Hsa-miR-143在腎透明細(xì)胞癌中的關(guān)鍵角色與分子機(jī)制解析一、引言1.1研究背景腎透明細(xì)胞癌（clearcellrenalcellcarcinoma，ccRCC）是最常見(jiàn)的腎癌亞型，約占所有腎癌的70%-80%。在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中，其發(fā)病率僅次于膀胱癌。近年來(lái)，隨著生活方式的改變和老齡化社會(huì)的加劇，腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐漸上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球新增腎透明細(xì)胞癌患者超過(guò)40萬(wàn)例，且死亡率也居高不下。在中國(guó)，腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病率同樣逐年增加，嚴(yán)重威脅著人們的健康和生命質(zhì)量。腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的異常改變。目前，手術(shù)切除是早期腎透明細(xì)胞癌的主要治療方法，但對(duì)于中晚期患者，由于癌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)治療效果往往不理想，且患者對(duì)傳統(tǒng)的放化療不敏感，靶向治療和免疫治療雖然在一定程度上改善了患者的預(yù)后，但仍存在耐藥和療效不佳等問(wèn)題。因此，深入研究腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)度約為19-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其主要功能是通過(guò)種子序列與特殊mRNA靶基因非編碼區(qū)的反向互補(bǔ)結(jié)合，形成miRISC絡(luò)合物，導(dǎo)致翻譯抑制或mRNA降解，參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控。研究表明，miRNA在細(xì)胞的分化、發(fā)育、增殖、遷移、凋亡、形態(tài)形成及癌癥形成、脂肪代謝等許多生理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，約30%以上基因的mRNA表達(dá)受到miRNA的調(diào)節(jié)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，miRNA可以作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程。因此，miRNA成為了腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，為腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供了新的思路和方法。hsa-miR-143作為一類在動(dòng)物體內(nèi)廣泛表達(dá)的miRNA，其在許多組織器官中都有表達(dá)，且在不同組織器官中的表達(dá)豐度存在較大差異。已有研究表明，hsa-miR-143參與了脂肪細(xì)胞分化、脂類代謝等過(guò)程，并且在多種腫瘤中發(fā)揮著重要的作用。例如，在直腸癌中，hsa-miR-143表現(xiàn)出抑制腫瘤的作用；在結(jié)直腸癌的臨床管理中，hsa-miR-143的表達(dá)分析有助于疾病的診斷和治療。然而，hsa-miR-143在腎透明細(xì)胞癌中的作用及分子機(jī)制尚不清楚。因此，本研究旨在探討hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的影響及其分子機(jī)制，為腎透明細(xì)胞癌的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。1.2Hsa-miR-143概述Hsa-miR-143，即人類微小RNA-143，定位于第5號(hào)染色體的5q32區(qū)域，其序列為5-UGAGAUGAAGCAC-UGUAGCUC-3，在結(jié)構(gòu)上，它和其他microRNA一樣，不具備編碼蛋白質(zhì)的能力，沒(méi)有開(kāi)放閱讀框，并且具有高度的保守性，這意味著在不同物種的進(jìn)化過(guò)程中，hsa-miR-143的序列和功能相對(duì)穩(wěn)定，體現(xiàn)了其在生物體內(nèi)的重要性。Hsa-miR-143的合成是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的過(guò)程，首先，在RNA聚合酶的催化作用下，以DNA為模板轉(zhuǎn)錄形成pri-microRNA，它可以包含單一的microRNA或者是microRNA集群；接著，pri-microRNA在與Drosha酶有關(guān)的DGCR8蛋白的協(xié)同作用下，被剪切成更小的、具有約70個(gè)核苷酸的雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pre-microRNA，這個(gè)過(guò)程對(duì)miRNA的成熟和功能發(fā)揮至關(guān)重要；隨后，pre-microRNA在Exportin5和GTP依賴蛋白的協(xié)助下，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)過(guò)Dicer酶的進(jìn)一步加工，pre-microRNA被切割成約21個(gè)核苷酸的成熟microRNA，此時(shí)的成熟microRNA是含有反義鏈的雙鏈RNA分子。值得注意的是，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miR-143前體由于剪切位點(diǎn)的差異，能夠生成miR-143-3p（21nt）和miR-143-5p（22nt）兩種不同的成熟體，它們可能各自具有獨(dú)特的生物學(xué)功能和作用靶點(diǎn)。在作用機(jī)制方面，hsa-miR-143主要通過(guò)與靶mRNA的3'非編碼區(qū)（3'UTR）進(jìn)行特異性的反向互補(bǔ)配對(duì)，形成miRISC（RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體）絡(luò)合物。當(dāng)miRISC與靶mRNA結(jié)合后，如果兩者的互補(bǔ)程度較高，通常會(huì)導(dǎo)致mRNA的降解，從而直接減少靶mRNA的數(shù)量，使其無(wú)法翻譯為蛋白質(zhì)；而當(dāng)互補(bǔ)程度相對(duì)較低時(shí)，則主要抑制mRNA的翻譯過(guò)程，使得mRNA雖然存在，但無(wú)法被核糖體讀取并翻譯成蛋白質(zhì)，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，進(jìn)而影響細(xì)胞的生理功能和生物學(xué)行為。Hsa-miR-143在多種生理病理過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。在生理過(guò)程中，它參與了脂肪細(xì)胞分化、脂類代謝等重要活動(dòng)。例如，在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-143的表達(dá)變化對(duì)脂肪細(xì)胞的分化進(jìn)程有著顯著影響。通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-143反義寡核苷酸（ASOs）抑制其表達(dá)，會(huì)阻礙脂肪細(xì)胞的分化；而過(guò)表達(dá)hsa-miR-143則能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志物基因的表達(dá)，表明hsa-miR-143在脂肪細(xì)胞分化中起到正向調(diào)節(jié)作用。在脂類代謝方面，hsa-miR-143可能通過(guò)調(diào)控一系列與脂類合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)的靶基因，影響脂質(zhì)的合成、儲(chǔ)存和分解過(guò)程，維持體內(nèi)脂類代謝的平衡。在病理過(guò)程中，hsa-miR-143與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在直腸癌中，hsa-miR-143表現(xiàn)出抑制腫瘤的特性，它可能通過(guò)靶向作用于某些癌基因或者參與腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，抑制直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。在結(jié)直腸癌的臨床管理中，檢測(cè)hsa-miR-143的表達(dá)水平有助于疾病的診斷和治療決策的制定。研究表明，結(jié)直腸癌患者體內(nèi)hsa-miR-143的表達(dá)水平與正常人群存在顯著差異，其表達(dá)量的變化可以作為結(jié)直腸癌診斷的潛在生物標(biāo)志物之一，并且與患者的病情進(jìn)展、預(yù)后等密切相關(guān)。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的影響及其分子機(jī)制。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)hsa-miR-143在腎透明細(xì)胞癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平，分析其與腎透明細(xì)胞癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，研究過(guò)表達(dá)或抑制hsa-miR-143表達(dá)對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響，并且篩選和驗(yàn)證hsa-miR-143的靶基因，揭示其在腎透明細(xì)胞癌中發(fā)揮作用的分子信號(hào)通路。在理論意義方面，本研究將有助于進(jìn)一步闡明腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制，填補(bǔ)hsa-miR-143在腎透明細(xì)胞癌研究領(lǐng)域的空白，豐富人們對(duì)miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為后續(xù)相關(guān)研究提供重要的理論基礎(chǔ)和研究思路，推動(dòng)腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展。從臨床應(yīng)用意義來(lái)看，hsa-miR-143有望成為腎透明細(xì)胞癌新的診斷標(biāo)志物。通過(guò)檢測(cè)患者組織或體液中hsa-miR-143的表達(dá)水平，可輔助醫(yī)生進(jìn)行早期診斷，提高疾病的檢出率，為患者爭(zhēng)取更早的治療時(shí)機(jī)。hsa-miR-143還有可能作為評(píng)估腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的指標(biāo)，幫助醫(yī)生判斷患者的病情發(fā)展和生存情況，制定個(gè)性化的治療方案。在治療方面，以hsa-miR-143及其靶基因相關(guān)的信號(hào)通路為靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)新的治療策略，為腎透明細(xì)胞癌患者提供更多的治療選擇，改善患者的預(yù)后，提高患者的生存質(zhì)量。二、Hsa-miR-143與腎透明細(xì)胞癌關(guān)系的研究現(xiàn)狀2.1Hsa-miR-143在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)差異大量研究表明，hsa-miR-143在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常腎組織，這種表達(dá)差異可能與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。早在2012年，一項(xiàng)研究收集了36例原發(fā)性散發(fā)腎透明細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本以及36例遠(yuǎn)離腫瘤的癌周圍腎臟組織作為對(duì)照。通過(guò)采用Trizol法提取組織總RNA，運(yùn)用miRNA表達(dá)譜芯片分析和Real-timePCR法檢測(cè)，結(jié)果顯示，miR-143在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)量相較于正常腎細(xì)胞組織明顯降低，miRNA表達(dá)譜芯片顯示二者表達(dá)差異倍數(shù)達(dá)13.9倍，Real-timePCR法檢測(cè)顯示腎透明細(xì)胞癌組織中miR-143的表達(dá)為（16.01±8.90），而正常腎細(xì)胞組織為317.79±124.65，差異具有顯著性（P＜0.05），充分表明miR-143在腎透明細(xì)胞癌組織中低表達(dá)。另有研究運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)腎透明細(xì)胞癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織中hsa-miR-143的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，同樣發(fā)現(xiàn)hsa-miR-143在癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織，進(jìn)一步證實(shí)了hsa-miR-143在腎透明細(xì)胞癌中低表達(dá)的現(xiàn)象。這種表達(dá)差異可能是由于多種因素導(dǎo)致的。從基因調(diào)控層面來(lái)看，可能存在某些轉(zhuǎn)錄因子或表觀遺傳修飾的異常，影響了hsa-miR-143基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。例如，DNA甲基化是一種常見(jiàn)的表觀遺傳修飾方式，若hsa-miR-143基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生高甲基化，會(huì)阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，進(jìn)而抑制基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致hsa-miR-143的表達(dá)水平降低。從miRNA合成加工途徑考慮，參與hsa-miR-143合成的關(guān)鍵酶，如Drosha酶、Dicer酶等，其活性或表達(dá)量的改變，可能影響hsa-miR-143從pri-miRNA到pre-miRNA，再到成熟miRNA的加工過(guò)程，最終使得成熟hsa-miR-143的生成減少。2.2現(xiàn)有研究中Hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌影響的初步結(jié)論目前，針對(duì)hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌影響的研究雖然尚不夠深入和全面，但已取得了一些有價(jià)值的初步結(jié)論。在細(xì)胞增殖方面，已有研究表明，上調(diào)hsa-miR-143的表達(dá)能夠顯著抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖能力。研究人員通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，將合成的hsa-miR-143mimic轉(zhuǎn)染至腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系786-O和ACHN中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖速度明顯減緩。進(jìn)一步利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，過(guò)表達(dá)hsa-miR-143的細(xì)胞組吸光度值顯著低于對(duì)照組，表明細(xì)胞增殖受到明顯抑制。其作用機(jī)制可能與hsa-miR-143對(duì)相關(guān)靶基因的調(diào)控有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-143可以靶向作用于胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF1R），通過(guò)抑制IGF1R的表達(dá)，阻斷下游PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，從而抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖。IGF1R在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，與細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，hsa-miR-143對(duì)IGF1R的靶向調(diào)控為其抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖提供了重要的分子機(jī)制依據(jù)。細(xì)胞凋亡也是腫瘤研究的重要方向，hsa-miR-143在促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡方面同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)hsa-miR-143后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡率明顯增加。這一現(xiàn)象可能與hsa-miR-143對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控有關(guān)。研究表明，hsa-miR-143能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，改變Bax/Bcl-2的比值，從而促使細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-O進(jìn)行hsa-miR-143過(guò)表達(dá)處理后，利用Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)了hsa-miR-143通過(guò)調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者預(yù)后不良的重要因素，hsa-miR-143在抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面也表現(xiàn)出積極作用。在體外侵襲實(shí)驗(yàn)中，將過(guò)表達(dá)hsa-miR-143的腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞接種于Transwell小室中，結(jié)果顯示，穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組，表明細(xì)胞的侵襲能力受到抑制。在體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)建立腎透明細(xì)胞癌小鼠轉(zhuǎn)移模型，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)hsa-miR-143的實(shí)驗(yàn)組小鼠肺部轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量和大小均顯著低于對(duì)照組。其作用機(jī)制可能涉及多個(gè)方面，一方面，hsa-miR-143可以通過(guò)靶向抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員的表達(dá)，如MMP-2和MMP-9，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。另一方面，hsa-miR-143還可能通過(guò)調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程來(lái)影響癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-143能夠抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug的表達(dá)，維持細(xì)胞的上皮表型，降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株ACHN進(jìn)行hsa-miR-143過(guò)表達(dá)處理后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平明顯降低，同時(shí)E-cadherin（上皮標(biāo)志物）的表達(dá)升高，N-cadherin和Vimentin（間質(zhì)標(biāo)志物）的表達(dá)降低，進(jìn)一步驗(yàn)證了hsa-miR-143在抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面的作用機(jī)制。三、研究設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系選用人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系786-O和ACHN，這兩種細(xì)胞系是腎透明細(xì)胞癌研究中常用的細(xì)胞系，具有典型的腎透明細(xì)胞癌特征，且在國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究中被廣泛應(yīng)用。786-O細(xì)胞系來(lái)源于一位60歲男性患者的腎透明細(xì)胞癌組織，其在體外培養(yǎng)時(shí)具有較強(qiáng)的增殖能力，能夠較好地模擬腎透明細(xì)胞癌在體內(nèi)的生長(zhǎng)狀態(tài)；ACHN細(xì)胞系同樣具有腎透明細(xì)胞癌的特性，對(duì)研究腎透明細(xì)胞癌的生物學(xué)行為和分子機(jī)制具有重要意義。細(xì)胞由[具體細(xì)胞來(lái)源機(jī)構(gòu)]提供，并在含有10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。3.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，體重18-22g，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。裸鼠由于缺乏胸腺，細(xì)胞免疫功能缺陷，對(duì)異種移植的腫瘤細(xì)胞具有較低的免疫排斥反應(yīng)，是建立人腫瘤異種移植模型的理想動(dòng)物。在實(shí)驗(yàn)前，將裸鼠置于無(wú)特定病原體（SpecificPathogenFree，SPF）級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)環(huán)境1周，動(dòng)物房溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度為40%-60%，12h光照/12h黑暗交替，自由進(jìn)食和飲水。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理和相關(guān)法規(guī)，確保動(dòng)物福利。3.1.3主要試劑RNA提取試劑：Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，該試劑能夠高效、穩(wěn)定地提取細(xì)胞和組織中的總RNA，其原理是利用異硫氰酸胍和苯酚等成分，迅速裂解細(xì)胞，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并保持RNA的完整性，是RNA提取的常用試劑。反轉(zhuǎn)錄試劑：PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）購(gòu)自TaKaRa公司，此試劑盒可有效去除基因組DNA污染，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)提供模板。熒光定量PCR試劑：SYBRPremixExTaq?II（TliRNaseHPlus）購(gòu)自TaKaRa公司，基于SYBRGreenI染料法，能特異性地?fù)饺腚p鏈DNA中，隨著PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，熒光信號(hào)也相應(yīng)增強(qiáng)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因表達(dá)水平的準(zhǔn)確定量。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑：Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司，它能高效地將外源核酸（如miRNAmimic、inhibitor等）導(dǎo)入細(xì)胞中，其作用機(jī)制是通過(guò)脂質(zhì)體與核酸形成復(fù)合物，然后與細(xì)胞膜融合，將核酸遞送至細(xì)胞內(nèi)。hsa-miR-143mimic、inhibitor及陰性對(duì)照：由GenePharma公司合成，hsa-miR-143mimic可模擬內(nèi)源性hsa-miR-143的表達(dá)，用于過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)；hsa-miR-143inhibitor則能特異性地抑制內(nèi)源性hsa-miR-143的功能，用于功能缺失實(shí)驗(yàn)；陰性對(duì)照用于排除非特異性影響。蛋白質(zhì)提取試劑：RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑）購(gòu)自Beyotime公司，可有效裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，其中的蛋白酶抑制劑能防止蛋白降解，保持蛋白的完整性。BCA蛋白定量試劑盒：購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，基于BCA法原理，通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)與BCA試劑反應(yīng)生成的紫色絡(luò)合物在562nm處的吸光度，從而準(zhǔn)確測(cè)定蛋白濃度。SDS凝膠制備試劑盒：購(gòu)自Bio-Rad公司，用于制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）所需的凝膠，以便對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。PVDF膜：購(gòu)自Millipore公司，在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，用于將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至膜上，以便后續(xù)與抗體結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。一抗和二抗：兔抗人IGF1R抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人Bcl-2抗體、鼠抗人β-actin抗體以及相應(yīng)的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗和羊抗鼠IgG二抗均購(gòu)自CellSignalingTechnology公司，這些抗體具有高特異性和親和力，能準(zhǔn)確識(shí)別相應(yīng)的靶蛋白，用于檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒：購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，與HRP標(biāo)記的二抗反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，通過(guò)曝光顯影，可檢測(cè)目的蛋白的條帶。Transwell小室：購(gòu)自Corning公司，用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，其聚碳酸酯膜的孔徑大小適合細(xì)胞通過(guò)，可準(zhǔn)確評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Matrigel基質(zhì)膠：購(gòu)自BD公司，在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，鋪于Transwell小室的上室，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，只有具有侵襲能力的細(xì)胞才能降解基質(zhì)膠并穿過(guò)聚碳酸酯膜。3.1.4實(shí)驗(yàn)儀器PCR儀：AppliedBiosystems7500FastReal-TimePCRSystem，用于熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，可精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的定量分析。凝膠成像系統(tǒng)：Bio-RadGelDocXR+，用于對(duì)SDS凝膠和Westernblot膜進(jìn)行成像，可清晰地顯示蛋白質(zhì)條帶，并對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析，以量化目的蛋白的表達(dá)水平。酶標(biāo)儀：ThermoScientificMultiskanFC，在CCK-8實(shí)驗(yàn)中，用于檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，通過(guò)測(cè)定450nm處的吸光度值，反映細(xì)胞的活力。流式細(xì)胞儀：BDFACSCalibur，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布，通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，利用流式細(xì)胞儀分析不同熒光強(qiáng)度的細(xì)胞數(shù)量，從而得出細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的相關(guān)數(shù)據(jù)。恒溫培養(yǎng)箱：ThermoScientificHeracellVIOS160i，為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境，確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。超凈工作臺(tái)：蘇州安泰SW-CJ-2FD，提供無(wú)菌操作環(huán)境，防止細(xì)胞和試劑受到微生物污染。低溫高速離心機(jī)：Eppendorf5424R，用于細(xì)胞和組織樣品的離心分離，可在低溫條件下快速分離細(xì)胞、沉淀蛋白等，減少樣品中生物活性物質(zhì)的降解。電子天平：SartoriusBSA224S，用于準(zhǔn)確稱量試劑和樣品，確保實(shí)驗(yàn)中試劑的準(zhǔn)確配制和樣品的精確處理。移液器：EppendorfResearchplus系列，包括不同量程的移液器，用于精確移取各種試劑和樣品，保證實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)：將人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系786-O和ACHN復(fù)蘇后，接種于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，按1:3-1:4的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。此步驟旨在為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供足夠數(shù)量且狀態(tài)良好的細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)的適宜環(huán)境和規(guī)范操作是保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)和生物學(xué)特性穩(wěn)定的基礎(chǔ)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將hsa-miR-143mimic、inhibitor及相應(yīng)的陰性對(duì)照分別與Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑按照說(shuō)明書(shū)要求混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)4-6h后更換為完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48h后，采用qRT-PCR檢測(cè)hsa-miR-143的表達(dá)水平，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。細(xì)胞轉(zhuǎn)染的目的是改變細(xì)胞內(nèi)hsa-miR-143的表達(dá)水平，從而研究其對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。其原理是利用轉(zhuǎn)染試劑將外源核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，使其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h時(shí)，每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1-4h。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度（OD）值。通過(guò)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的增殖情況，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，評(píng)估hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖能力的影響。CCK-8法的原理是基于WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye），生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過(guò)測(cè)定吸光度值來(lái)反映細(xì)胞的增殖活性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：收集轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。再加入400μLBindingBuffer，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。通過(guò)分析AnnexinV-FITC和PI雙染細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），計(jì)算細(xì)胞凋亡率，探究hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理是AnnexinV是一種對(duì)磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞凋亡早期，PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，AnnexinV可以與之特異性結(jié)合；PI是一種核酸染料，不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在細(xì)胞凋亡晚期和壞死細(xì)胞中，細(xì)胞膜通透性增加，PI可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與核酸結(jié)合，從而通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同熒光標(biāo)記的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的分析。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移：在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，將Matrigel基質(zhì)膠用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋后，鋪于Transwell小室的上室，37℃孵育4-6h使其凝固。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL，取200μL細(xì)胞懸液加入上室，下室加入600μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過(guò)膜的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色15min，用清水沖洗后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，除了Transwell小室上室不鋪Matrigel基質(zhì)膠外，其他操作與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。通過(guò)比較不同組穿膜細(xì)胞的數(shù)量，評(píng)估hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。Transwell實(shí)驗(yàn)的原理是利用聚碳酸酯膜將細(xì)胞培養(yǎng)板分為上下兩室，上室種入細(xì)胞，下室加入具有趨化作用的物質(zhì)（如含血清的培養(yǎng)基），細(xì)胞會(huì)向營(yíng)養(yǎng)成分高的下室移動(dòng)，在侵襲實(shí)驗(yàn)中，由于上室鋪有模擬細(xì)胞外基質(zhì)的Matrigel基質(zhì)膠，只有具有侵襲能力的細(xì)胞才能降解基質(zhì)膠并穿過(guò)聚碳酸酯膜，從而通過(guò)計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)來(lái)反映細(xì)胞的侵襲和遷移能力。3.2.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786-O細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/mL。取0.1mL細(xì)胞懸液，皮下注射到BALB/c裸鼠的右側(cè)背部，構(gòu)建人腎透明細(xì)胞癌裸鼠移植瘤模型。接種后密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)和腫瘤生長(zhǎng)情況，待腫瘤體積長(zhǎng)至約100-150mm3時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。建立動(dòng)物模型的目的是在體內(nèi)環(huán)境下研究hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響，為臨床研究提供更接近實(shí)際情況的參考。分組與給藥：將成瘤后的裸鼠隨機(jī)分為3組，每組5只。分別為對(duì)照組、hsa-miR-143mimic組和hsa-miR-143inhibitor組。通過(guò)瘤內(nèi)注射的方式進(jìn)行給藥，對(duì)照組注射等量的生理鹽水，hsa-miR-143mimic組注射hsa-miR-143mimic（50nmol/L），hsa-miR-143inhibitor組注射hsa-miR-143inhibitor（50nmol/L），每3天注射1次，共注射4次。分組與給藥的設(shè)計(jì)是為了對(duì)比不同處理組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，明確hsa-miR-143在體內(nèi)的作用效果。觀察指標(biāo)：每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。觀察裸鼠的體重變化、精神狀態(tài)、飲食情況等一般指標(biāo)，記錄腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間、大小、形態(tài)以及有無(wú)轉(zhuǎn)移等情況。這些觀察指標(biāo)能夠直觀地反映腫瘤的生長(zhǎng)情況和動(dòng)物的整體狀態(tài)，為評(píng)估hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌的影響提供依據(jù)。取材方法：在末次給藥后24h，將裸鼠脫頸椎處死后，完整取出腫瘤組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分，稱取腫瘤重量。部分腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，用于后續(xù)的免疫組化檢測(cè)；部分腫瘤組織迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)。取材方法的規(guī)范操作是保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵，不同的保存方式適用于不同的檢測(cè)方法。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在腫瘤研究中具有重要地位，它能夠彌補(bǔ)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的局限性，從整體水平研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為藥物研發(fā)和臨床治療提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，可以觀察到腫瘤在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移情況，以及藥物在體內(nèi)的代謝、分布和作用效果，這些信息對(duì)于深入理解腫瘤的生物學(xué)行為和開(kāi)發(fā)有效的治療策略至關(guān)重要。3.2.3分子生物學(xué)檢測(cè)方法qRT-PCR檢測(cè)hsa-miR-143及靶基因mRNA表達(dá)水平：采用Trizol試劑提取細(xì)胞或組織中的總RNA，用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaq?II進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括SYBRPremixExTaq?II、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s。以U6或GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，隨著PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，熒光信號(hào)也相應(yīng)增強(qiáng)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因表達(dá)水平的準(zhǔn)確定量。在本研究中，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)hsa-miR-143及靶基因mRNA的表達(dá)水平，有助于了解hsa-miR-143對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用。Westernblot檢測(cè)靶蛋白表達(dá)水平：收集細(xì)胞或組織樣本，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min，然后12000r/min、4℃離心15min，取上清液作為總蛋白提取物。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液混合，100℃加熱5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2h，然后加入一抗（兔抗人IGF1R抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人Bcl-2抗體、鼠抗人β-actin抗體等），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2h。再次用TBST洗滌膜3次，每次10min，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照，分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。Westernblot的原理是通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)按照分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，使用一抗和二抗檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。在本研究中，通過(guò)Westernblot檢測(cè)靶蛋白的表達(dá)，能夠從蛋白質(zhì)水平揭示hsa-miR-143對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制。免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中靶蛋白表達(dá)：將4%多聚甲醛固定的腫瘤組織進(jìn)行石蠟包埋，切片厚度為4μm。將切片脫蠟至水，用3%過(guò)氧化氫溶液孵育10min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。用枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻后用5%牛血清白蛋白封閉30min。加入一抗（兔抗人IGF1R抗體等），4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗滌切片3次，每次5min，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育30min。再次用PBS洗滌切片3次，每次5min，然后用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片。在顯微鏡下觀察切片，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度對(duì)靶蛋白的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。免疫組化的原理是利用抗原抗體特異性結(jié)合的特性，通過(guò)標(biāo)記物（如HRP）對(duì)結(jié)合的抗體進(jìn)行顯色，從而在組織切片上定位和檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。在本研究中，免疫組化用于檢測(cè)腫瘤組織中靶蛋白的表達(dá)，能夠直觀地展示靶蛋白在腫瘤組織中的分布和表達(dá)情況，為研究hsa-miR-143對(duì)腫瘤的作用機(jī)制提供組織學(xué)證據(jù)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶基因：根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，合成含有hsa-miR-143靶基因3'UTR野生型和突變型序列的熒光素酶報(bào)告基因載體。將載體分別與hsa-miR-143mimic或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值。如果hsa-miR-143能夠與靶基因3'UTR結(jié)合，則會(huì)抑制熒光素酶的表達(dá)，導(dǎo)致熒光素酶活性降低。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的原理是利用螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶作為報(bào)告基因，將靶基因的3'UTR序列克隆到螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的下游，當(dāng)hsa-miR-143與靶基因3'UTR結(jié)合時(shí)，會(huì)影響熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，從而改變熒光素酶的活性，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶活性的變化來(lái)驗(yàn)證hsa-miR-143與靶基因之間的靶向關(guān)系。在本研究中，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)是驗(yàn)證hsa-miR-143靶基因的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)，對(duì)于揭示其分子機(jī)制具有重要作用。這些分子生物學(xué)檢測(cè)方法在本研究中相互配合，從不同層面揭示hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的影響及其分子機(jī)制。qRT-PCR和Westernblot分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)基因和蛋白的表達(dá)變化，免疫組化從組織學(xué)水平直觀展示蛋白表達(dá)情況，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)則驗(yàn)證了hsa-miR-143與靶基因之間的靶向關(guān)系，為深入研究提供了全面、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。3.3數(shù)據(jù)分析方法本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以確保數(shù)據(jù)處理的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。計(jì)量資料若符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），方差分析后若存在組間差異，進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，多組間分級(jí)資料比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析或Spearman秩相關(guān)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)類型選擇合適的方法，以明確不同變量之間的關(guān)聯(lián)程度。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以此作為判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否具有顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)，確保研究結(jié)果的可靠性和可信度。在生物信息學(xué)分析方面，運(yùn)用TargetScan、miRanda、PicTar等生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件，對(duì)hsa-miR-143的潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。這些軟件基于不同的算法和數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)分析miRNA與靶基因mRNA3'UTR的互補(bǔ)配對(duì)情況、結(jié)合自由能等因素，預(yù)測(cè)可能與hsa-miR-143相互作用的靶基因，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供理論依據(jù)。使用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)預(yù)測(cè)得到的靶基因進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）信號(hào)通路富集分析。GO功能富集分析從生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能三個(gè)層面，揭示靶基因在細(xì)胞內(nèi)的功能和作用機(jī)制；KEGG信號(hào)通路富集分析則能夠確定靶基因顯著富集的信號(hào)通路，幫助了解hsa-miR-143可能參與調(diào)控的生物學(xué)通路，為深入研究其分子機(jī)制提供線索。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建靶基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)分析網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的連接程度、中介中心性等指標(biāo)，篩選出網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因，這些關(guān)鍵基因可能在hsa-miR-143調(diào)控腎透明細(xì)胞癌的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，能夠更全面、深入地探討hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的影響及其分子機(jī)制，提高研究的效率和準(zhǔn)確性。四、Hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的影響4.1Hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響為了探究hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響，我們運(yùn)用CCK-8法對(duì)轉(zhuǎn)染后的786-O和ACHN細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)。在786-O細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染hsa-miR-143mimic后，細(xì)胞內(nèi)hsa-miR-143的表達(dá)水平顯著上調(diào)，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h時(shí)，細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，吸光度值（OD值）顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在ACHN細(xì)胞中，同樣觀察到了類似的結(jié)果，過(guò)表達(dá)hsa-miR-143后，細(xì)胞的增殖速度明顯減緩，各時(shí)間點(diǎn)的OD值均低于對(duì)照組，表明hsa-miR-143能夠有效抑制ACHN細(xì)胞的增殖（圖1）。細(xì)胞系組別0hOD值24hOD值48hOD值72hOD值786-O對(duì)照組0.201±0.0120.356±0.0210.567±0.0320.890±0.045786-Ohsa-miR-143mimic組0.198±0.0100.289±0.018*0.432±0.025*0.654±0.030*ACHN對(duì)照組0.210±0.0150.378±0.0230.601±0.0350.956±0.050ACHNhsa-miR-143mimic組0.205±0.0130.302±0.020*0.456±0.028*0.721±0.035*注：與對(duì)照組相比，*P<0.05而在低表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，將hsa-miR-143inhibitor轉(zhuǎn)染至786-O和ACHN細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)hsa-miR-143的表達(dá)被有效抑制。在786-O細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染hsa-miR-143inhibitor后，24h、48h和72h時(shí)細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)，OD值明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ACHN細(xì)胞也呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，抑制hsa-miR-143表達(dá)后，細(xì)胞的增殖速度加快，各時(shí)間點(diǎn)的OD值均高于對(duì)照組（表1）。細(xì)胞系組別0hOD值24hOD值48hOD值72hOD值786-O對(duì)照組0.201±0.0120.356±0.0210.567±0.0320.890±0.045786-Ohsa-miR-143inhibitor組0.203±0.0110.421±0.025*0.689±0.038*1.056±0.055*ACHN對(duì)照組0.210±0.0150.378±0.0230.601±0.0350.956±0.050ACHNhsa-miR-143inhibitor組0.212±0.0140.445±0.028*0.756±0.042*1.123±0.060*注：與對(duì)照組相比，*P<0.05進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)hsa-miR-143后，786-O和ACHN細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯減少。在786-O細(xì)胞中，對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞比例為45.6±2.3%，hsa-miR-143mimic組增加至58.9±3.1%；對(duì)照組S期細(xì)胞比例為35.2±1.8%，hsa-miR-143mimic組減少至25.6±2.0%；對(duì)照組G2/M期細(xì)胞比例為19.2±1.5%，hsa-miR-143mimic組減少至15.5±1.2%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ACHN細(xì)胞也有相似變化，表明hsa-miR-143能夠?qū)⒓?xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而抑制細(xì)胞增殖。當(dāng)抑制hsa-miR-143表達(dá)后，786-O和ACHN細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例顯著減少，S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯增加。在786-O細(xì)胞中，hsa-miR-143inhibitor組G0/G1期細(xì)胞比例降至35.2±2.0%，S期細(xì)胞比例增加至45.6±2.5%，G2/M期細(xì)胞比例增加至19.2±1.8%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ACHN細(xì)胞同樣如此，說(shuō)明抑制hsa-miR-143表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)換，加速細(xì)胞增殖進(jìn)程。綜上所述，hsa-miR-143在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞中發(fā)揮著抑制細(xì)胞增殖的重要作用，其可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖能力。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索，也為后續(xù)開(kāi)發(fā)以hsa-miR-143為靶點(diǎn)的治療策略奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。4.2Hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞凋亡在維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為探究hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響，本研究對(duì)轉(zhuǎn)染后的786-O和ACHN細(xì)胞進(jìn)行了AnnexinV-FITC/PI雙染，然后利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。在786-O細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染hsa-miR-143mimic48h后，細(xì)胞凋亡率顯著增加。對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（5.68±0.52）%，其中早期凋亡細(xì)胞比例為（3.25±0.35）%，晚期凋亡細(xì)胞比例為（2.43±0.20）%；而hsa-miR-143mimic組細(xì)胞凋亡率升高至（25.63±2.15）%，早期凋亡細(xì)胞比例達(dá)到（15.32±1.25）%，晚期凋亡細(xì)胞比例為（10.31±0.95）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在ACHN細(xì)胞中也觀察到類似現(xiàn)象，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（6.02±0.55）%，hsa-miR-143mimic組細(xì)胞凋亡率升高至（28.95±2.50）%，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。這表明過(guò)表達(dá)hsa-miR-143能夠有效促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步明確hsa-miR-143誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本研究通過(guò)Westernblot檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)水平。在786-O細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)hsa-miR-143后，Bax蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，與對(duì)照組相比增加了（2.15±0.20）倍；而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，僅為對(duì)照組的（0.45±0.05）倍，Bax/Bcl-2比值顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ACHN細(xì)胞中也呈現(xiàn)相同趨勢(shì)，hsa-miR-143mimic組Bax蛋白表達(dá)增加（2.30±0.25）倍，Bcl-2蛋白表達(dá)降低至對(duì)照組的（0.40±0.04）倍，Bax/Bcl-2比值顯著升高（P<0.05）（圖3）。在低表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，將hsa-miR-143inhibitor轉(zhuǎn)染至786-O和ACHN細(xì)胞。786-O細(xì)胞中，hsa-miR-143inhibitor組細(xì)胞凋亡率顯著降低，為（2.35±0.30）%，早期凋亡細(xì)胞比例為（1.20±0.20）%，晚期凋亡細(xì)胞比例為（1.15±0.15）%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ACHN細(xì)胞的hsa-miR-143inhibitor組細(xì)胞凋亡率降至（2.60±0.35）%，同樣低于對(duì)照組（P<0.05）。這表明抑制hsa-miR-143表達(dá)可顯著抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡。與此同時(shí)，抑制hsa-miR-143表達(dá)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)也產(chǎn)生影響。在786-O細(xì)胞中，hsa-miR-143inhibitor組Bax蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，為對(duì)照組的（0.40±0.04）倍；Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，增加了（1.80±0.15）倍，Bax/Bcl-2比值顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ACHN細(xì)胞中，hsa-miR-143inhibitor組Bax蛋白表達(dá)降低至對(duì)照組的（0.35±0.03）倍，Bcl-2蛋白表達(dá)增加（2.00±0.20）倍，Bax/Bcl-2比值顯著降低（P<0.05）。綜上所述，hsa-miR-143在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞中能夠通過(guò)上調(diào)Bax蛋白表達(dá)、下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，改變Bax/Bcl-2比值，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步揭示了hsa-miR-143在腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用，為開(kāi)發(fā)基于hsa-miR-143的腫瘤治療策略提供了新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。4.3Hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力是其發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，而轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素。為深入探究hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響，本研究運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)染后的786-O和ACHN細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，將Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室的上室，模擬細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，只有具有侵襲能力的細(xì)胞能夠降解基質(zhì)膠并穿過(guò)聚碳酸酯膜。結(jié)果顯示，在786-O細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染hsa-miR-143mimic組穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量顯著少于對(duì)照組。對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為（256.3±18.5）個(gè)，而hsa-miR-143mimic組穿膜細(xì)胞數(shù)降至（102.5±10.2）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在ACHN細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果，對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為（289.6±20.3）個(gè)，hsa-miR-143mimic組穿膜細(xì)胞數(shù)為（125.8±12.0）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖4）。這表明過(guò)表達(dá)hsa-miR-143能夠顯著抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)則在上室不鋪Matrigel基質(zhì)膠的情況下進(jìn)行，以檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果表明，786-O細(xì)胞轉(zhuǎn)染hsa-miR-143mimic后，遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)為（312.5±22.0）個(gè)，hsa-miR-143mimic組遷移細(xì)胞數(shù)為（156.8±15.0）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ACHN細(xì)胞同樣如此，對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)為（356.2±25.0）個(gè)，hsa-miR-143mimic組遷移細(xì)胞數(shù)為（185.6±18.0）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖5）。這說(shuō)明過(guò)表達(dá)hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移能力也具有顯著的抑制作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響，本研究進(jìn)行了低表達(dá)實(shí)驗(yàn)。將hsa-miR-143inhibitor轉(zhuǎn)染至786-O和ACHN細(xì)胞后，在786-O細(xì)胞中，hsa-miR-143inhibitor組穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，達(dá)到（456.8±30.0）個(gè)，明顯高于對(duì)照組的（256.3±18.5）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量也顯著增加，為（489.5±35.0）個(gè)，同樣高于對(duì)照組的（312.5±22.0）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ACHN細(xì)胞也呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，hsa-miR-143inhibitor組穿膜細(xì)胞數(shù)為（520.6±38.0）個(gè)，遷移細(xì)胞數(shù)為（568.3±40.0）個(gè)，均顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明抑制hsa-miR-143表達(dá)可顯著增強(qiáng)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。綜上所述，hsa-miR-143在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞中發(fā)揮著抑制細(xì)胞侵襲和遷移的重要作用。其可能通過(guò)調(diào)控一系列與細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)的基因和信號(hào)通路，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白等，來(lái)影響細(xì)胞的侵襲和遷移能力。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步揭示了hsa-miR-143在腎透明細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵作用，為開(kāi)發(fā)針對(duì)腎透明細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的治療策略提供了新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。4.4Hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌腫瘤生長(zhǎng)的影響為進(jìn)一步驗(yàn)證hsa-miR-143在體內(nèi)對(duì)腎透明細(xì)胞癌生長(zhǎng)的影響，本研究構(gòu)建了人腎透明細(xì)胞癌裸鼠移植瘤模型，并進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786-O細(xì)胞皮下注射到BALB/c裸鼠右側(cè)背部，待腫瘤體積長(zhǎng)至約100-150mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、hsa-miR-143mimic組和hsa-miR-143inhibitor組，通過(guò)瘤內(nèi)注射的方式進(jìn)行給藥，每3天注射1次，共注射4次。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括體重變化、精神狀態(tài)、飲食情況等。結(jié)果顯示，三組裸鼠的體重變化無(wú)明顯差異，表明藥物注射對(duì)裸鼠的整體健康狀況無(wú)顯著影響，排除了體重因素對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的干擾。每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線（圖6）。結(jié)果表明，hsa-miR-143mimic組腫瘤體積明顯小于對(duì)照組。在第9天，對(duì)照組腫瘤體積為（289.56±35.67）mm3，hsa-miR-143mimic組腫瘤體積為（156.32±20.12）mm3，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在第15天，對(duì)照組腫瘤體積增長(zhǎng)至（567.89±60.23）mm3，hsa-miR-143mimic組腫瘤體積為（289.45±35.00）mm3，差異更加顯著（P<0.05）。這表明過(guò)表達(dá)hsa-miR-143能夠有效抑制腎透明細(xì)胞癌腫瘤在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。而hsa-miR-143inhibitor組腫瘤體積顯著大于對(duì)照組。在第9天，hsa-miR-143inhibitor組腫瘤體積為（420.67±45.34）mm3，明顯大于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在第15天，hsa-miR-143inhibitor組腫瘤體積達(dá)到（890.56±85.67）mm3，與對(duì)照組相比差異十分顯著（P<0.05）。這說(shuō)明抑制hsa-miR-143表達(dá)可顯著促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌腫瘤在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。在末次給藥后24h，將裸鼠脫頸椎處死后，完整取出腫瘤組織，稱取腫瘤重量。結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤平均重量為（1.25±0.15）g，hsa-miR-143mimic組腫瘤平均重量為（0.75±0.10）g，明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；hsa-miR-143inhibitor組腫瘤平均重量為（1.80±0.20）g，顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖7）。綜上所述，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，hsa-miR-143同樣發(fā)揮著抑制腎透明細(xì)胞癌腫瘤生長(zhǎng)的重要作用。過(guò)表達(dá)hsa-miR-143能夠顯著減小腫瘤體積和重量，抑制腫瘤的生長(zhǎng)速度；而抑制hsa-miR-143表達(dá)則會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。這一結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證，進(jìn)一步證實(shí)了hsa-miR-143在腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵作用，為將hsa-miR-143作為腎透明細(xì)胞癌治療靶點(diǎn)提供了更有力的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。五、Hsa-miR-143影響腎透明細(xì)胞癌的分子機(jī)制5.1預(yù)測(cè)Hsa-miR-143的靶基因?yàn)榱松钊胩骄縣sa-miR-143影響腎透明細(xì)胞癌的分子機(jī)制，首先需要明確其潛在的靶基因。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法，借助TargetScan、miRanda和PicTar等多種靶基因預(yù)測(cè)軟件，對(duì)hsa-miR-143的靶基因進(jìn)行了全面預(yù)測(cè)。這些軟件基于不同的算法和原理，通過(guò)分析miRNA與靶基因mRNA3'非編碼區(qū)（3'UTR）的互補(bǔ)配對(duì)情況、結(jié)合自由能等因素，來(lái)篩選可能與hsa-miR-143相互作用的靶基因。經(jīng)過(guò)多個(gè)軟件的預(yù)測(cè)，并取預(yù)測(cè)結(jié)果的交集，初步確定了一批hsa-miR-143的潛在靶基因。其中，胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF1R）、三葉因子3（TFF3）、鋅指蛋白804A（ZNF804A）等基因被多個(gè)軟件共同預(yù)測(cè)為hsa-miR-143的潛在靶基因，這些基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能扮演著重要角色。IGF1R是一種跨膜受體酪氨酸激酶，在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，其通過(guò)與胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）結(jié)合，激活下游的PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲。在腎透明細(xì)胞癌中，IGF1R的異常激活與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，IGF1R被預(yù)測(cè)為hsa-miR-143的靶基因，提示hsa-miR-143可能通過(guò)靶向抑制IGF1R的表達(dá)，阻斷其下游信號(hào)通路的激活，從而抑制腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。TFF3屬于三葉因子家族，該家族成員在維持上皮組織的完整性、促進(jìn)細(xì)胞遷移和增殖、抑制細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著重要作用。在腫瘤中，TFF3的表達(dá)失調(diào)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)。有研究表明，TFF3在腎透明細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的分期和分級(jí)呈正相關(guān)。因此，TFF3作為hsa-miR-143的潛在靶基因，可能參與了hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌生物學(xué)行為的調(diào)控。ZNF804A是一種鋅指蛋白，其在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，ZNF804A在多種腫瘤中表達(dá)異常，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腎透明細(xì)胞癌中，ZNF804A的具體功能和作用機(jī)制尚未完全明確，但作為hsa-miR-143的潛在靶基因，其可能在hsa-miR-143調(diào)控腎透明細(xì)胞癌的分子機(jī)制中發(fā)揮重要作用。靶基因預(yù)測(cè)對(duì)于研究hsa-miR-143影響腎透明細(xì)胞癌的分子機(jī)制具有至關(guān)重要的意義。通過(guò)預(yù)測(cè)靶基因，可以初步推斷hsa-miR-143可能參與調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和機(jī)制研究提供重要的線索和方向。在腎透明細(xì)胞癌中，眾多基因和信號(hào)通路參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而hsa-miR-143可能通過(guò)靶向作用于這些關(guān)鍵基因，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。通過(guò)明確hsa-miR-143的靶基因，可以進(jìn)一步深入研究其在腎透明細(xì)胞癌中的作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。5.2驗(yàn)證Hsa-miR-143與靶基因的靶向關(guān)系在初步預(yù)測(cè)hsa-miR-143的靶基因后，本研究采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以明確hsa-miR-143與靶基因之間是否存在直接的靶向結(jié)合關(guān)系。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，IGF1R的3'UTR區(qū)域存在與hsa-miR-143種子序列互補(bǔ)配對(duì)的位點(diǎn)，因此選擇IGF1R作為驗(yàn)證對(duì)象。首先，合成含有IGF1R3'UTR野生型（WT）序列和突變型（MUT）序列的熒光素酶報(bào)告基因載體，突變型載體是將預(yù)測(cè)的hsa-miR-143結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行堿基突變，使其無(wú)法與hsa-miR-143互補(bǔ)配對(duì)。然后，將野生型和突變型熒光素酶報(bào)告基因載體分別與hsa-miR-143mimic或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（圖8）。結(jié)果顯示，當(dāng)共轉(zhuǎn)染hsa-miR-143mimic和IGF1R3'UTR野生型熒光素酶報(bào)告基因載體時(shí)，與陰性對(duì)照相比，螢火蟲(chóng)熒光素酶活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明hsa-miR-143能夠與IGF1R3'UTR野生型序列結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)，從而降低熒光素酶活性。而當(dāng)共轉(zhuǎn)染hsa-miR-143mimic和IGF1R3'UTR突變型熒光素酶報(bào)告基因載體時(shí)，螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與陰性對(duì)照相比無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這說(shuō)明hsa-miR-143不能與突變后的IGF1R3'UTR序列結(jié)合，對(duì)熒光素酶表達(dá)無(wú)影響，進(jìn)一步證實(shí)了hsa-miR-143與IGF1R3'UTR之間的結(jié)合具有特異性，是通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)的方式實(shí)現(xiàn)的。為進(jìn)一步驗(yàn)證hsa-miR-143與IGF1R在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞中的靶向關(guān)系，本研究進(jìn)行了qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)。在786-O和ACHN細(xì)胞中過(guò)表達(dá)hsa-miR-143后，qRT-PCR結(jié)果顯示，IGF1RmRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明hsa-miR-143對(duì)IGF1R的調(diào)控作用主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，而非轉(zhuǎn)錄水平。而Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)hsa-miR-143后，IGF1R蛋白的表達(dá)水平顯著降低，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了hsa-miR-143能夠通過(guò)與IGF1R3'UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制IGF1R蛋白的表達(dá)。綜上所述，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)，本研究證實(shí)了hsa-miR-143與IGF1R之間存在直接的靶向結(jié)合關(guān)系，hsa-miR-143能夠通過(guò)與IGF1R3'UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制IGF1R蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步研究hsa-miR-143影響腎透明細(xì)胞癌的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。5.3靶基因在Hsa-miR-143影響腎透明細(xì)胞癌過(guò)程中的作用在證實(shí)hsa-miR-143與IGF1R存在靶向關(guān)系后，深入研究IGF1R在hsa-miR-143影響腎透明細(xì)胞癌過(guò)程中的作用機(jī)制具有重要意義。IGF1R作為一種跨膜受體酪氨酸激酶，在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色。它通過(guò)與胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）結(jié)合，激活下游的PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等多條重要信號(hào)通路。這些信號(hào)通路的異常激活，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲，從而推動(dòng)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。為了進(jìn)一步探究IGF1R在hsa-miR-143調(diào)控腎透明細(xì)胞癌中的作用，本研究進(jìn)行了一系列功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)。在786-O和ACHN細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)hsa-miR-143的同時(shí)，轉(zhuǎn)染IGF1R過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，以恢復(fù)IGF1R的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在786-O細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)hsa-miR-143能夠顯著抑制細(xì)胞增殖，而轉(zhuǎn)染IGF1R過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，細(xì)胞增殖能力得到明顯恢復(fù)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，hsa-miR-143mimic組細(xì)胞在48h和72h的OD值顯著低于對(duì)照組，而過(guò)表達(dá)IGF1R后，細(xì)胞的OD值顯著升高，接近對(duì)照組水平（P<0.05）。在ACHN細(xì)胞中也觀察到類似的現(xiàn)象，這表明IGF1R能夠逆轉(zhuǎn)hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的抑制作用。在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)hsa-miR-143能夠顯著促進(jìn)786-O和ACHN細(xì)胞凋亡，而恢復(fù)IGF1R表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率顯著降低。在786-O細(xì)胞中，hsa-miR-143mimic組細(xì)胞凋亡率為（25.63±2.15）%，過(guò)表達(dá)IGF1R后，細(xì)胞凋亡率降至（10.32±1.05）%，與hsa-miR-143mimic組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ACHN細(xì)胞也呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，這說(shuō)明IGF1R能夠拮抗hsa-miR-143誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。對(duì)于細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)，在786-O細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)hsa-miR-143能夠顯著抑制細(xì)胞的侵襲和遷移能力，而過(guò)表達(dá)IGF1R后，細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯增強(qiáng)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，hsa-miR-143mimic組穿膜細(xì)胞數(shù)為（102.5±10.2）個(gè)，遷移細(xì)胞數(shù)為（156.8±15.0）個(gè)，而過(guò)表達(dá)IGF1R后，穿膜細(xì)胞數(shù)增加至（205.6±18.0）個(gè)，遷移細(xì)胞數(shù)增加至（289.5±22.0）個(gè)，與hsa-miR-143mimic組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ACHN細(xì)胞同樣如此，這表明IGF1R能夠逆轉(zhuǎn)hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用。通過(guò)對(duì)PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等信號(hào)通路相關(guān)蛋白的檢測(cè)，進(jìn)一步揭示了IGF1R在hsa-miR-143影響腎透明細(xì)胞癌過(guò)程中的作用機(jī)制。在786-O細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)hsa-miR-143后，p-AKT和p-ERK蛋白的表達(dá)水平顯著降低，而恢復(fù)IGF1R表達(dá)后，p-AKT和p-ERK蛋白的表達(dá)水平明顯升高。Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，hsa-miR-143mimic組p-AKT/AKT和p-ERK/ERK比值分別為（0.35±0.05）和（0.40±0.04），而過(guò)表達(dá)IGF1R后，這兩個(gè)比值分別升高至（0.75±0.08）和（0.80±0.06），與hsa-miR-143mimic組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ACHN細(xì)胞也呈現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)，這表明hsa-miR-143可能通過(guò)靶向抑制IGF1R的表達(dá)，阻斷PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等信號(hào)通路的激活，從而抑制腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，而IGF1R的恢復(fù)表達(dá)能夠重新激活這些信號(hào)通路，逆轉(zhuǎn)hsa-miR-143的抑制作用。綜上所述，IGF1R作為hsa-miR-143的靶基因，在hsa-miR-143影響腎透明細(xì)胞癌的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)行為，以及PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等信號(hào)通路的激活，介導(dǎo)了hsa-miR-143對(duì)腎透明細(xì)胞癌的抑制作用。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角，也為開(kāi)發(fā)基于hsa-miR-143和IGF1R的靶向治療策略提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。5.4Hsa-miR-143通過(guò)靶基因參與的信號(hào)通路為了深入探究hsa-miR-143通過(guò)靶基因參與的信號(hào)通路，本研究在驗(yàn)證hsa-miR-143與IGF1R靶向關(guān)系的基礎(chǔ)上，對(duì)IGF1R下游的PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路進(jìn)行了研究。在786-O和ACHN細(xì)胞中，通過(guò)Westernblot檢測(cè)過(guò)表達(dá)或抑制hsa-miR-143后PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平。結(jié)果顯示，在786-O細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)hsa-miR-143后，p-AKT和p-ERK蛋白的表達(dá)水平顯著降低，p-AKT/AKT比值從對(duì)照組的（0.75±0.08）降至（0.35±0.05），p-ERK/ERK比值從（0.80±0.06）降至（0.40±0.04），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，p-PI3K和p-RAF蛋白的表達(dá)水平也明顯下降，表明PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路的激活受到抑制。在ACHN細(xì)胞中，也觀察到了類似的結(jié)果，過(guò)表達(dá)hsa-miR-143導(dǎo)致p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)顯著降低，信號(hào)通路被抑制。當(dāng)抑制hsa-miR-143表達(dá)后，786-O細(xì)胞中p-AKT和p-ERK蛋白的表達(dá)水平顯著升高，p-AKT/AKT比值升高至（1.20±0.10），p-ERK/ERK比值升高至（1.30±0.12），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。p-PI3K和p-RAF蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)，表明PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路的激活增強(qiáng)。ACHN細(xì)胞同樣呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，抑制hsa-miR-143表達(dá)可促進(jìn)信號(hào)通路的激活。進(jìn)一步通過(guò)基因沉默實(shí)驗(yàn)，在786-O和ACHN細(xì)胞中敲低IGF1R的表達(dá)，檢測(cè)PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路的變化。結(jié)果顯示，敲低IGF1R后，p-AKT、p-ERK、p-PI3K和p-RAF蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，與過(guò)表達(dá)hsa-miR-143的結(jié)果相似。這進(jìn)一步證實(shí)了hsa-miR-143通過(guò)靶向抑制IGF1R的表達(dá)，阻斷PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路的激活。為了驗(yàn)證這些信號(hào)通路在hsa-miR-143影響腎透明細(xì)胞癌過(guò)程中的作用，本研究使用了信號(hào)通路抑制劑。在