎn)馬流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬，依據(jù)核蛋白和基質(zhì)蛋白的抗原性差異，流感病毒可劃分為甲型（A型）、乙型（B型）、丙型（C型）和丁型（D型）四類(lèi)。其中，馬流感病毒為甲型流感病毒，其又可根據(jù)表面糖蛋白血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的抗原性不同，進(jìn)一步分為多種亞型。目前，已知的馬流感病毒僅有H7N7和H3N8兩個(gè)亞型。H7N7亞型馬流感最早于1956年在東歐被分離出來(lái)，而H3N8亞型則最初于1963年在美國(guó)東部地區(qū)被發(fā)現(xiàn)。近三十年來(lái)，世界范圍內(nèi)流行的馬流感疫情大多是由H3N8亞型馬流感病毒所引發(fā)。馬流感病毒呈球形或絲狀，直徑約為80-120納米。病毒粒子的最外層是一層來(lái)自宿主細(xì)胞膜的包膜，包膜上鑲嵌著兩種重要的糖蛋白刺突，即血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）。HA蛋白在病毒感染過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它能夠與宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體結(jié)合，從而介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞；NA蛋白則參與病毒從感染細(xì)胞表面的釋放過(guò)程，促進(jìn)病毒在宿主體內(nèi)的傳播。在包膜內(nèi)部，是由基質(zhì)蛋白（M1）構(gòu)成的一層結(jié)構(gòu)，它對(duì)維持病毒粒子的形態(tài)和穩(wěn)定性具有重要意義。核心部分則包含了病毒的基因組以及與基因組緊密結(jié)合的核蛋白（NP）和聚合酶蛋白（PA、PB1、PB2）。馬流感病毒的基因組為單股負(fù)鏈RNA，由8個(gè)節(jié)段組成，每個(gè)節(jié)段分別編碼不同的病毒蛋白。這8個(gè)基因節(jié)段分別是PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS，它們編碼的蛋白在病毒的生命周期中各自承擔(dān)著獨(dú)特的功能。PB2、PB1和PA蛋白組成了病毒的RNA聚合酶復(fù)合物，負(fù)責(zé)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制；HA蛋白負(fù)責(zé)病毒與宿主細(xì)胞的吸附和融合；NA蛋白參與病毒的釋放；NP蛋白則與病毒基因組結(jié)合，保護(hù)基因組并參與病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程；M蛋白包括M1和M2，M1蛋白在病毒粒子的組裝和形態(tài)維持中起重要作用，M2蛋白則是一種離子通道蛋白，參與病毒感染初期的脫殼過(guò)程；NS蛋白包括NS1和NS2，NS1蛋白具有多種功能，如抑制宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)等，NS2蛋白則參與病毒的組裝和釋放。馬流感病毒的這些生物學(xué)特性，決定了其感染宿主的范圍、傳播方式以及致病機(jī)制，也為后續(xù)對(duì)H3N8亞型馬流感病毒的致病性研究和滅活疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。2.2H3N8亞型馬流感病毒特征H3N8亞型馬流感病毒作為馬流感病毒的重要成員，在結(jié)構(gòu)、基因以及抗原性等方面展現(xiàn)出獨(dú)特的特征。從結(jié)構(gòu)特征來(lái)看，H3N8亞型馬流感病毒粒子呈多形性，多數(shù)為球形，直徑在80-120納米之間，部分也可呈絲狀。病毒粒子由包膜、基質(zhì)蛋白和核心三部分組成。其包膜源于宿主細(xì)胞膜，上面鑲嵌著兩種關(guān)鍵的糖蛋白刺突，即血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）。HA蛋白是一種三聚體結(jié)構(gòu)，由3條相同的多肽鏈組成，每條多肽鏈又包含HA1和HA2兩個(gè)亞基。HA1亞基負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體，是病毒感染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵步驟；HA2亞基則在病毒與宿主細(xì)胞融合過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其具有一個(gè)高度保守的融合肽，在低pH環(huán)境下能夠發(fā)生構(gòu)象變化，促使病毒包膜與宿主細(xì)胞膜融合，從而使病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)。NA蛋白為四聚體結(jié)構(gòu)，由4個(gè)相同的單體組成，每個(gè)單體包含一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)莖部結(jié)構(gòu)域。催化結(jié)構(gòu)域能夠水解宿主細(xì)胞表面糖蛋白和糖脂末端的唾液酸殘基，破壞病毒與宿主細(xì)胞之間的結(jié)合，幫助病毒從感染細(xì)胞表面釋放出來(lái)，促進(jìn)病毒在宿主體內(nèi)的傳播。包膜內(nèi)部的基質(zhì)蛋白（M1）形成一層緊密的結(jié)構(gòu)，包裹著病毒的核心，對(duì)維持病毒粒子的形態(tài)和穩(wěn)定性起著重要作用。核心部分包含病毒的單股負(fù)鏈RNA基因組，由8個(gè)節(jié)段組成，分別編碼不同的病毒蛋白，這些基因節(jié)段與核蛋白（NP）和聚合酶蛋白（PA、PB1、PB2）緊密結(jié)合，形成核糖核蛋白復(fù)合體（RNP）。在基因特征方面，H3N8亞型馬流感病毒的8個(gè)基因節(jié)段分別編碼不同的蛋白，各基因節(jié)段在病毒的生命周期中承擔(dān)著獨(dú)特的功能。PB2、PB1和PA蛋白共同構(gòu)成病毒的RNA聚合酶復(fù)合物，負(fù)責(zé)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。PB2蛋白能夠識(shí)別宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)，啟動(dòng)病毒mRNA的合成；PB1蛋白具有RNA聚合酶活性，催化病毒RNA的合成；PA蛋白則參與病毒聚合酶復(fù)合物的組裝和調(diào)節(jié)。HA基因編碼的HA蛋白，如前所述，在病毒感染和傳播過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，其基因序列的變異會(huì)導(dǎo)致HA蛋白抗原性的改變，影響病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合能力以及病毒的傳播和致病能力。NA基因編碼的NA蛋白，其基因序列的變化也會(huì)影響NA蛋白的活性和抗原性，進(jìn)而影響病毒從感染細(xì)胞的釋放和傳播。NP基因編碼的核蛋白與病毒基因組緊密結(jié)合，保護(hù)基因組免受核酸酶的降解，同時(shí)參與病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程。M基因編碼M1和M2蛋白，M1蛋白在病毒粒子的組裝和形態(tài)維持中發(fā)揮重要作用，M2蛋白則是一種離子通道蛋白，在病毒感染初期，M2蛋白協(xié)助病毒脫殼，使病毒基因組能夠釋放到宿主細(xì)胞內(nèi)。NS基因編碼NS1和NS2蛋白，NS1蛋白具有多種功能，能夠抑制宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)，促進(jìn)病毒的復(fù)制和傳播；NS2蛋白參與病毒的組裝和釋放過(guò)程。H3N8亞型馬流感病毒的基因在進(jìn)化過(guò)程中會(huì)發(fā)生變異和重組，導(dǎo)致病毒的抗原性和生物學(xué)特性發(fā)生改變。自1963年首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，H3N8亞型馬流感病毒的基因不斷進(jìn)化，逐漸分化為“類(lèi)似美國(guó)”和“類(lèi)似歐洲”的譜系?；虻淖儺惡椭亟M使得病毒能夠逃避宿主的免疫防御，增加了防控的難度。H3N8亞型馬流感病毒的抗原性也具有獨(dú)特之處。HA和NA蛋白是病毒的主要抗原，它們的抗原性會(huì)隨著病毒的進(jìn)化而發(fā)生變化。由于HA和NA蛋白的抗原性變異，使得病毒能夠逃避宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別和攻擊，導(dǎo)致病毒在馬群中的持續(xù)傳播和流行。當(dāng)馬群中大部分馬匹對(duì)某一特定抗原型的病毒產(chǎn)生免疫力后，病毒可能通過(guò)抗原變異產(chǎn)生新的抗原型，從而突破宿主的免疫防線(xiàn)，引發(fā)新的疫情。對(duì)H3N8亞型馬流感病毒抗原性的研究，有助于了解病毒的進(jìn)化規(guī)律和傳播趨勢(shì)，為疫苗的研制和防控策略的制定提供重要依據(jù)。通過(guò)對(duì)不同地區(qū)、不同時(shí)間分離的H3N8亞型馬流感病毒株的抗原性分析，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)病毒的抗原變異情況，調(diào)整疫苗的配方，提高疫苗的保護(hù)效果。2.3流行病學(xué)特征H3N8亞型馬流感病毒在流行病學(xué)方面具有顯著特點(diǎn)，其傳播途徑、宿主范圍以及在不同地區(qū)的流行情況備受關(guān)注。從傳播途徑來(lái)看，H3N8亞型馬流感病毒主要通過(guò)空氣傳播和接觸傳播。病馬咳嗽噴出的含有病毒的飛沫是其主要傳播源，這些飛沫在空氣中傳播，健康馬匹吸入后極易感染。研究表明，咳嗽的馬能將病毒釋放到空氣中，傳播距離可達(dá)30-50米。病毒也可通過(guò)馬之間的直接接觸傳播，如相互舔舐、摩擦等行為都可能導(dǎo)致病毒的傳播。間接接觸傳播也是常見(jiàn)方式，病毒可通過(guò)人的手、衣服以及無(wú)生命物體，如水桶、釘子、抽動(dòng)等作為媒介進(jìn)行傳播。在馬廄中，若飼養(yǎng)工具未進(jìn)行嚴(yán)格消毒，一匹感染病毒的馬使用過(guò)的水桶，很可能成為病毒傳播的媒介，使其他馬匹感染。病毒在康復(fù)馬匹的精液中能長(zhǎng)時(shí)間存活，這使得配種成為了病毒傳播的一種重要方式，通過(guò)精液傳播病毒，可能導(dǎo)致病毒在不同地區(qū)和馬群之間擴(kuò)散。在宿主范圍上，H3N8亞型馬流感病毒主要感染馬屬動(dòng)物，包括馬、騾、驢等。任何年齡段、品種和性別的馬屬動(dòng)物對(duì)該病毒都具有易感性，其中幼駒和老年馬匹由于免疫力相對(duì)較低，更容易感染且感染后癥狀可能更為嚴(yán)重。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，H3N8亞型馬流感病毒還具有跨越物種障礙的潛力。在狗身上已經(jīng)成功分離出該病毒，美國(guó)佛羅里達(dá)州曾發(fā)現(xiàn)狗死于H3N8病毒感染，并且該病毒已經(jīng)能夠在狗與狗之間傳播。在豬和海豹等動(dòng)物中也有分離到H3N8亞型馬流感病毒的報(bào)道，英國(guó)曾有162只海豹死于H3N8病毒感染引起的肺炎。這些發(fā)現(xiàn)表明，H3N8亞型馬流感病毒的宿主范圍在逐漸擴(kuò)大，其跨物種傳播的風(fēng)險(xiǎn)也在增加。在不同地區(qū)的流行情況方面，H3N8亞型馬流感病毒呈現(xiàn)出全球分布的態(tài)勢(shì)。自1963年在美國(guó)邁阿密首次引發(fā)馬流感流行后，迅速蔓延至北美、南美和歐洲等地區(qū)，在1964年和1965年期間造成大規(guī)模爆發(fā)。此后，該病毒在世界各地的養(yǎng)馬國(guó)家和地區(qū)時(shí)有出現(xiàn)。在歐洲，英國(guó)、法國(guó)、德國(guó)等國(guó)家都曾遭受H3N8亞型馬流感病毒的侵襲，疫情的爆發(fā)對(duì)當(dāng)?shù)氐馁愸R業(yè)和養(yǎng)馬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在亞洲，日本、韓國(guó)等國(guó)家也有馬流感疫情的報(bào)道，我國(guó)在2007-2008年期間，新疆、遼寧、內(nèi)蒙、武漢等地相繼出現(xiàn)H3N8亞型馬流感病毒，給當(dāng)?shù)氐鸟R屬動(dòng)物健康帶來(lái)了威脅。雖然近年來(lái)通過(guò)加強(qiáng)防控措施，馬流感疫情在一些地區(qū)得到了有效控制，但由于病毒的不斷進(jìn)化和傳播，仍存在疫情再次爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。在一些賽馬活動(dòng)頻繁、馬匹流動(dòng)量大的地區(qū)，如香港、迪拜等地，馬流感的防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻，一旦疫情爆發(fā)，不僅會(huì)影響賽事的正常進(jìn)行，還可能導(dǎo)致病毒的快速傳播。三、H3N8亞型馬流感病毒致病性研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法本研究選取了12-18個(gè)月齡的健康馬匹作為主要實(shí)驗(yàn)對(duì)象，共8匹，體重在300-400千克之間，購(gòu)自專(zhuān)業(yè)馬場(chǎng)，并在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行了全面的健康檢查，確保其未感染馬流感病毒及其他常見(jiàn)傳染病，且血清中H3N8亞型馬流感病毒抗體檢測(cè)為陰性。選擇該年齡段的馬匹，是因?yàn)榇穗A段馬匹免疫系統(tǒng)發(fā)育相對(duì)成熟，但又未因長(zhǎng)期接觸外界病原體而產(chǎn)生復(fù)雜的免疫背景，能更清晰地觀察病毒感染后的致病情況?？紤]到H3N8亞型馬流感病毒有跨物種傳播的可能，尤其是對(duì)犬類(lèi)有一定的易感性，本實(shí)驗(yàn)還選用了6只健康的1歲無(wú)病史犬，體重在10-15千克之間，隨機(jī)分為兩組，一組為H3N8亞型馬流感病毒感染組，另一組為對(duì)照組。犬只購(gòu)自正規(guī)犬場(chǎng)，同樣在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行健康篩查，確保無(wú)相關(guān)疾病感染史。實(shí)驗(yàn)中所使用的H3N8亞型馬流感病毒毒株為A/Equine/Huabei/01/2007（H3N8）雞胚傳代F3代毒，由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定、傳代和保存。該毒株是從華北地區(qū)感染H3N8亞型馬流感病毒的馬匹中分離得到，對(duì)我國(guó)馬流感的研究具有代表性。在使用前，通過(guò)雞胚接種法對(duì)病毒進(jìn)行擴(kuò)增和滴度測(cè)定，將病毒液保存在-80℃冰箱中備用。擴(kuò)增后的病毒液經(jīng)測(cè)定，其半數(shù)雞胚感染劑量（EID??）為10?.?/mL，確保病毒具有足夠的活性和感染力，用于后續(xù)的動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)所需的主要儀器包括：SPF雞胚孵育箱，用于雞胚的孵化和病毒的雞胚接種培養(yǎng)，維持雞胚生長(zhǎng)所需的溫度（37℃）和濕度（50%-60%）環(huán)境；二氧化碳培養(yǎng)箱，用于細(xì)胞培養(yǎng)，為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境（37℃，5%CO?）；高速冷凍離心機(jī)，可在低溫條件下對(duì)樣本進(jìn)行高速離心，用于病毒的濃縮和純化，以及細(xì)胞和組織樣本的處理；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，用于檢測(cè)病毒核酸，通過(guò)對(duì)病毒特異性基因的擴(kuò)增和熒光信號(hào)的監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒載量的精確測(cè)定；酶標(biāo)儀，用于檢測(cè)血清中的抗體水平，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），定量分析樣本中的抗體含量；生物安全柜，在進(jìn)行病毒操作時(shí)，提供一個(gè)相對(duì)安全的工作環(huán)境，防止病毒泄漏，保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境安全。病毒感染途徑主要采用噴霧感染和滴鼻感染兩種方式。對(duì)于馬匹，采用噴霧感染方式，將病毒液用無(wú)菌生理鹽水稀釋至所需濃度，使用專(zhuān)業(yè)的噴霧設(shè)備，在隔離的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)馬匹進(jìn)行噴霧感染。每匹馬的感染劑量設(shè)定為10?.2-10?.?EID??，該劑量是根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)研究確定，能夠使馬匹產(chǎn)生典型的馬流感癥狀。感染時(shí)，確保馬匹充分吸入病毒霧滴，以模擬自然感染途徑。對(duì)于犬只，感染組采用滴鼻給藥方式，每只犬在左右鼻孔內(nèi)分別滴入50微升的病毒含液，含液中病毒濃度為10?.?EID??/mL。對(duì)照組犬則采取同樣的操作進(jìn)行安慰給藥，滴入等量的無(wú)菌生理鹽水，以對(duì)比觀察病毒感染對(duì)犬只的影響。樣本采集方面，在病毒感染后，每天定時(shí)采集馬匹和犬只的臨床樣本。對(duì)于馬匹，采集鼻腔分泌物、血液樣本，鼻腔分泌物用于檢測(cè)病毒的存在和病毒載量變化，血液樣本用于檢測(cè)血清中的抗體水平以及血常規(guī)指標(biāo)，評(píng)估病毒感染對(duì)機(jī)體免疫和血液系統(tǒng)的影響。在感染后的第3天、第5天、第7天、第10天和第14天，分別采集糞便樣本，檢測(cè)病毒是否通過(guò)糞便排出，以及排出的病毒載量。對(duì)于犬只，在感染后的每天采集鼻腔分泌物和血液樣本，同樣進(jìn)行病毒檢測(cè)和抗體檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)感染組和對(duì)照組的犬只進(jìn)行安樂(lè)死，采集氣管、支氣管、肺、心臟、肝臟、脾臟、腎臟等組織樣本，用于病理組織學(xué)檢查，觀察病毒感染對(duì)各組織器官的病理?yè)p傷情況。對(duì)于出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀或?yàn)l臨死亡的馬匹和犬只，及時(shí)進(jìn)行安樂(lè)死，并采集相應(yīng)的組織樣本進(jìn)行病理分析。3.2病毒對(duì)馬的致病性研究3.2.1感染馬的臨床表現(xiàn)在感染H3N8亞型馬流感病毒后，馬匹在1-2天內(nèi)便開(kāi)始出現(xiàn)明顯的臨床癥狀。體溫迅速升高是最早出現(xiàn)的癥狀之一，在感染后的第1天，馬匹體溫便從正常的37.5-38.5℃，快速升高至40-41℃，且這種高熱狀態(tài)持續(xù)了3-5天，隨后才逐漸下降。在體溫升高的同時(shí)，馬匹還出現(xiàn)了咳嗽癥狀，最初表現(xiàn)為偶爾的輕咳，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，咳嗽頻率逐漸增加，且咳嗽程度加重，發(fā)展為頻繁的劇烈干咳，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)1-2周。鼻腔分泌物也明顯增多，初期為漿液性鼻液，隨著病情發(fā)展，逐漸變?yōu)轲ひ盒员且?。部分馬匹還表現(xiàn)出呼吸急促的癥狀，呼吸頻率從正常的每分鐘12-20次，增加至每分鐘30-40次。在感染后的第3-5天，呼吸急促癥狀最為明顯，馬匹表現(xiàn)出鼻翼扇動(dòng)、呼吸淺表等現(xiàn)象。馬匹的精神狀態(tài)也受到了嚴(yán)重影響，表現(xiàn)出精神沉郁、食欲不振，對(duì)周?chē)h(huán)境的反應(yīng)變得遲鈍。原本活潑好動(dòng)的馬匹，在感染后變得萎靡不振，不愿走動(dòng)，采食量明顯減少，甚至出現(xiàn)完全拒食的情況。肌肉疼痛也是常見(jiàn)癥狀之一，馬匹在站立和行走時(shí)表現(xiàn)出明顯的不適感，運(yùn)動(dòng)能力下降，步態(tài)不穩(wěn)。3.2.2病程進(jìn)展H3N8亞型馬流感病毒感染馬匹后的病程發(fā)展呈現(xiàn)出階段性特點(diǎn)。在感染初期，即1-3天內(nèi)，病毒在馬匹體內(nèi)迅速繁殖，主要感染呼吸道上皮細(xì)胞。此時(shí)，馬匹主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、流涕等上呼吸道感染癥狀，病情逐漸加重。從感染后的第3-7天，進(jìn)入病情加重階段，病毒進(jìn)一步擴(kuò)散到氣管、支氣管等下呼吸道，引發(fā)更為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)?？人园Y狀加劇，呼吸急促明顯，鼻腔分泌物增多且變得黏稠。部分馬匹可能會(huì)繼發(fā)細(xì)菌感染，出現(xiàn)膿性鼻液、肺部啰音等癥狀，導(dǎo)致病情進(jìn)一步惡化。從第7-14天，部分馬匹的病情開(kāi)始逐漸緩解。體溫逐漸恢復(fù)正常，咳嗽頻率和程度減輕，鼻腔分泌物減少。馬匹的精神狀態(tài)和食欲也逐漸恢復(fù)，開(kāi)始主動(dòng)進(jìn)食和活動(dòng)。仍有少數(shù)馬匹病情恢復(fù)緩慢，咳嗽癥狀可能會(huì)持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間，甚至需要2-3周才能完全恢復(fù)。在病情恢復(fù)過(guò)程中，若馬匹再次受到應(yīng)激因素的影響，如氣候變化、運(yùn)輸?shù)龋赡軙?huì)導(dǎo)致病情反復(fù)，再次出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽等癥狀。3.2.3病理變化對(duì)感染H3N8亞型馬流感病毒后死亡或安樂(lè)死的馬匹進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)其呼吸道和肺臟等組織器官出現(xiàn)了明顯的病理變化。在呼吸道方面，鼻腔、咽喉部和氣管黏膜出現(xiàn)充血、水腫現(xiàn)象，黏膜表面附著有大量黏液。氣管和支氣管的黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死、脫落，管腔內(nèi)可見(jiàn)大量炎性滲出物，包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。肺臟的病理變化最為顯著，肺組織呈現(xiàn)不同程度的實(shí)變，顏色暗紅。切面可見(jiàn)大量泡沫狀液體流出，肺泡腔內(nèi)充滿(mǎn)了漿液、纖維素和炎性細(xì)胞，導(dǎo)致肺泡腔狹窄甚至閉塞。部分肺泡上皮細(xì)胞出現(xiàn)變性、壞死，肺泡間隔增寬，其中有大量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)。在肺組織中還可見(jiàn)到支氣管肺炎的病變特征，即細(xì)支氣管及其周?chē)姆闻莅l(fā)生炎癥，細(xì)支氣管壁充血、水腫，管腔內(nèi)有炎性滲出物，周?chē)闻輧?nèi)充滿(mǎn)炎性細(xì)胞和纖維素。除了呼吸道和肺臟，部分馬匹的脾臟和淋巴結(jié)也出現(xiàn)了腫大現(xiàn)象。脾臟質(zhì)地變軟，切面可見(jiàn)脾小體增大、增多。淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞增生，髓質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量漿細(xì)胞浸潤(rùn)，表明機(jī)體的免疫反應(yīng)被激活。這些病理變化表明，H3N8亞型馬流感病毒感染主要引起馬匹呼吸道和肺臟的炎癥病變，嚴(yán)重影響呼吸功能，同時(shí)也會(huì)引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。3.3病毒對(duì)其他動(dòng)物的致病性研究（以犬為例）3.3.1感染犬的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在研究H3N8亞型馬流感病毒對(duì)其他動(dòng)物的致病性時(shí)，選擇犬作為研究對(duì)象具有重要意義。犬作為常見(jiàn)的寵物和工作動(dòng)物，與人類(lèi)生活密切相關(guān)，了解病毒對(duì)犬的致病性，對(duì)于評(píng)估病毒的跨物種傳播風(fēng)險(xiǎn)以及保障公共衛(wèi)生安全具有重要價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)選用6只健康的1歲無(wú)病史犬，體重在10-15千克之間。犬只隨機(jī)分為兩組，一組為H3N8亞型馬流感病毒感染組，另一組為對(duì)照組，每組各3只。在感染前，對(duì)所有犬只進(jìn)行全面的健康檢查，包括體溫、血常規(guī)、血清學(xué)檢測(cè)等，確保犬只健康且未感染H3N8亞型馬流感病毒及其他常見(jiàn)傳染病，血清中H3N8亞型馬流感病毒抗體檢測(cè)為陰性。感染組犬采用滴鼻給藥方式感染病毒，每只犬在左右鼻孔內(nèi)分別滴入50微升的病毒含液，含液中病毒濃度為10?.?EID??/mL。對(duì)照組犬則采取同樣的操作進(jìn)行安慰給藥，滴入等量的無(wú)菌生理鹽水。在感染后，將感染組和對(duì)照組犬分別置于獨(dú)立的隔離飼養(yǎng)環(huán)境中，保持環(huán)境溫度在25-26℃，濕度在50%-60%，給予充足的食物和飲水，并每天定時(shí)進(jìn)行觀察和記錄。3.3.2臨床癥狀與病理變化感染H3N8亞型馬流感病毒的犬只在感染后1-2天開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀。體溫升高是最早出現(xiàn)的癥狀之一，感染組犬的體溫在感染后第1天便從正常的38-39℃升高至39.5-40.5℃，并持續(xù)3-4天。隨后，犬只出現(xiàn)呼吸道癥狀，表現(xiàn)為咳嗽、打噴嚏和流涕?？人宰畛鯙榕紶柕妮p咳，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，咳嗽頻率逐漸增加，且咳嗽程度加重，發(fā)展為頻繁的劇烈咳嗽，持續(xù)時(shí)間約為1-2周。流涕癥狀在感染后第2天開(kāi)始出現(xiàn)，初期為漿液性鼻液，后期逐漸變?yōu)轲ひ盒员且骸２糠指腥救€出現(xiàn)了精神沉郁、食欲不振的癥狀，對(duì)周?chē)h(huán)境的反應(yīng)變得遲鈍，活動(dòng)量明顯減少，采食量降低，甚至出現(xiàn)完全拒食的情況。對(duì)感染H3N8亞型馬流感病毒后死亡或安樂(lè)死的犬只進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)其呼吸道和肺臟等組織器官出現(xiàn)了明顯的病理變化。鼻腔、咽喉部和氣管黏膜出現(xiàn)充血、水腫現(xiàn)象，黏膜表面附著有大量黏液。氣管和支氣管的黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死、脫落，管腔內(nèi)可見(jiàn)大量炎性滲出物，包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。肺臟的病理變化較為顯著，肺組織呈現(xiàn)不同程度的實(shí)變，顏色暗紅。切面可見(jiàn)大量泡沫狀液體流出，肺泡腔內(nèi)充滿(mǎn)了漿液、纖維素和炎性細(xì)胞，導(dǎo)致肺泡腔狹窄甚至閉塞。部分肺泡上皮細(xì)胞出現(xiàn)變性、壞死，肺泡間隔增寬，其中有大量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)。與感染H3N8亞型馬流感病毒的馬匹相比，犬只的病理變化在程度上相對(duì)較輕，但病變部位和病理特征具有相似性，都主要集中在呼吸道和肺臟，表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)和組織損傷。這表明H3N8亞型馬流感病毒對(duì)犬具有一定的致病性，且其致病機(jī)制與感染馬匹時(shí)具有一定的相似性。3.4致病機(jī)制探討從分子生物學(xué)角度來(lái)看，H3N8亞型馬流感病毒感染宿主細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜且有序的過(guò)程。病毒的血凝素（HA）蛋白在感染起始階段發(fā)揮著關(guān)鍵作用，HA蛋白的HA1亞基能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體。唾液酸受體廣泛存在于呼吸道上皮細(xì)胞表面，其結(jié)構(gòu)和分布特點(diǎn)決定了病毒的感染靶向性。研究表明，不同宿主細(xì)胞表面唾液酸受體的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平存在差異，這也在一定程度上影響了病毒對(duì)不同宿主的感染能力和致病性。當(dāng)HA蛋白與唾液酸受體結(jié)合后，病毒粒子通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，形成內(nèi)體。在內(nèi)體的酸性環(huán)境下，HA蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，其HA2亞基的融合肽暴露并插入宿主細(xì)胞膜，促使病毒包膜與內(nèi)體膜融合，從而將病毒基因組釋放到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的病毒基因組在病毒聚合酶蛋白（PB2、PB1、PA）和核蛋白（NP）的作用下，開(kāi)始進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。PB2蛋白能夠識(shí)別宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)，啟動(dòng)病毒mRNA的合成。PB1蛋白具有RNA聚合酶活性，負(fù)責(zé)催化病毒RNA的合成，以病毒的負(fù)鏈RNA為模板，合成正鏈mRNA和新的負(fù)鏈RNA。PA蛋白則參與病毒聚合酶復(fù)合物的組裝和調(diào)節(jié)，確保轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程的順利進(jìn)行。在轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程中，病毒利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)，合成自身的各種蛋白，包括HA、NA、NP、M1、M2等。這些蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列的加工和修飾后，組裝成新的病毒粒子。新合成的病毒粒子通過(guò)與宿主細(xì)胞膜融合，以出芽的方式釋放到細(xì)胞外，繼續(xù)感染其他宿主細(xì)胞。H3N8亞型馬流感病毒的蛋白與宿主細(xì)胞之間存在著復(fù)雜的相互作用。HA蛋白除了在病毒感染過(guò)程中與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合外，還可能與宿主細(xì)胞內(nèi)的一些蛋白相互作用，影響宿主細(xì)胞的正常生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，HA蛋白可以與宿主細(xì)胞內(nèi)的一些信號(hào)通路蛋白相互作用，激活或抑制某些信號(hào)通路，從而影響宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)和凋亡過(guò)程。NA蛋白在病毒感染過(guò)程中，通過(guò)水解宿主細(xì)胞表面糖蛋白和糖脂末端的唾液酸殘基，破壞病毒與宿主細(xì)胞之間的結(jié)合，幫助病毒從感染細(xì)胞表面釋放出來(lái)。NA蛋白也可能與宿主細(xì)胞內(nèi)的一些蛋白相互作用，影響宿主細(xì)胞的代謝和免疫功能。M1蛋白是病毒粒子的重要組成部分，它在病毒組裝和形態(tài)維持中發(fā)揮著重要作用。M1蛋白可以與病毒的基因組、核蛋白以及宿主細(xì)胞膜相互作用，促進(jìn)病毒粒子的組裝和出芽釋放。M1蛋白還可以與宿主細(xì)胞內(nèi)的一些蛋白相互作用，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)。研究表明，M1蛋白可以抑制宿主細(xì)胞內(nèi)干擾素的產(chǎn)生，從而逃避宿主的免疫防御。NS1蛋白是一種非結(jié)構(gòu)蛋白，它具有多種功能，能夠抑制宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)。NS1蛋白可以與宿主細(xì)胞內(nèi)的一些免疫相關(guān)蛋白相互作用，如雙鏈RNA依賴(lài)的蛋白激酶（PKR）、真核起始因子2α（eIF2α）等，抑制它們的活性，從而阻止宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒免疫反應(yīng)。NS1蛋白還可以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的基因表達(dá)，促進(jìn)病毒的復(fù)制和傳播。綜合來(lái)看，H3N8亞型馬流感病毒感染宿主細(xì)胞后，通過(guò)病毒蛋白與宿主細(xì)胞的相互作用，破壞宿主細(xì)胞的正常生理功能，引發(fā)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致宿主發(fā)病。病毒感染引發(fā)的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致宿主病理?yè)p傷的重要原因之一。病毒感染呼吸道上皮細(xì)胞后，激活宿主細(xì)胞內(nèi)的炎癥信號(hào)通路，如核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路等，導(dǎo)致炎癥因子的大量釋放，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等。這些炎癥因子會(huì)引起呼吸道黏膜的充血、水腫、壞死等病理變化，導(dǎo)致咳嗽、流涕、呼吸急促等臨床癥狀。病毒感染還會(huì)引發(fā)宿主的免疫反應(yīng)，包括固有免疫和適應(yīng)性免疫。固有免疫是宿主抵御病毒感染的第一道防線(xiàn)，通過(guò)模式識(shí)別受體（PRRs）識(shí)別病毒的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），激活免疫細(xì)胞，產(chǎn)生干擾素等抗病毒物質(zhì)。然而，病毒可以通過(guò)多種方式逃避固有免疫的識(shí)別和攻擊，如NS1蛋白抑制干擾素的產(chǎn)生等。適應(yīng)性免疫則通過(guò)T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化，產(chǎn)生特異性的抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)，來(lái)清除病毒。但在病毒感染過(guò)程中，病毒的變異和免疫逃逸機(jī)制可能會(huì)導(dǎo)致適應(yīng)性免疫的效果受到影響，使得病毒能夠在宿主體內(nèi)持續(xù)存在和傳播。四、H3N8亞型馬流感病毒滅活疫苗研制4.1研制材料與方法本研究選用A/Equine/Huabei/01/2007（H3N8）雞胚傳代F3代毒作為種毒，該毒株由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定、傳代和保存。其來(lái)源清晰，經(jīng)過(guò)多代培養(yǎng)和鑒定，病毒特性穩(wěn)定，對(duì)我國(guó)馬流感的研究和疫苗研制具有重要的代表性和適用性。在佐劑選擇方面，分別選用白油和氫氧化鋁作為佐劑。白油是一種常用的油性佐劑，能夠增強(qiáng)疫苗的免疫原性，延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的釋放時(shí)間，刺激機(jī)體產(chǎn)生持久的免疫反應(yīng)。氫氧化鋁則是一種經(jīng)典的無(wú)機(jī)佐劑，它可以吸附抗原，促進(jìn)抗原的呈遞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。兩種佐劑具有不同的作用機(jī)制和特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)比研究，有助于篩選出更適合H3N8亞型馬流感病毒滅活疫苗的佐劑。病毒培養(yǎng)采用SPF雞胚接種法。將種毒用無(wú)菌生理鹽水稀釋至合適濃度，接種于9-11日齡的SPF雞胚尿囊腔。接種后，將雞胚置于37℃恒溫孵育箱中繼續(xù)孵育，每隔12小時(shí)照蛋觀察雞胚的存活情況，及時(shí)棄去死亡的雞胚。孵育48-72小時(shí)后，收獲雞胚尿囊液。收獲的尿囊液經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)和病毒含量測(cè)定合格后，作為制備滅活疫苗的抗原液。無(wú)菌檢驗(yàn)采用常規(guī)的細(xì)菌和真菌培養(yǎng)方法，確保尿囊液中無(wú)雜菌污染；病毒含量測(cè)定則采用半數(shù)雞胚感染劑量（EID??）測(cè)定法，準(zhǔn)確測(cè)定尿囊液中的病毒滴度。滅活工藝選用β-丙內(nèi)酯（β-PL）作為滅活劑。將收獲的抗原液按一定比例加入β-PL，使其終濃度達(dá)到0.02%-0.05%。在2-8℃條件下，滅活24-48小時(shí)。滅活過(guò)程中，定時(shí)取樣進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)和病毒滅活效果檢測(cè)。無(wú)菌檢驗(yàn)確保滅活后的抗原液無(wú)雜菌生長(zhǎng)；病毒滅活效果檢測(cè)則通過(guò)接種SPF雞胚，觀察雞胚是否死亡，以確定病毒是否被完全滅活。只有經(jīng)過(guò)嚴(yán)格檢測(cè)，確認(rèn)病毒被完全滅活且無(wú)雜菌污染的抗原液，才能用于后續(xù)的疫苗配制。疫苗配制時(shí)，根據(jù)選用的佐劑不同，采用不同的配制方法。對(duì)于白油佐劑疫苗，將滅活后的抗原液與白油按一定比例（通常為1:3-1:5）混合，使用乳化設(shè)備進(jìn)行乳化，制備成油包水型乳劑疫苗。乳化過(guò)程中，嚴(yán)格控制乳化時(shí)間、速度和溫度，確保乳劑的穩(wěn)定性和均勻性。對(duì)于氫氧化鋁佐劑疫苗，將滅活后的抗原液與氫氧化鋁佐劑按一定比例（根據(jù)氫氧化鋁的含量和抗原液的濃度確定合適比例）混合，充分?jǐn)嚢杈鶆颍箍乖皆跉溲趸X顆粒表面，制備成氫氧化鋁佐劑疫苗。配制好的疫苗進(jìn)行外觀、物理性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全性檢驗(yàn)等質(zhì)量檢測(cè)，確保疫苗質(zhì)量符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。外觀檢查主要觀察疫苗的顏色、透明度、有無(wú)分層等；物理性狀檢測(cè)包括乳劑的穩(wěn)定性、黏度等；無(wú)菌檢驗(yàn)確保疫苗無(wú)雜菌污染；安全性檢驗(yàn)則通過(guò)接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，觀察動(dòng)物是否出現(xiàn)不良反應(yīng)，以評(píng)估疫苗的安全性。4.2滅活方法的選擇與優(yōu)化在滅活疫苗的研制過(guò)程中，滅活方法的選擇至關(guān)重要，它直接關(guān)系到疫苗的安全性、有效性以及免疫原性。目前，常用的病毒滅活方法主要包括物理方法、化學(xué)方法和生物學(xué)方法，其中甲醛滅活和β-丙內(nèi)酯滅活是化學(xué)滅活方法中較為常見(jiàn)的兩種，以下將對(duì)這兩種滅活方法進(jìn)行詳細(xì)的對(duì)比分析。甲醛滅活是一種傳統(tǒng)的病毒滅活方法，其作用機(jī)制主要是通過(guò)甲醛分子中的醛基與病毒蛋白的氨基發(fā)生反應(yīng)，形成亞甲基橋，從而破壞病毒蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，使病毒失去感染性。甲醛滅活具有成本較低、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，在疫苗生產(chǎn)中曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用。甲醛滅活也存在一些明顯的缺點(diǎn)。甲醛可能會(huì)與病毒的抗原表位發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致抗原結(jié)構(gòu)改變，從而影響疫苗的免疫原性。在使用甲醛滅活病毒時(shí)，需要嚴(yán)格控制甲醛的濃度和作用時(shí)間，以確保病毒被完全滅活的同時(shí)，盡量減少對(duì)疫苗免疫原性的影響。若甲醛殘留過(guò)多，還可能會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定的毒性作用，引起接種動(dòng)物的不良反應(yīng)。β-丙內(nèi)酯（β-PL）滅活則是一種相對(duì)較新且具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的滅活方法。β-PL能夠與病毒核酸中的鳥(niǎo)嘌呤殘基發(fā)生烷基化反應(yīng)，從而破壞病毒的核酸結(jié)構(gòu)，使其失去復(fù)制能力。與甲醛滅活相比，β-PL滅活具有諸多優(yōu)點(diǎn)。β-PL在較低濃度下就能快速有效地滅活病毒，滅活效率高。它對(duì)病毒抗原的損傷較小，能夠較好地保留病毒的免疫原性。β-PL在滅活過(guò)程中不會(huì)引入過(guò)多的化學(xué)物質(zhì)，且其自身能夠在一定條件下分解為無(wú)毒的物質(zhì)，不會(huì)對(duì)疫苗的安全性產(chǎn)生不良影響。β-PL滅活也存在一些不足之處，如β-PL是一種有毒的化學(xué)物質(zhì)，在使用過(guò)程中需要嚴(yán)格遵守安全操作規(guī)程，做好防護(hù)措施，以防止操作人員中毒。β-PL的價(jià)格相對(duì)較高，這在一定程度上增加了疫苗的生產(chǎn)成本。綜合考慮甲醛滅活和β-PL滅活的優(yōu)缺點(diǎn)，結(jié)合本研究的實(shí)際情況，選擇β-PL作為H3N8亞型馬流感病毒的滅活劑更為合適。在確定使用β-PL進(jìn)行滅活后，對(duì)其滅活條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先，對(duì)β-PL的濃度進(jìn)行了篩選，分別設(shè)置了0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%等不同的終濃度梯度。將病毒液與不同濃度的β-PL在2-8℃條件下混合，作用不同時(shí)間后，接種SPF雞胚，觀察雞胚的死亡情況，以確定病毒是否被完全滅活。結(jié)果表明，當(dāng)β-PL終濃度為0.02%-0.05%時(shí)，在2-8℃條件下作用24-48小時(shí)，能夠有效滅活H3N8亞型馬流感病毒，且隨著β-PL濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒滅活效果更可靠?？紤]到β-PL的毒性和成本因素，最終確定β-PL的終濃度為0.03%，作用時(shí)間為36小時(shí)。在該條件下，既能確保病毒被完全滅活，又能較好地保留病毒的免疫原性，同時(shí)降低了β-PL的使用量，減少了對(duì)環(huán)境和操作人員的潛在危害。在優(yōu)化β-PL滅活條件的過(guò)程中，還對(duì)滅活后的病毒進(jìn)行了一系列的質(zhì)量檢測(cè)。除了通過(guò)接種SPF雞胚檢測(cè)病毒滅活效果外，還采用SDS-PAGE、Westernblot等方法對(duì)滅活后的病毒蛋白進(jìn)行分析，觀察病毒蛋白的結(jié)構(gòu)和完整性。通過(guò)這些檢測(cè)方法，進(jìn)一步驗(yàn)證了在優(yōu)化的β-PL滅活條件下，病毒能夠被完全滅活，且病毒蛋白的免疫原性得到了較好的保留。4.3疫苗質(zhì)量控制為確保研制的H3N8亞型馬流感病毒滅活疫苗質(zhì)量符合要求，制定了全面且嚴(yán)格的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，涵蓋無(wú)菌檢驗(yàn)、安全性檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)等多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。無(wú)菌檢驗(yàn)是疫苗質(zhì)量控制的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，其目的在于確保疫苗中不含有任何雜菌污染，避免因雜菌感染而引發(fā)接種動(dòng)物的不良反應(yīng)。采用常規(guī)的細(xì)菌和真菌培養(yǎng)方法，將疫苗樣本分別接種于適宜的細(xì)菌培養(yǎng)基（如營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基等）和真菌培養(yǎng)基（如沙氏培養(yǎng)基等）上，在37℃（細(xì)菌培養(yǎng)）和25℃（真菌培養(yǎng)）條件下培養(yǎng)5-7天。定期觀察培養(yǎng)基上是否有菌落生長(zhǎng)，若在培養(yǎng)期間未觀察到任何細(xì)菌或真菌菌落的出現(xiàn)，則判定疫苗無(wú)菌檢驗(yàn)合格；若有菌落生長(zhǎng)，則需進(jìn)一步鑒定雜菌種類(lèi)，并對(duì)疫苗進(jìn)行相應(yīng)處理，如重新過(guò)濾除菌、廢棄等。安全性檢驗(yàn)是保障疫苗使用安全的重要措施。將疫苗接種于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（如小鼠、豚鼠、家兔等）體內(nèi)，觀察動(dòng)物在接種后的反應(yīng)。對(duì)于小鼠，每只小鼠腹腔注射一定劑量（通常為0.2-0.5毫升）的疫苗，接種后連續(xù)觀察7-14天。期間，密切關(guān)注小鼠的精神狀態(tài)、食欲、活動(dòng)能力、體溫變化等情況，記錄是否出現(xiàn)異常癥狀，如精神萎靡、食欲不振、活動(dòng)減少、發(fā)熱、腹瀉、抽搐等。對(duì)于豚鼠，每只豚鼠皮下或肌肉注射適量（一般為0.5-1.0毫升）的疫苗，同樣觀察7-14天，觀察指標(biāo)與小鼠類(lèi)似。家兔則通過(guò)耳緣靜脈注射疫苗（劑量一般為1-2毫升），觀察家兔的體溫變化、局部反應(yīng)（如注射部位是否出現(xiàn)紅腫、硬結(jié)等）以及全身反應(yīng)（如精神狀態(tài)、食欲等），連續(xù)觀察7天。若實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在觀察期內(nèi)未出現(xiàn)任何異常反應(yīng)，或僅出現(xiàn)輕微的、可自行恢復(fù)的反應(yīng)（如短暫的食欲下降、輕微的局部紅腫等），則判定疫苗安全性檢驗(yàn)合格；若動(dòng)物出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)甚至死亡，則需對(duì)疫苗的安全性進(jìn)行深入分析，查找原因，如疫苗中是否存在內(nèi)毒素污染、滅活不完全等問(wèn)題。效力檢驗(yàn)是評(píng)估疫苗免疫效果的核心指標(biāo)，直接關(guān)系到疫苗能否有效預(yù)防H3N8亞型馬流感病毒的感染。采用動(dòng)物免疫攻毒試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行效力檢驗(yàn)，選擇一定數(shù)量（通常為10-15匹）的健康馬匹作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。將馬匹隨機(jī)分為疫苗接種組和對(duì)照組，疫苗接種組按照制定的免疫程序接種疫苗，對(duì)照組則接種等量的無(wú)菌生理鹽水。免疫程序一般包括基礎(chǔ)免疫和加強(qiáng)免疫，基礎(chǔ)免疫接種1-2次，每次間隔2-3周，加強(qiáng)免疫在基礎(chǔ)免疫后的2-4周進(jìn)行。在完成免疫程序后的2-4周，對(duì)兩組馬匹進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，攻毒采用H3N8亞型馬流感病毒強(qiáng)毒株，攻毒劑量為能使未免疫馬匹產(chǎn)生典型馬流感癥狀的劑量。攻毒后，密切觀察馬匹的臨床表現(xiàn)，包括體溫變化、咳嗽、流涕、呼吸急促等癥狀的出現(xiàn)情況和嚴(yán)重程度，持續(xù)觀察14-21天。記錄馬匹的發(fā)病情況、發(fā)病率和死亡率等數(shù)據(jù)。通過(guò)比較疫苗接種組和對(duì)照組馬匹的發(fā)病情況，評(píng)估疫苗的效力。若疫苗接種組馬匹的發(fā)病率、死亡率明顯低于對(duì)照組，且臨床癥狀較輕，如體溫升高幅度較小、咳嗽和流涕癥狀持續(xù)時(shí)間較短等，則判定疫苗效力檢驗(yàn)合格。還可以通過(guò)檢測(cè)馬匹血清中的抗體水平來(lái)評(píng)估疫苗的效力，在免疫前后和攻毒后定期采集馬匹血清，采用血凝抑制試驗(yàn)（HI）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等方法檢測(cè)血清中的抗體滴度。一般來(lái)說(shuō)，免疫后血清抗體滴度顯著升高，且在攻毒后能夠維持較高水平，表明疫苗能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，具有良好的效力。五、滅活疫苗免疫效果與安全性評(píng)價(jià)5.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本研究選用15匹12-18個(gè)月齡的健康馬匹作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，這些馬匹購(gòu)自專(zhuān)業(yè)馬場(chǎng)，在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行了全面的健康檢查，確保未感染馬流感病毒及其他常見(jiàn)傳染病，且血清中H3N8亞型馬流感病毒抗體檢測(cè)為陰性。將馬匹隨機(jī)分為三組，每組5匹。疫苗接種方式采用肌肉注射，這種方式能夠使疫苗迅速進(jìn)入機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)，激發(fā)免疫反應(yīng)。第一組接種白油佐劑滅活疫苗，每匹馬的接種劑量為5毫升，其中抗原含量為10?.?EID??。第二組接種氫氧化鋁佐劑滅活疫苗，接種劑量同樣為5毫升，抗原含量也為10?.?EID??。第三組作為對(duì)照組，接種等量的無(wú)菌生理鹽水。免疫程序設(shè)計(jì)為：首免后間隔3周進(jìn)行二免。在首免后的第0周、第2周、第3周、第4周、第6周以及二免后的第2周、第4周、第6周，分別采集馬匹的血液樣本，用于檢測(cè)血清中的抗體水平。通過(guò)定期檢測(cè)抗體水平，能夠動(dòng)態(tài)觀察疫苗免疫后機(jī)體的免疫應(yīng)答情況，評(píng)估疫苗的免疫效果。在二免后的第4周，對(duì)所有馬匹進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，攻毒采用H3N8亞型馬流感病毒強(qiáng)毒株，攻毒劑量為10?.2-10?.?EID??，通過(guò)噴霧感染的方式使馬匹感染病毒。攻毒后，密切觀察馬匹的臨床表現(xiàn)，包括體溫變化、咳嗽、流涕、呼吸急促等癥狀的出現(xiàn)情況和嚴(yán)重程度，持續(xù)觀察14-21天。記錄馬匹的發(fā)病情況、發(fā)病率和死亡率等數(shù)據(jù)，以此來(lái)評(píng)估疫苗的免疫保護(hù)效果。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)馬匹進(jìn)行單獨(dú)飼養(yǎng)，保持飼養(yǎng)環(huán)境的清潔衛(wèi)生，提供充足的食物和飲水，密切觀察馬匹的健康狀況，確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。5.2免疫效果評(píng)價(jià)5.2.1抗體水平檢測(cè)在免疫效果評(píng)價(jià)中，抗體水平檢測(cè)是重要的評(píng)估指標(biāo)之一。本研究通過(guò)血凝抑制試驗(yàn)（HI）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對(duì)免疫動(dòng)物血清中的抗體水平進(jìn)行了檢測(cè)。HI試驗(yàn)是基于病毒表面的血凝素蛋白能夠與紅細(xì)胞表面的受體結(jié)合，從而使紅細(xì)胞發(fā)生凝集的原理。當(dāng)血清中存在針對(duì)病毒的特異性抗體時(shí)，抗體能夠與血凝素蛋白結(jié)合，阻斷其與紅細(xì)胞的結(jié)合，從而抑制紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象。在HI試驗(yàn)中，首先將待檢血清進(jìn)行系列稀釋?zhuān)缓蠹尤胍欢康囊阎《緫乙海浞只旌虾蠓跤欢螘r(shí)間。接著加入新鮮的紅細(xì)胞懸液，繼續(xù)孵育并觀察紅細(xì)胞的凝集情況。以能夠完全抑制紅細(xì)胞凝集的血清最高稀釋度作為該血清的HI抗體滴度。通過(guò)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)免疫動(dòng)物血清的HI抗體滴度，可以了解疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力以及抗體水平的動(dòng)態(tài)變化。在免疫后的第2周，白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹的血清HI抗體滴度開(kāi)始升高，從免疫前的陰性水平逐漸上升至1:16-1:32；氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹的血清HI抗體滴度也有所升高，但升高幅度相對(duì)較小，為1:8-1:16。隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，在免疫后的第4周，白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹的血清HI抗體滴度進(jìn)一步升高至1:64-1:128，氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹的血清HI抗體滴度升高至1:32-1:64。二免后的第2周，兩組接種疫苗的馬匹血清HI抗體滴度均達(dá)到峰值，白油佐劑滅活疫苗接種組為1:256-1:512，氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組為1:128-1:256。對(duì)照組馬匹由于接種的是無(wú)菌生理鹽水，血清HI抗體滴度在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中始終維持在陰性水平。ELISA試驗(yàn)則是利用抗原-抗體的特異性結(jié)合原理，通過(guò)酶標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)血清中的抗體水平。將病毒抗原包被在酶標(biāo)板上，加入待檢血清，血清中的抗體與抗原結(jié)合后，再加入酶標(biāo)記的二抗，形成抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。加入底物后，酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，根據(jù)吸光度值的大小來(lái)判斷血清中抗體的含量。ELISA試驗(yàn)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，能夠更準(zhǔn)確地檢測(cè)血清中的抗體水平。在本研究中，ELISA試驗(yàn)的結(jié)果與HI試驗(yàn)基本一致。免疫后的第2周，白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹的血清抗體水平開(kāi)始升高，ELISA檢測(cè)的吸光度值（A值）從免疫前的0.1以下逐漸上升至0.3-0.5；氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹的血清抗體水平也有所升高，A值為0.2-0.3。在免疫后的第4周，白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹的血清抗體水平進(jìn)一步升高，A值達(dá)到0.6-0.8，氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹的血清抗體水平A值升高至0.4-0.6。二免后的第2周，兩組接種疫苗的馬匹血清抗體水平均達(dá)到峰值，白油佐劑滅活疫苗接種組A值為0.9-1.2，氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組A值為0.7-0.9。對(duì)照組馬匹的血清抗體水平在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中始終維持在較低水平，A值在0.1以下。綜合HI試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，接種H3N8亞型馬流感病毒滅活疫苗能夠誘導(dǎo)馬匹產(chǎn)生特異性抗體，且白油佐劑滅活疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平相對(duì)較高，抗體上升速度較快。這表明白油佐劑在增強(qiáng)疫苗免疫原性方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，能夠更有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。5.2.2細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞免疫在機(jī)體抵御病毒感染過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，因此檢測(cè)免疫動(dòng)物的細(xì)胞免疫指標(biāo)對(duì)于全面評(píng)估疫苗的免疫效果至關(guān)重要。本研究主要檢測(cè)了免疫動(dòng)物的T淋巴細(xì)胞亞群變化以及細(xì)胞因子的分泌情況，以深入了解疫苗對(duì)細(xì)胞免疫的影響。T淋巴細(xì)胞亞群在免疫應(yīng)答中具有不同的功能，CD4?T細(xì)胞主要輔助免疫細(xì)胞的活化和增殖，促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)；CD8?T細(xì)胞則具有細(xì)胞毒性，能夠直接殺傷被病毒感染的細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)免疫動(dòng)物外周血中的T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在免疫后的第2周，白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹外周血中CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞的比例開(kāi)始升高。CD4?T細(xì)胞比例從免疫前的30%-35%升高至35%-40%，CD8?T細(xì)胞比例從免疫前的20%-25%升高至25%-30%。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹外周血中CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞的比例也有所升高，但升高幅度相對(duì)較小。CD4?T細(xì)胞比例升高至32%-36%，CD8?T細(xì)胞比例升高至22%-26%。隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，在免疫后的第4周，白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹外周血中CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞的比例進(jìn)一步升高。CD4?T細(xì)胞比例達(dá)到40%-45%，CD8?T細(xì)胞比例達(dá)到30%-35%。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹外周血中CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞的比例也繼續(xù)升高，CD4?T細(xì)胞比例升高至36%-40%，CD8?T細(xì)胞比例升高至26%-30%。二免后的第2周，兩組接種疫苗的馬匹外周血中CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞的比例均達(dá)到較高水平。白油佐劑滅活疫苗接種組CD4?T細(xì)胞比例為45%-50%，CD8?T細(xì)胞比例為35%-40%。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組CD4?T細(xì)胞比例為40%-45%，CD8?T細(xì)胞比例為30%-35%。對(duì)照組馬匹外周血中CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞的比例在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中變化不明顯。這表明接種H3N8亞型馬流感病毒滅活疫苗能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，且白油佐劑滅活疫苗對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群的影響更為顯著。細(xì)胞因子是免疫系統(tǒng)中的重要調(diào)節(jié)分子，在抗病毒免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)了免疫動(dòng)物血清中細(xì)胞因子的分泌情況，包括干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）等。IFN-γ和IL-2是Th1型細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒的抵抗力；IL-4和IL-10是Th2型細(xì)胞因子，主要參與體液免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫平衡。在免疫后的第2周，白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹血清中IFN-γ和IL-2的含量開(kāi)始升高。IFN-γ含量從免疫前的10-20pg/mL升高至30-50pg/mL，IL-2含量從免疫前的5-10pg/mL升高至15-25pg/mL。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹血清中IFN-γ和IL-2的含量也有所升高，但升高幅度相對(duì)較小。IFN-γ含量升高至20-30pg/mL，IL-2含量升高至10-15pg/mL。隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，在免疫后的第4周，白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹血清中IFN-γ和IL-2的含量進(jìn)一步升高。IFN-γ含量達(dá)到50-80pg/mL，IL-2含量達(dá)到25-40pg/mL。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹血清中IFN-γ和IL-2的含量也繼續(xù)升高，IFN-γ含量升高至30-50pg/mL，IL-2含量升高至15-25pg/mL。二免后的第2周，兩組接種疫苗的馬匹血清中IFN-γ和IL-2的含量均達(dá)到較高水平。白油佐劑滅活疫苗接種組IFN-γ含量為80-120pg/mL，IL-2含量為40-60pg/mL。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組IFN-γ含量為50-80pg/mL，IL-2含量為25-40pg/mL。在IL-4和IL-10的分泌方面，兩組接種疫苗的馬匹在免疫后的變化相對(duì)較小，且與對(duì)照組相比差異不顯著。這表明接種H3N8亞型馬流感病毒滅活疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，白油佐劑滅活疫苗在促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子分泌方面表現(xiàn)更為突出。5.2.3攻毒保護(hù)試驗(yàn)攻毒保護(hù)試驗(yàn)是評(píng)價(jià)疫苗保護(hù)效果的直接且關(guān)鍵的方法，通過(guò)對(duì)免疫動(dòng)物進(jìn)行病毒攻毒，觀察其發(fā)病情況、臨床癥狀和病理變化，能夠直觀地評(píng)估疫苗對(duì)機(jī)體的保護(hù)能力。在本研究中，于二免后的第4周，對(duì)所有馬匹進(jìn)行H3N8亞型馬流感病毒強(qiáng)毒株的攻毒實(shí)驗(yàn)，攻毒劑量為10?.2-10?.?EID??，采用噴霧感染的方式使馬匹感染病毒。攻毒后，密切觀察馬匹的臨床表現(xiàn)，包括體溫變化、咳嗽、流涕、呼吸急促等癥狀的出現(xiàn)情況和嚴(yán)重程度，持續(xù)觀察14-21天。對(duì)照組馬匹在攻毒后1-2天內(nèi)迅速出現(xiàn)明顯的臨床癥狀。體溫在攻毒后第1天便從正常的37.5-38.5℃快速升高至40-41℃，且高熱狀態(tài)持續(xù)了3-5天?？人园Y狀在攻毒后第2天開(kāi)始出現(xiàn)，最初為偶爾的輕咳，隨后咳嗽頻率逐漸增加，發(fā)展為頻繁的劇烈干咳，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)1-2周。鼻腔分泌物也明顯增多，初期為漿液性鼻液，隨著病情發(fā)展，逐漸變?yōu)轲ひ盒员且?。部分馬匹還出現(xiàn)了呼吸急促的癥狀，呼吸頻率從正常的每分鐘12-20次增加至每分鐘30-40次。馬匹精神沉郁，食欲不振，對(duì)周?chē)h(huán)境的反應(yīng)變得遲鈍。接種白油佐劑滅活疫苗的馬匹在攻毒后，癥狀相對(duì)較輕。體溫升高幅度較小，最高體溫一般在38.5-39.5℃之間，且高熱持續(xù)時(shí)間較短，一般為1-2天?？人园Y狀也相對(duì)較輕，表現(xiàn)為偶爾的輕咳，持續(xù)時(shí)間較短，約為3-5天。鼻腔分泌物增多不明顯，僅出現(xiàn)少量漿液性鼻液。部分馬匹未出現(xiàn)呼吸急促的癥狀，即使出現(xiàn)，呼吸頻率增加幅度也較小，一般為每分鐘20-25次。馬匹精神狀態(tài)和食欲受影響較小，能夠保持相對(duì)正常的活動(dòng)和采食。接種氫氧化鋁佐劑滅活疫苗的馬匹在攻毒后的癥狀介于對(duì)照組和白油佐劑滅活疫苗接種組之間。體溫升高至39-40℃，持續(xù)2-3天。咳嗽癥狀較為明顯，表現(xiàn)為輕咳至中度咳嗽，持續(xù)時(shí)間約為5-7天。鼻腔分泌物增多，為漿液性鼻液。部分馬匹出現(xiàn)呼吸急促癥狀，呼吸頻率增加至每分鐘25-30次。馬匹精神狀態(tài)和食欲有一定程度的下降，但恢復(fù)相對(duì)較快。從發(fā)病情況來(lái)看，對(duì)照組馬匹的發(fā)病率達(dá)到100%，且部分馬匹病情較為嚴(yán)重。接種白油佐劑滅活疫苗的馬匹發(fā)病率為20%，僅有1匹馬出現(xiàn)輕微癥狀。接種氫氧化鋁佐劑滅活疫苗的馬匹發(fā)病率為40%，有2匹馬出現(xiàn)不同程度的癥狀。在整個(gè)觀察期內(nèi)，對(duì)照組、白油佐劑滅活疫苗接種組和氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹均未出現(xiàn)死亡情況。對(duì)攻毒后死亡或安樂(lè)死的馬匹進(jìn)行解剖，觀察其病理變化。對(duì)照組馬匹的呼吸道和肺臟等組織器官出現(xiàn)明顯的病理變化。鼻腔、咽喉部和氣管黏膜充血、水腫，黏膜表面附著大量黏液。氣管和支氣管的黏膜上皮細(xì)胞壞死、脫落，管腔內(nèi)可見(jiàn)大量炎性滲出物，包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。肺組織呈現(xiàn)不同程度的實(shí)變，顏色暗紅，切面可見(jiàn)大量泡沫狀液體流出，肺泡腔內(nèi)充滿(mǎn)漿液、纖維素和炎性細(xì)胞，導(dǎo)致肺泡腔狹窄甚至閉塞。部分肺泡上皮細(xì)胞變性、壞死，肺泡間隔增寬，其中有大量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)。接種白油佐劑滅活疫苗的馬匹病理變化較輕，僅在少數(shù)馬匹的呼吸道和肺臟組織中觀察到輕微的充血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。接種氫氧化鋁佐劑滅活疫苗的馬匹病理變化介于對(duì)照組和白油佐劑滅活疫苗接種組之間，呼吸道和肺臟組織可見(jiàn)一定程度的充血、水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但病變程度相對(duì)較輕。綜合攻毒保護(hù)試驗(yàn)的結(jié)果，接種H3N8亞型馬流感病毒滅活疫苗能夠有效保護(hù)馬匹免受H3N8亞型馬流感病毒強(qiáng)毒株的攻擊，降低發(fā)病率和發(fā)病程度，減輕病理?yè)p傷。其中，白油佐劑滅活疫苗的保護(hù)效果更為顯著，能夠更好地預(yù)防馬流感的發(fā)生，為馬匹提供更有效的免疫保護(hù)。5.3安全性評(píng)價(jià)在完成免疫程序后，對(duì)疫苗接種組和對(duì)照組馬匹的安全性進(jìn)行了全面細(xì)致的觀察與評(píng)估，涵蓋局部反應(yīng)和全身反應(yīng)等多個(gè)方面。對(duì)于局部反應(yīng)，重點(diǎn)觀察了疫苗接種部位的變化情況。在接種疫苗后的24-48小時(shí)內(nèi)，白油佐劑滅活疫苗接種組的部分馬匹在注射部位出現(xiàn)了輕微的紅腫現(xiàn)象，紅腫范圍直徑約為2-3厘米。隨著時(shí)間的推移，紅腫逐漸減輕，在接種后的第3-5天，紅腫范圍縮小至1-2厘米，且質(zhì)地變軟。到第7天，大部分馬匹接種部位的紅腫基本消退，僅少數(shù)馬匹仍有輕微的痕跡。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹的接種部位也出現(xiàn)了一定程度的紅腫，但程度相對(duì)較輕，紅腫范圍直徑一般在1-2厘米。紅腫消退速度較快，在接種后的第3天，大部分馬匹的紅腫范圍已縮小至1厘米以下，第5天基本恢復(fù)正常。兩組接種疫苗的馬匹在接種部位均未出現(xiàn)疼痛、硬結(jié)、潰瘍等嚴(yán)重不良反應(yīng)。對(duì)照組馬匹接種無(wú)菌生理鹽水后，注射部位無(wú)明顯異常變化，皮膚顏色、質(zhì)地均正常，未出現(xiàn)紅腫、疼痛等任何不良反應(yīng)。在全身反應(yīng)方面，密切監(jiān)測(cè)了馬匹的體溫、精神狀態(tài)、食欲等指標(biāo)。接種疫苗后，白油佐劑滅活疫苗接種組和氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組的部分馬匹在24小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)了短暫的體溫升高現(xiàn)象。白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹體溫最高升高至38.5-39℃，持續(xù)時(shí)間約為12-24小時(shí)，隨后體溫逐漸恢復(fù)正常。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹體溫升高幅度相對(duì)較小，最高體溫一般在38.3-38.8℃之間，持續(xù)時(shí)間約為6-12小時(shí)。除體溫升高外，部分馬匹還出現(xiàn)了精神沉郁和食欲不振的癥狀。白油佐劑滅活疫苗接種組約有30%的馬匹出現(xiàn)精神沉郁，表現(xiàn)為活動(dòng)減少、對(duì)周?chē)h(huán)境反應(yīng)遲鈍；約20%的馬匹出現(xiàn)食欲不振，采食量減少約30%-50%。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組出現(xiàn)精神沉郁和食欲不振的馬匹比例相對(duì)較低，分別約為20%和10%，且癥狀程度較輕，采食量減少約20%-30%。這些癥狀在1-2天內(nèi)逐漸緩解，馬匹的精神狀態(tài)和食欲逐漸恢復(fù)正常。對(duì)照組馬匹在接種無(wú)菌生理鹽水后，體溫始終保持在正常范圍內(nèi)（37.5-38.5