ISG15原核表達(dá)、多抗制備及與豬瘟病毒互作探究一、引言1.1研究背景與意義在生命科學(xué)領(lǐng)域，免疫反應(yīng)機(jī)制與病毒致病機(jī)理一直是研究的核心方向。其中，干擾素刺激基因15（Interferon-StimulatedGene15，ISG15）作為免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，以及豬瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus，CSFV）對養(yǎng)豬業(yè)造成的嚴(yán)重危害，使得探究兩者之間的相互作用成為了極具價值的研究課題。ISG15是一類由干擾素誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白，在機(jī)體免疫反應(yīng)中占據(jù)著舉足輕重的地位。當(dāng)機(jī)體遭受病毒、細(xì)菌等病原體侵襲時，干擾素被迅速誘導(dǎo)產(chǎn)生，進(jìn)而刺激ISG15基因的表達(dá)。ISG15蛋白主要通過兩種方式發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用：一方面，它可以作為一種可溶性細(xì)胞因子，與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的信號傳導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性和功能；另一方面，ISG15能夠發(fā)生類泛素化修飾，即ISGylation過程，通過一系列酶促反應(yīng)共價結(jié)合到底物蛋白上，改變底物蛋白的功能、定位或穩(wěn)定性，廣泛參與細(xì)胞內(nèi)的多種生理過程，如抗病毒防御、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡等。已有研究表明，ISG15在抵御多種病毒感染中發(fā)揮著重要的抗病毒作用。例如，在流感病毒感染過程中，ISG15可以通過修飾病毒蛋白或宿主細(xì)胞蛋白，干擾病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和裝配等過程，從而抑制病毒的增殖。在埃博拉病毒感染時，ISG15能夠激活天然免疫信號通路，增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫應(yīng)答。豬瘟是由豬瘟病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，嚴(yán)重威脅著全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。豬瘟病毒屬于黃病毒科瘟病毒屬，是一種單股正鏈RNA病毒。該病毒具有極強(qiáng)的感染性和致病性，豬一旦感染，會出現(xiàn)高熱、厭食、精神萎靡、皮膚出血、器官壞死等一系列嚴(yán)重癥狀，發(fā)病率和死亡率極高。在一些嚴(yán)重的疫情中，豬瘟的發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率甚至高達(dá)90%以上，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球每年因豬瘟造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億美元，間接損失更是難以估量，不僅影響了養(yǎng)豬場的經(jīng)濟(jì)效益，還對豬肉市場的供應(yīng)和價格穩(wěn)定造成了沖擊，進(jìn)而影響到整個畜牧業(yè)的產(chǎn)業(yè)鏈。此外，豬瘟的爆發(fā)還可能引發(fā)食品安全問題，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成潛在威脅。深入研究ISG15與豬瘟病毒之間的相互作用，對于揭示豬瘟病毒的致病機(jī)制和防控豬瘟具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。從致病機(jī)制角度來看，ISG15作為機(jī)體抗病毒免疫的重要防線，與豬瘟病毒之間必然存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系。通過研究這種相互作用，可以深入了解豬瘟病毒如何逃避機(jī)體的免疫防御，以及ISG15在這一過程中的應(yīng)對機(jī)制，為全面揭示豬瘟病毒的致病機(jī)理提供新的視角和理論依據(jù)。在豬瘟防控方面，基于對兩者相互作用的認(rèn)識，可以開發(fā)出新型的診斷方法，提高豬瘟的早期診斷準(zhǔn)確率；也有望為研發(fā)高效的疫苗和治療藥物提供新的靶點(diǎn)和策略，如通過調(diào)節(jié)ISG15的表達(dá)或活性，增強(qiáng)機(jī)體對豬瘟病毒的抵抗力，或者設(shè)計(jì)能夠干擾豬瘟病毒與ISG15相互作用的藥物，阻斷病毒的感染和復(fù)制過程，從而有效控制豬瘟的傳播和流行，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1ISG15的原核表達(dá)研究進(jìn)展ISG15原核表達(dá)是獲取大量ISG15蛋白以用于后續(xù)功能研究和應(yīng)用的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，在國內(nèi)外都受到了廣泛關(guān)注。原核表達(dá)系統(tǒng)因其具有操作簡便、成本低廉、表達(dá)量高、生長迅速等優(yōu)點(diǎn)，成為了表達(dá)ISG15蛋白的常用選擇。在原核表達(dá)載體的構(gòu)建方面，研究人員通常會選擇如pET系列、pGEX系列等經(jīng)典的原核表達(dá)載體。例如，將ISG15基因克隆至pET-28a載體中，利用其攜帶的T7啟動子高效啟動ISG15基因的轉(zhuǎn)錄，在大腸桿菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了ISG15蛋白的高水平表達(dá)。在優(yōu)化表達(dá)條件時，溫度、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時間等因素對ISG15蛋白的表達(dá)量和表達(dá)形式有著顯著影響。有研究表明，在較低溫度（如16℃）下誘導(dǎo)，能夠促進(jìn)ISG15蛋白以可溶性形式表達(dá)，減少包涵體的形成，有利于后續(xù)的蛋白純化；而不同的誘導(dǎo)劑（如IPTG）濃度和誘導(dǎo)時間也會影響蛋白的表達(dá)效率，需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最佳的表達(dá)效果。此外，為了提高ISG15蛋白的穩(wěn)定性和活性，還會對其進(jìn)行融合表達(dá)，如與GST（谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶）、His（組氨酸標(biāo)簽）等標(biāo)簽融合，不僅方便了蛋白的純化，還能在一定程度上保護(hù)ISG15蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。在蛋白純化過程中，常用的方法包括親和層析、離子交換層析和凝膠過濾層析等。利用Ni-NTA樹脂親和層析，能夠特異性地結(jié)合帶有His標(biāo)簽的ISG15蛋白，從而實(shí)現(xiàn)高效的純化，獲得高純度的ISG15蛋白，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。1.2.2ISG15多克隆抗體制備的研究現(xiàn)狀I(lǐng)SG15多克隆抗體是研究ISG15功能及其與其他分子相互作用的重要工具，其制備技術(shù)也在不斷發(fā)展和完善。制備多克隆抗體的關(guān)鍵步驟包括抗原的制備、動物免疫和抗體的純化與鑒定。如前文所述，通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的高純度ISG15蛋白是理想的抗原。在動物免疫過程中，通常會選擇家兔、小鼠等動物作為免疫對象。以家兔為例，將ISG15蛋白與弗氏佐劑充分乳化后，多次皮下注射或肌肉注射到家兔體內(nèi)，以激發(fā)家兔的免疫反應(yīng)，使其產(chǎn)生針對ISG15蛋白的抗體。在免疫過程中，需要合理安排免疫次數(shù)和免疫劑量，以提高抗體的效價和質(zhì)量。免疫結(jié)束后，采集家兔的血液，分離血清，通過硫酸銨沉淀、親和層析等方法對血清中的抗體進(jìn)行純化，去除雜蛋白，提高抗體的純度。對于制備好的多克隆抗體，需要進(jìn)行嚴(yán)格的鑒定，包括抗體的特異性、敏感性和效價等指標(biāo)的檢測。通過Westernblot實(shí)驗(yàn)，可以檢測抗體是否能夠特異性地識別ISG15蛋白，排除非特異性結(jié)合的干擾；間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)則可以直觀地觀察抗體與細(xì)胞內(nèi)ISG15蛋白的結(jié)合情況，進(jìn)一步驗(yàn)證抗體的特異性和敏感性；而ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）等方法則可用于測定抗體的效價，評估抗體的質(zhì)量和濃度，確保其能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。1.2.3ISG15與豬瘟病毒相互作用的研究現(xiàn)狀I(lǐng)SG15與豬瘟病毒之間的相互作用是揭示豬瘟病毒致病機(jī)制和防控豬瘟的關(guān)鍵研究方向，近年來受到了國內(nèi)外學(xué)者的高度重視。已有研究表明，豬瘟病毒感染會引起宿主細(xì)胞中ISG15基因和蛋白表達(dá)水平的變化。通過基因芯片技術(shù)和實(shí)時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，豬瘟病毒感染豬只的外周血單個核細(xì)胞后，ISG15基因mRNA在感染后的不同時間點(diǎn)呈現(xiàn)出顯著的上調(diào)變化，表明豬瘟病毒感染能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生ISG15。利用間接免疫熒光和Westernblot技術(shù)，在豬瘟病毒感染的PK-15細(xì)胞中也觀察到ISG15蛋白表達(dá)水平的增加。這種表達(dá)變化可能是宿主細(xì)胞對豬瘟病毒感染的一種免疫應(yīng)答反應(yīng)，ISG15試圖通過發(fā)揮其抗病毒作用來抵御豬瘟病毒的入侵。然而，豬瘟病毒也可能通過一些機(jī)制來逃避ISG15的抗病毒作用。有研究推測，豬瘟病毒可能阻斷ISG15蛋白介導(dǎo)的對豬瘟病毒蛋白的泛素化水解途徑，從而實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。但具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究，包括豬瘟病毒蛋白與ISG15之間是否存在直接的相互作用，以及這種相互作用如何影響ISG15的功能和豬瘟病毒的復(fù)制過程等問題，都需要通過免疫共沉淀、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)進(jìn)行深入探究，以全面揭示兩者之間的相互作用機(jī)制，為豬瘟的防控提供理論依據(jù)和新的策略。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究ISG15與豬瘟病毒之間的相互作用機(jī)制，為揭示豬瘟病毒的致病機(jī)理和防控豬瘟提供理論依據(jù)和新的策略。圍繞這一核心目標(biāo)，研究內(nèi)容主要涵蓋以下三個方面：構(gòu)建ISG15原核表達(dá)系統(tǒng)，制備高純度的ISG15蛋白：精準(zhǔn)選擇合適的ISG15基因序列，運(yùn)用生物信息學(xué)工具，綜合考慮基因的開放閱讀框、密碼子偏好性以及與表達(dá)載體的兼容性等因素，設(shè)計(jì)特異性引物。通過RT-PCR技術(shù)，從經(jīng)重組人Ⅰ型干擾素IFNα-2b誘導(dǎo)的PK15細(xì)胞中擴(kuò)增出ISG15基因。將擴(kuò)增得到的ISG15基因克隆至原核表達(dá)載體，如pGEX-4T-1或pET-28a等，利用限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶，確?；蚺c載體的正確連接，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株，如BL21(DE3)中，通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，包括IPTG濃度（設(shè)置0.1mM、0.5mM、1.0mM等梯度）、誘導(dǎo)溫度（16℃、25℃、37℃等）和誘導(dǎo)時間（3h、6h、9h等），以實(shí)現(xiàn)ISG15蛋白的高效表達(dá)。采用SDS-PAGE和Westernblot等技術(shù)，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析，檢測蛋白的表達(dá)量和純度，確定最佳表達(dá)條件，最終制備出高純度的ISG15蛋白，為后續(xù)多克隆抗體制備和相互作用研究提供優(yōu)質(zhì)的抗原。制備ISG15多克隆抗體，鑒定其特異性和敏感性：將制備好的高純度ISG15蛋白與弗氏佐劑充分乳化，按照合理的免疫程序?qū)彝眠M(jìn)行免疫。初次免疫時，采用皮下多點(diǎn)注射的方式，注射劑量為[X]mg/只；隨后在第[X]周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫次數(shù)為[X]次，注射途徑和劑量可根據(jù)免疫效果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。每次免疫后，定期采集家兔血液，分離血清，通過ELISA法檢測血清中抗體的效價，觀察抗體效價的變化趨勢。當(dāng)抗體效價達(dá)到預(yù)期水平后，采集足量血液，通過硫酸銨沉淀、親和層析等方法對免疫血清進(jìn)行純化和濃縮，去除雜蛋白，提高抗體的純度。運(yùn)用Westernblot和間接免疫熒光等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對制備的ISG15多克隆抗體的特異性和敏感性進(jìn)行嚴(yán)格鑒定。在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，檢測抗體是否能夠特異性地識別ISG15蛋白，與其他無關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)；間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)則用于觀察抗體與細(xì)胞內(nèi)ISG15蛋白的結(jié)合情況，驗(yàn)證其在細(xì)胞水平的特異性和敏感性。利用ISG15多克隆抗體對豬瘟病毒進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，研究ISG15和豬瘟病毒之間的相互作用：使用制備的ISG15多克隆抗體對豬瘟病毒感染的細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞裂解液與ISG15多克隆抗體充分混合，在4℃條件下孵育過夜，使抗體與ISG15蛋白及其相互作用的豬瘟病毒蛋白充分結(jié)合。加入ProteinA/G磁珠，繼續(xù)孵育，磁珠會特異性地結(jié)合抗體-抗原復(fù)合物，通過磁力分離，將復(fù)合物從裂解液中分離出來。用洗滌緩沖液多次洗滌磁珠，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。對免疫沉淀得到的復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblot分析，檢測是否存在豬瘟病毒蛋白與ISG15蛋白的結(jié)合條帶，確定兩者是否存在直接相互作用。若存在相互作用，進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析等技術(shù)，鑒定與ISG15相互作用的豬瘟病毒蛋白的具體成分，深入探究兩者相互作用的分子機(jī)制。利用實(shí)時定量PCR、免疫熒光等技術(shù)，檢測豬瘟病毒感染細(xì)胞后，ISG15基因和蛋白表達(dá)水平的動態(tài)變化，以及ISG15對豬瘟病毒復(fù)制和感染過程的影響，全面揭示兩者之間的相互作用關(guān)系。二、ISG15與豬瘟病毒概述2.1ISG15介紹2.1.1ISG15的結(jié)構(gòu)與功能ISG15是一種細(xì)胞內(nèi)泛素樣蛋白，其編碼基因位于人類1號染色體長臂2區(qū)3帶上（1q23）。成熟的ISG15蛋白相對分子質(zhì)量約為15kDa，由154個氨基酸組成，包含兩個泛素樣結(jié)構(gòu)域（Ubiquitin-likedomain，ULD），分別為N端的ULD1（3-78氨基酸）和C端的ULD2（79-154氨基酸）。這兩個結(jié)構(gòu)域與泛素在氨基酸序列上具有約33%的同源性，并且在空間構(gòu)象上也呈現(xiàn)出相似性，為ISG15發(fā)揮類泛素化修飾功能奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在其C末端，存在亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸（Leucine-Arginine-Leucine-Arginine-Glycine-Glycine，LRLRGG）氨基酸鏈，這一序列在不同物種間具有高度保守性，對ISG15的修飾活性至關(guān)重要。ISG15在機(jī)體中發(fā)揮著多方面的重要功能，尤其是在免疫調(diào)節(jié)和抗病毒防御領(lǐng)域。在免疫調(diào)節(jié)方面，ISG15不僅能夠以可溶性細(xì)胞因子的形式發(fā)揮作用，還能通過ISGylation修飾參與免疫細(xì)胞的激活、分化和功能調(diào)節(jié)。當(dāng)機(jī)體受到病原體感染時，ISG15可被誘導(dǎo)分泌到細(xì)胞外，與免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游信號通路，促進(jìn)免疫細(xì)胞的趨化、活化，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。在抗病毒方面，ISG15是機(jī)體抵御病毒感染的重要防線。研究表明，ISG15可以通過多種機(jī)制抑制病毒的復(fù)制和傳播。它可以共價結(jié)合到病毒蛋白或宿主細(xì)胞蛋白上，改變蛋白的功能、定位或穩(wěn)定性，從而干擾病毒的生命周期。在流感病毒感染過程中，ISG15能夠修飾病毒的核蛋白（NP），抑制其與病毒RNA的結(jié)合，進(jìn)而影響病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程；在HIV-1感染時，ISG15通過修飾病毒的Gag蛋白，阻礙病毒顆粒的組裝和釋放，有效抑制了病毒的感染性。2.1.2ISG15的抗病毒機(jī)制ISG15發(fā)揮抗病毒作用的關(guān)鍵機(jī)制之一是類泛素化修飾（ISGylation）。這一過程類似于泛素化，需要一系列酶的參與，包括E1激活酶（UbE1L，也稱為UbA7）、E2結(jié)合酶（UbE2L6，也稱為UbCH8）和E3連接酶（如HERC5等）。在ISGylation過程中，首先，E1激活酶UbE1L與ATP結(jié)合，將ISG15的C末端甘氨酸殘基激活，形成高能硫酯鍵，使ISG15活化；隨后，活化的ISG15被轉(zhuǎn)移到E2結(jié)合酶UbE2L6上，進(jìn)一步傳遞修飾信號；最后，在E3連接酶HERC5等的作用下，ISG15特異性地識別并共價結(jié)合到底物蛋白的賴氨酸殘基上，完成ISGylation修飾。通過這種修飾，ISG15能夠?qū)Φ孜锏鞍椎墓δ墚a(chǎn)生多種影響。一方面，ISG15修飾可以改變底物蛋白的定位。例如，在某些病毒感染時，ISG15修飾宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，使其定位發(fā)生改變，從而干擾病毒蛋白的運(yùn)輸和組裝，阻斷病毒的復(fù)制過程。另一方面，ISG15修飾還可以調(diào)節(jié)底物蛋白的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，一些被ISG15修飾的病毒蛋白更容易被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體識別和降解，從而降低病毒蛋白的表達(dá)水平，抑制病毒的增殖。此外，ISG15修飾還能夠影響底物蛋白的活性。如在乙肝病毒感染中，ISG15修飾病毒的聚合酶，抑制其活性，進(jìn)而干擾病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程，阻礙病毒的復(fù)制。除了ISGylation修飾，ISG15還可以通過其他途徑發(fā)揮抗病毒作用。作為一種可溶性細(xì)胞因子，ISG15可以與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)一系列抗病毒基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗病毒能力。ISG15還可以直接與病毒粒子相互作用，抑制病毒的吸附、侵入和脫殼等過程，從而阻止病毒感染宿主細(xì)胞。2.2豬瘟病毒介紹2.2.1豬瘟病毒的生物學(xué)特性豬瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus，CSFV）屬于黃病毒科瘟病毒屬，是一種具有重要經(jīng)濟(jì)意義的病毒。其病毒粒子呈球形，直徑在40-60納米之間。病毒粒子由囊膜和核衣殼組成，囊膜表面存在纖突，這些纖突在病毒的吸附和侵入宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。內(nèi)部的核衣殼則呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，保護(hù)著病毒的基因組。豬瘟病毒的基因組為單股正鏈RNA，長度約為12.3千堿基對，具有感染性。整個基因組僅有一個大的開放閱讀框，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白和至少8種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中，4種結(jié)構(gòu)蛋白包括囊膜表面的糖蛋白Erns、E1、E2以及組成核衣殼的C蛋白。Erns糖蛋白不僅參與病毒與宿主細(xì)胞的識別和結(jié)合，還具有核糖核酸酶活性，能夠降解宿主細(xì)胞的RNA，干擾宿主的免疫應(yīng)答；E1和E2糖蛋白則在病毒的吸附、侵入和膜融合過程中發(fā)揮重要作用，它們可以與宿主細(xì)胞表面的受體相互作用，介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞；C蛋白構(gòu)成了核衣殼，對病毒基因組起到保護(hù)作用。至少8種非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、裝配和釋放等過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。如NS3蛋白具有蛋白酶和螺旋酶活性，參與病毒多聚蛋白的加工和RNA的復(fù)制；NS5B蛋白是RNA依賴的RNA聚合酶，負(fù)責(zé)病毒基因組的復(fù)制。CSFV只有1個血清型，但根據(jù)基因組序列的差異，可分為3個基因型11個基因亞型。不同基因型毒株的致病力差異很大，這給豬瘟的防控帶來了挑戰(zhàn)。一些高致病性的毒株感染豬只后，可導(dǎo)致豬只迅速發(fā)病死亡，而低致病性毒株則可能引起豬只的慢性感染或隱性感染，成為潛在的傳染源。CSFV在pH為5-10的條件下比較穩(wěn)定，過高或過低的pH均可使病毒感染性迅速喪失。多種脂溶劑、去污劑和常用的消毒劑均能使CSFV失活，如乙醚、氯仿等脂溶劑可以破壞病毒的囊膜結(jié)構(gòu)，從而使病毒失去感染性；含氯消毒劑、過氧乙酸等常用消毒劑也能有效地殺滅CSFV。CSFV能感染家豬和野豬，鼠、兔等可攜帶并傳播病毒，一些昆蟲也可通過叮咬病豬或接觸污染飼料等成為CSFV攜帶者。該病毒可在肉制品及其廢棄物中存活數(shù)周甚至數(shù)月，這使得病毒能夠通過食物鏈或廢棄物傳播，引起疾病擴(kuò)散或重新引入無病地區(qū)。在實(shí)驗(yàn)室中，CSFV可在多種動物細(xì)胞上增殖，其中豬源腎細(xì)胞PK-15、豬睪丸細(xì)胞ST等傳代細(xì)胞系常用于CSFV體外增殖。但值得注意的是，CSFV在這些細(xì)胞上增殖時通常不產(chǎn)生細(xì)胞病變，這給病毒的檢測和鑒定帶來了一定的困難，需要借助其他技術(shù)手段，如免疫熒光、RT-PCR等進(jìn)行檢測。此外，CSFV與牛病毒性腹瀉病毒具有共同抗原，兩者在血清學(xué)上有交叉反應(yīng)，同時具有交叉保護(hù)作用。這一特性在豬瘟的診斷和防控中需要加以考慮，避免出現(xiàn)誤診或免疫交叉保護(hù)帶來的干擾。2.2.2豬瘟的危害與防控現(xiàn)狀豬瘟是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。一旦豬瘟爆發(fā)，豬只的發(fā)病率和死亡率極高，在一些嚴(yán)重的疫情中，發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率甚至高達(dá)90%以上。豬只感染豬瘟病毒后，會出現(xiàn)高熱、厭食、精神萎靡、皮膚出血、器官壞死等一系列嚴(yán)重癥狀。這些癥狀不僅影響豬只的生長發(fā)育和生產(chǎn)性能，還會導(dǎo)致豬只的死亡，直接造成養(yǎng)豬場的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球每年因豬瘟造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億美元。除了直接的經(jīng)濟(jì)損失外，豬瘟的爆發(fā)還會對豬肉市場的供應(yīng)和價格穩(wěn)定造成沖擊。由于大量豬只死亡，市場上豬肉的供應(yīng)量減少，導(dǎo)致豬肉價格上漲，影響消費(fèi)者的生活成本。豬瘟還可能引發(fā)食品安全問題，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成潛在威脅。如果感染豬瘟的豬肉流入市場，可能會傳播病毒，對消費(fèi)者的健康造成危害。為了防控豬瘟，目前主要采取疫苗免疫、加強(qiáng)監(jiān)測和檢疫、嚴(yán)格生物安全措施等綜合防控措施。疫苗免疫是預(yù)防豬瘟的關(guān)鍵手段，中國研制的豬瘟兔化弱毒疫苗（C-株疫苗）在豬瘟防控中發(fā)揮了重要作用。該疫苗具有良好的免疫原性和安全性，能夠有效地誘導(dǎo)豬只產(chǎn)生免疫力，抵抗豬瘟病毒的感染。通過對豬群進(jìn)行定期的疫苗免疫，可以建立起有效的免疫屏障，降低豬瘟的發(fā)病率。加強(qiáng)監(jiān)測和檢疫也是防控豬瘟的重要措施。通過對豬群進(jìn)行定期的監(jiān)測和檢疫，可以及時發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒的感染情況，采取相應(yīng)的措施進(jìn)行隔離和撲殺，防止病毒的傳播。在養(yǎng)殖場、屠宰場等場所，加強(qiáng)對豬只的檢疫，嚴(yán)格控制病豬和帶毒豬的流通。嚴(yán)格的生物安全措施對于防止豬瘟病毒的傳入和傳播至關(guān)重要。養(yǎng)殖場應(yīng)建立完善的生物安全體系，包括人員、車輛、物資的進(jìn)出管理，定期對養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)行消毒，加強(qiáng)豬只的飼養(yǎng)管理等。嚴(yán)禁從疫區(qū)引進(jìn)豬只，防止病毒的傳入；對養(yǎng)殖場的廢棄物進(jìn)行無害化處理，避免病毒的擴(kuò)散。然而，豬瘟的防控仍然面臨著一些挑戰(zhàn)。隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖模式的變化，豬瘟的傳播途徑和流行特點(diǎn)也在發(fā)生改變。一些新的基因亞型的出現(xiàn)，可能導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗的免疫效果下降。部分養(yǎng)殖場的生物安全措施落實(shí)不到位，也增加了豬瘟爆發(fā)的風(fēng)險。一些養(yǎng)殖戶為了降低成本，忽視生物安全管理，導(dǎo)致病毒在養(yǎng)殖場內(nèi)傳播。此外，豬瘟病毒的隱性感染和帶毒豬的存在，也給豬瘟的防控帶來了困難。這些隱性感染豬和帶毒豬沒有明顯的臨床癥狀，但卻能夠傳播病毒，難以被及時發(fā)現(xiàn)和控制。因此，需要不斷加強(qiáng)對豬瘟的研究，優(yōu)化防控策略，提高防控效果，以保障養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。三、ISG15的原核表達(dá)3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料菌株與質(zhì)粒：大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞用于基因克隆過程中的載體轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增，其具有生長迅速、轉(zhuǎn)化效率高的特點(diǎn)，能穩(wěn)定保存重組質(zhì)粒。大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞則是ISG15蛋白原核表達(dá)的關(guān)鍵宿主菌，該菌株含有T7RNA聚合酶基因，可在IPTG誘導(dǎo)下高效表達(dá)T7RNA聚合酶，進(jìn)而啟動帶有T7啟動子的重組表達(dá)載體中ISG15基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。原核表達(dá)載體pET-28a(+)，其帶有T7啟動子、His標(biāo)簽編碼序列以及卡那霉素抗性基因。T7啟動子具有強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄起始能力，能夠高效驅(qū)動ISG15基因的轉(zhuǎn)錄；His標(biāo)簽便于后續(xù)通過親和層析法對表達(dá)的ISG15蛋白進(jìn)行純化，提高純化效率和純度；卡那霉素抗性基因則用于在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中篩選含有重組表達(dá)載體的大腸桿菌菌株。試劑：限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ用于對目的基因和表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，以確保兩者能夠準(zhǔn)確、高效地連接。這兩種酶識別特定的DNA序列，在切割后產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，有利于基因與載體的定向連接。DNA連接酶用于將酶切后的ISG15基因與表達(dá)載體連接起來，形成重組表達(dá)載體。其作用是催化DNA片段之間的磷酸二酯鍵的形成，實(shí)現(xiàn)基因與載體的共價連接。高保真DNA聚合酶用于PCR擴(kuò)增ISG15基因，具有高度的保真性，能夠準(zhǔn)確復(fù)制DNA模板，減少擴(kuò)增過程中堿基錯配的發(fā)生，確保擴(kuò)增得到的ISG15基因序列的準(zhǔn)確性。PrimeScriptRTreagentKit反轉(zhuǎn)錄試劑盒用于提取細(xì)胞總RNA后，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供模板。該試劑盒包含了反轉(zhuǎn)錄所需的各種酶和緩沖液，操作簡便，反轉(zhuǎn)錄效率高。質(zhì)粒提取試劑盒用于從大腸桿菌中提取重組表達(dá)質(zhì)粒，能夠高效、快速地分離出高純度的質(zhì)粒，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。DNA凝膠回收試劑盒用于從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段，如酶切后的ISG15基因和載體片段。它通過特異性的吸附和洗脫過程，能夠有效去除雜質(zhì)，回收得到高純度的DNA片段，保證后續(xù)連接反應(yīng)的順利進(jìn)行。IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）作為誘導(dǎo)劑，用于誘導(dǎo)大腸桿菌中ISG15蛋白的表達(dá)。在合適的濃度下，IPTG能夠與阻遏蛋白結(jié)合，解除其對T7啟動子的抑制，從而啟動ISG15基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。其他常規(guī)試劑，如Tris-HCl、NaCl、KCl、MgCl?、EDTA等，用于配制各種緩沖液和培養(yǎng)基，維持實(shí)驗(yàn)體系的酸堿度、離子強(qiáng)度等條件，保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。蛋白Marker用于在SDS和Westernblot實(shí)驗(yàn)中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，通過與樣品條帶的遷移率對比，確定樣品中蛋白的分子量大小。3.1.2引物設(shè)計(jì)在引物設(shè)計(jì)過程中，借助NCBI數(shù)據(jù)庫獲取豬ISG15基因的mRNA序列。運(yùn)用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，上游引物為5'-CCATGGATGCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物為5'-CTCGAGTCAGGGAGGGAGGGAGGGAG-3'。在上游引物的5'端引入NcoⅠ酶切位點(diǎn)（CCATGG），在下游引物的5'端引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)（CTCGAG），酶切位點(diǎn)后分別添加了6個保護(hù)堿基，以提高酶切效率。同時，對引物的特異性進(jìn)行了嚴(yán)格的BLAST比對分析，確保引物與豬ISG15基因序列具有高度的特異性結(jié)合，避免非特異性擴(kuò)增。此外，還對引物的退火溫度、GC含量等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，使上下游引物的退火溫度相近，均在58-62℃之間，GC含量保持在40%-60%，以保證PCR擴(kuò)增的高效性和特異性。3.1.3基因克隆采用Trizol法從經(jīng)重組人Ⅰ型干擾素IFNα-2b誘導(dǎo)的PK15細(xì)胞中提取總RNA。在提取過程中，嚴(yán)格按照Trizol試劑的操作說明進(jìn)行，通過細(xì)胞裂解、相分離、RNA沉淀和洗滌等步驟，獲得高純度的總RNA。使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)對提取的總RNA進(jìn)行濃度和純度檢測，確保RNA的濃度在1μg/μL以上，OD???/OD???比值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，無蛋白質(zhì)和DNA污染。利用PrimeScriptRTreagentKit反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，加入適量的總RNA、隨機(jī)引物、反轉(zhuǎn)錄酶和緩沖液等，按照試劑盒推薦的反應(yīng)程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供模板。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用上述設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包含cDNA模板、上下游引物、dNTPs、高保真DNA聚合酶和PCR緩沖液等。反應(yīng)程序設(shè)置為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。通過PCR擴(kuò)增，特異性地?cái)U(kuò)增出豬ISG15基因片段。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察擴(kuò)增條帶，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和純度。預(yù)期擴(kuò)增得到的ISG15基因片段大小約為465bp，若電泳結(jié)果顯示在465bp左右出現(xiàn)清晰、單一的條帶，則表明PCR擴(kuò)增成功。3.1.4載體構(gòu)建將PCR擴(kuò)增得到的ISG15基因片段和原核表達(dá)載體pET-28a(+)分別用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系包含DNA片段、限制性內(nèi)切酶、緩沖液和BSA等，在37℃恒溫條件下酶切3-4h。酶切結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離，使用DNA凝膠回收試劑盒分別回收酶切后的ISG15基因片段和pET-28a(+)載體片段。將回收的ISG15基因片段和pET-28a(+)載體片段按照摩爾比3:1的比例混合，加入適量的DNA連接酶和連接緩沖液，在16℃條件下連接過夜。連接反應(yīng)完成后，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)化過程中，將連接產(chǎn)物與DH5α感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30min后，42℃熱激90s，再迅速冰浴2min，然后加入無抗LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞恢復(fù)生長。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑取平板上的單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，對提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和測序驗(yàn)證。雙酶切鑒定時，采用與構(gòu)建重組質(zhì)粒時相同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的ISG15基因片段和載體片段條帶，則初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送至專業(yè)測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank中豬ISG15基因序列進(jìn)行比對，若序列一致，則最終確定重組表達(dá)載體pET-28a-ISG15構(gòu)建成功。3.2ISG15原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建將測序驗(yàn)證正確的重組表達(dá)載體pET-28a-ISG15轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化過程與轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞類似，同樣先將重組表達(dá)載體與BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30min，使感受態(tài)細(xì)胞充分吸收重組質(zhì)粒；然后42℃熱激90s，促使質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；迅速冰浴2min后，加入無抗LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，以恢復(fù)細(xì)胞的生長和活性。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑取平板上的單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h，進(jìn)行菌體的擴(kuò)增。隨后，對培養(yǎng)的菌液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化。在不同的IPTG濃度（0.1mM、0.5mM、1.0mM）、誘導(dǎo)溫度（16℃、25℃、37℃）和誘導(dǎo)時間（3h、6h、9h）組合條件下，對菌液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。具體操作如下：取適量菌液轉(zhuǎn)接至新鮮的含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，使其OD???值達(dá)到0.6-0.8，此時加入不同濃度的IPTG，將菌液分別置于不同溫度的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)相應(yīng)的時間。誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析。將收集的菌體用PBS重懸，加入適量的上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色液對凝膠進(jìn)行染色，染色1-2h后，用脫色液脫色，直至背景清晰，觀察蛋白條帶的位置和亮度，分析不同誘導(dǎo)條件下ISG15蛋白的表達(dá)情況。根據(jù)SDS-PAGE分析結(jié)果，確定最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件，為后續(xù)大量制備ISG15蛋白奠定基礎(chǔ)。3.3ISG15蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測在確定了ISG15原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功后，對重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-28a-ISG15進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。按照優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件，將含有重組質(zhì)粒的菌液轉(zhuǎn)接至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???值達(dá)到0.6-0.8。此時，加入終濃度為0.5mM的IPTG，將菌液置于25℃恒溫?fù)u床中，200rpm振蕩誘導(dǎo)表達(dá)6h。誘導(dǎo)結(jié)束后，取1mL菌液于離心管中，4℃、12000rpm離心1min，收集菌體沉淀。用PBS洗滌菌體沉淀2-3次，以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。向洗滌后的菌體沉淀中加入100μLPBS重懸菌體，再加入100μL2×上樣緩沖液，充分混勻后，100℃煮沸5min，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，按照常規(guī)的SDS-PAGE電泳方法進(jìn)行操作。將蛋白Marker和蛋白樣品加入到凝膠的加樣孔中，在120V恒壓條件下進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入考馬斯亮藍(lán)染色液中，室溫染色1-2h。染色完成后，用脫色液進(jìn)行脫色，每隔30min更換一次脫色液，直至背景清晰，蛋白條帶清晰可見。在SDS-PAGE凝膠上，預(yù)期ISG15蛋白條帶大小約為18kDa（包括ISG15蛋白本身的15kDa以及His標(biāo)簽的3kDa左右）。觀察凝膠上的蛋白條帶，若在18kDa左右出現(xiàn)明顯的條帶，且未誘導(dǎo)的對照組無此條帶，則表明ISG15蛋白成功誘導(dǎo)表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ISG15蛋白的表達(dá)，對誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體進(jìn)行超聲破碎，將破碎后的菌液4℃、12000rpm離心15min，分別收集上清和沉淀。將上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，觀察ISG15蛋白在可溶性上清和包涵體沉淀中的分布情況。若ISG15蛋白主要存在于上清中，則表明其以可溶性形式表達(dá)；若主要存在于沉淀中，則表明其以包涵體形式表達(dá)。通過對不同誘導(dǎo)條件下ISG15蛋白表達(dá)情況的分析，確定了最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件為0.5mMIPTG、25℃誘導(dǎo)6h。在此條件下，ISG15蛋白能夠高效表達(dá)，且主要以可溶性形式存在，為后續(xù)的蛋白純化和多克隆抗體制備提供了良好的基礎(chǔ)。3.4結(jié)果與分析3.4.1ISG15基因的克隆通過RT-PCR技術(shù)，以經(jīng)重組人Ⅰ型干擾素IFNα-2b誘導(dǎo)的PK15細(xì)胞的cDNA為模板，成功擴(kuò)增出豬ISG15基因片段。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在465bp左右出現(xiàn)了清晰、單一的條帶，與預(yù)期的ISG15基因片段大小相符，表明ISG15基因擴(kuò)增成功。這一結(jié)果為后續(xù)的載體構(gòu)建和原核表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。3.4.2ISG15原核表達(dá)載體的構(gòu)建將擴(kuò)增得到的ISG15基因片段和原核表達(dá)載體pET-28a(+)分別用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用DNA凝膠回收試劑盒成功回收了酶切后的ISG15基因片段和pET-28a(+)載體片段。將回收的片段進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-ISG15。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒。雙酶切鑒定結(jié)果顯示，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳后出現(xiàn)了與預(yù)期大小相符的ISG15基因片段和載體片段條帶，初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送至專業(yè)測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank中豬ISG15基因序列比對，結(jié)果顯示完全一致，最終確定重組表達(dá)載體pET-28a-ISG15構(gòu)建成功。3.4.3ISG15蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將重組表達(dá)載體pET-28a-ISG15轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化。SDS-PAGE分析結(jié)果表明，在不同的IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間組合條件下，ISG15蛋白的表達(dá)量和表達(dá)形式存在明顯差異。在IPTG濃度為0.1mM時，ISG15蛋白表達(dá)量較低；當(dāng)IPTG濃度提高到0.5mM時，表達(dá)量顯著增加；繼續(xù)提高IPTG濃度至1.0mM，表達(dá)量雖有增加，但增加幅度不明顯。在誘導(dǎo)溫度方面，16℃誘導(dǎo)時，ISG15蛋白主要以可溶性形式表達(dá)，但表達(dá)量相對較低；25℃誘導(dǎo)時，蛋白表達(dá)量較高，且仍有較多的可溶性蛋白；37℃誘導(dǎo)時，蛋白表達(dá)量最高，但大部分以包涵體形式存在。在誘導(dǎo)時間上，3h時表達(dá)量較低，6h時表達(dá)量明顯增加，9h時表達(dá)量增加不明顯，且出現(xiàn)了蛋白降解的跡象。綜合考慮，確定最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件為0.5mMIPTG、25℃誘導(dǎo)6h。在此條件下，ISG15蛋白能夠高效表達(dá)，且主要以可溶性形式存在，有利于后續(xù)的蛋白純化和多克隆抗體制備。在SDS-PAGE凝膠上，在18kDa左右出現(xiàn)了明顯的條帶，與預(yù)期的ISG15蛋白大小相符，且未誘導(dǎo)的對照組無此條帶，進(jìn)一步證明ISG15蛋白成功誘導(dǎo)表達(dá)。3.4.4ISG15蛋白的純度與活性分析對誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體進(jìn)行超聲破碎，4℃、12000rpm離心15min，分別收集上清和沉淀。將上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明ISG15蛋白主要存在于上清中，說明其以可溶性形式表達(dá)。為了進(jìn)一步提高蛋白的純度，采用Ni-NTA樹脂親和層析對上清中的ISG15蛋白進(jìn)行純化。將上清液與Ni-NTA樹脂充分結(jié)合，用含有不同濃度咪唑的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。SDS-PAGE分析洗脫產(chǎn)物，結(jié)果顯示，在洗脫液中出現(xiàn)了單一的蛋白條帶，且條帶位置與預(yù)期的ISG15蛋白大小一致，表明通過Ni-NTA樹脂親和層析成功純化得到了高純度的ISG15蛋白。利用ELISA試劑盒對純化后的ISG15蛋白進(jìn)行活性檢測，結(jié)果顯示，該蛋白具有良好的生物活性，能夠與相應(yīng)的抗體特異性結(jié)合，為后續(xù)的多克隆抗體制備提供了高質(zhì)量的抗原。四、ISG15多克隆抗體的制備4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動物：選取體重為2.0-2.5kg、健康無病的成年新西蘭大白兔3只，購自[供應(yīng)商名稱]。在實(shí)驗(yàn)前，將家兔飼養(yǎng)于溫度為22-25℃、相對濕度為50%-60%的環(huán)境中，適應(yīng)環(huán)境1周，期間給予充足的飼料和清潔飲水。家兔作為常用的免疫動物，具有免疫應(yīng)答能力強(qiáng)、產(chǎn)生抗體效價高、血清量豐富等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足本實(shí)驗(yàn)對多克隆抗體制備的需求。主要試劑：弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，用于與ISG15蛋白混合，增強(qiáng)抗原的免疫原性，刺激家兔產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。弗氏完全佐劑含有卡介苗等成分，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答；弗氏不完全佐劑則不含卡介苗，主要用于加強(qiáng)免疫，維持免疫反應(yīng)的持續(xù)性。ProteinA/G親和層析柱，用于從家兔血清中純化ISG15多克隆抗體，利用ProteinA/G與抗體Fc段的特異性結(jié)合，能夠高效地分離出高純度的抗體，提高抗體的質(zhì)量和活性。其他試劑，如PBS緩沖液，用于配制抗原、洗滌細(xì)胞和稀釋抗體等，維持實(shí)驗(yàn)體系的酸堿度和離子強(qiáng)度穩(wěn)定；EDTA（乙二胺四乙酸），用于螯合金屬離子，防止蛋白水解和氧化；Tween-20，一種非離子型表面活性劑，常用于免疫實(shí)驗(yàn)中，可降低溶液的表面張力，促進(jìn)抗原與抗體的結(jié)合，減少非特異性吸附。4.1.2免疫方案將純化后的ISG15蛋白與弗氏完全佐劑按照1:1的體積比充分乳化。在乳化過程中，采用注射器反復(fù)抽打混合液，直至形成均勻、穩(wěn)定的乳化物，確保ISG15蛋白能夠均勻分散在佐劑中，增強(qiáng)其免疫原性。首次免疫時，在家兔的背部、頸部、腹部等多個部位進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，注射劑量為0.5mg/只。這些部位血管豐富，皮下組織疏松，有利于抗原的吸收和免疫細(xì)胞的接觸，從而激發(fā)家兔的免疫反應(yīng)。初次免疫后，每隔2周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫時，將ISG15蛋白與弗氏不完全佐劑按照1:1的體積比乳化后，進(jìn)行皮下注射，注射劑量為0.3mg/只。通過多次加強(qiáng)免疫，能夠持續(xù)刺激家兔的免疫系統(tǒng)，使其產(chǎn)生更高水平的抗體。在每次免疫后的第7天，從家兔的耳緣靜脈采集少量血液，分離血清，采用ELISA法檢測血清中ISG15抗體的效價，監(jiān)測免疫效果。4.1.3血清收集在最后一次加強(qiáng)免疫后的第7天，采用頸動脈放血法采集家兔血液。在放血前，對家兔進(jìn)行麻醉處理，以減少其痛苦。將采集的血液置于無菌離心管中，室溫靜置2-3h，使血液充分凝固。然后，4℃、3000rpm離心15min，分離出血清。將分離得到的血清分裝至無菌EP管中，每管1-2ml，-20℃保存?zhèn)溆谩ｎi動脈放血法能夠一次性采集大量血液，保證血清的充足供應(yīng)；低溫保存血清可防止抗體活性降低和血清變質(zhì)，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。4.1.4抗體純化采用ProteinA/G親和層析柱對免疫血清進(jìn)行純化。將ProteinA/G親和層析柱用PBS緩沖液平衡3-5個柱體積，使柱子處于穩(wěn)定的工作狀態(tài)。將免疫血清緩慢加入到平衡好的親和層析柱中，控制流速為0.5-1.0ml/min，使抗體與ProteinA/G充分結(jié)合。用PBS緩沖液洗滌柱子，直至流出液的OD???值小于0.05，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。然后，用pH3.0的甘氨酸-HCl洗脫緩沖液洗脫抗體，收集洗脫液。在洗脫過程中，密切監(jiān)測流出液的OD???值，當(dāng)OD???值開始升高時，開始收集洗脫液，直至OD???值降至基線水平。立即向收集的洗脫液中加入1MTris-HCl（pH8.0），將pH值調(diào)至7.0-7.4，以防止抗體變性。將純化后的抗體用PBS緩沖液進(jìn)行透析，去除其中的鹽分和雜質(zhì)，透析后的抗體分裝后-20℃保存。ProteinA/G親和層析柱能夠特異性地結(jié)合抗體的Fc段，通過親和作用將抗體從血清中分離出來，具有純化效率高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，能夠有效提高抗體的純度和質(zhì)量。4.2動物免疫與血清采集動物免疫是制備多克隆抗體的關(guān)鍵步驟，其目的是通過將抗原（ISG15蛋白）引入動物體內(nèi)，激發(fā)動物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對該抗原的特異性抗體。在本研究中，選擇成年新西蘭大白兔作為免疫動物，主要是因?yàn)榧彝镁哂忻庖邞?yīng)答能力強(qiáng)、產(chǎn)生抗體效價高、血清量豐富等優(yōu)勢，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對多克隆抗體的需求。在免疫之前，對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行了精心的準(zhǔn)備。選取體重為2.0-2.5kg、健康無病的成年新西蘭大白兔3只，購自[供應(yīng)商名稱]。將家兔飼養(yǎng)于溫度為22-25℃、相對濕度為50%-60%的環(huán)境中，適應(yīng)環(huán)境1周，期間給予充足的飼料和清潔飲水，以確保家兔在良好的生理狀態(tài)下接受免疫。免疫方案如下：將純化后的ISG15蛋白與弗氏完全佐劑按照1:1的體積比充分乳化。在乳化過程中，采用注射器反復(fù)抽打混合液，直至形成均勻、穩(wěn)定的乳化物，確保ISG15蛋白能夠均勻分散在佐劑中，增強(qiáng)其免疫原性。首次免疫時，在家兔的背部、頸部、腹部等多個部位進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，注射劑量為0.5mg/只。這些部位血管豐富，皮下組織疏松，有利于抗原的吸收和免疫細(xì)胞的接觸，從而激發(fā)家兔的免疫反應(yīng)。初次免疫后，每隔2周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫時，將ISG15蛋白與弗氏不完全佐劑按照1:1的體積比乳化后，進(jìn)行皮下注射，注射劑量為0.3mg/只。通過多次加強(qiáng)免疫，能夠持續(xù)刺激家兔的免疫系統(tǒng)，使其產(chǎn)生更高水平的抗體。在每次免疫后的第7天，從家兔的耳緣靜脈采集少量血液，分離血清，采用ELISA法檢測血清中ISG15抗體的效價，監(jiān)測免疫效果。耳緣靜脈采血是一種常用的少量采血方法，操作相對簡便，對家兔的損傷較小。通過定期檢測抗體效價，可以了解免疫效果，及時調(diào)整免疫方案，確保在最后一次加強(qiáng)免疫后，家兔血清中ISG15抗體的效價達(dá)到預(yù)期水平。在最后一次加強(qiáng)免疫后的第7天，采用頸動脈放血法采集家兔血液。在放血前，對家兔進(jìn)行麻醉處理，以減少其痛苦。頸動脈放血法能夠一次性采集大量血液，保證血清的充足供應(yīng)。將采集的血液置于無菌離心管中，室溫靜置2-3h，使血液充分凝固。然后，4℃、3000rpm離心15min，分離出血清。將分離得到的血清分裝至無菌EP管中，每管1-2ml，-20℃保存?zhèn)溆谩５蜏乇４嫜蹇煞乐箍贵w活性降低和血清變質(zhì)，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。4.3抗體的純化與鑒定免疫血清中除了含有目標(biāo)抗體外，還存在大量的雜蛋白，如白蛋白、球蛋白等，這些雜質(zhì)會干擾抗體的后續(xù)應(yīng)用，因此需要對免疫血清進(jìn)行純化。本研究采用ProteinA/G親和層析柱對免疫血清進(jìn)行純化。ProteinA和ProteinG是從金黃色葡萄球菌和鏈球菌中提取的蛋白質(zhì)，它們能夠特異性地與抗體的Fc段結(jié)合。將ProteinA/G固定在固相載體上，制備成親和層析柱，當(dāng)免疫血清通過層析柱時，抗體與ProteinA/G結(jié)合，而其他雜蛋白則直接流穿。通過洗滌去除未結(jié)合的雜質(zhì)，再用酸性洗脫緩沖液將結(jié)合的抗體洗脫下來，從而獲得高純度的抗體。在抗體純化過程中，首先將ProteinA/G親和層析柱用PBS緩沖液平衡3-5個柱體積，使柱子處于穩(wěn)定的工作狀態(tài)。將免疫血清緩慢加入到平衡好的親和層析柱中，控制流速為0.5-1.0ml/min，使抗體與ProteinA/G充分結(jié)合。用PBS緩沖液洗滌柱子，直至流出液的OD???值小于0.05，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。然后，用pH3.0的甘氨酸-HCl洗脫緩沖液洗脫抗體，收集洗脫液。在洗脫過程中，密切監(jiān)測流出液的OD???值，當(dāng)OD???值開始升高時，開始收集洗脫液，直至OD???值降至基線水平。立即向收集的洗脫液中加入1MTris-HCl（pH8.0），將pH值調(diào)至7.0-7.4，以防止抗體變性。將純化后的抗體用PBS緩沖液進(jìn)行透析，去除其中的鹽分和雜質(zhì)，透析后的抗體分裝后-20℃保存。為了鑒定制備的ISG15多克隆抗體的質(zhì)量，需要對其特異性、敏感性和效價等指標(biāo)進(jìn)行檢測。采用Westernblot技術(shù)檢測抗體的特異性。將純化后的ISG15蛋白和其他無關(guān)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2h，以減少非特異性結(jié)合。加入制備的ISG15多克隆抗體（稀釋度為1:1000），4℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-4次，每次10min，以去除未結(jié)合的抗體。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1:5000），室溫孵育1-2h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-4次，每次10min。最后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。如果在與ISG15蛋白相對應(yīng)的位置出現(xiàn)明顯的條帶，而在無關(guān)蛋白位置無條帶，則表明制備的抗體具有良好的特異性，能夠特異性地識別ISG15蛋白。運(yùn)用間接免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證抗體的特異性和敏感性。將PK15細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到70%-80%。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20min，再用PBS洗滌3次。用0.1%TritonX-100破膜5-10min，然后用PBS洗滌3次。用5%BSA封閉細(xì)胞1-2h，以減少非特異性結(jié)合。加入制備的ISG15多克隆抗體（稀釋度為1:200），37℃孵育1-2h。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次10min。加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1:500），37℃避光孵育1-2h。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次10min。加入DAPI染液，室溫避光染色5-10min，染細(xì)胞核。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次10min。在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。如果在細(xì)胞中觀察到綠色熒光，且主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，與ISG15蛋白的定位相符，而陰性對照組無熒光，則表明制備的抗體具有良好的特異性和敏感性，能夠在細(xì)胞水平特異性地識別ISG15蛋白。通過ELISA法測定抗體的效價。將純化后的ISG15蛋白用包被緩沖液稀釋至1μg/ml，加入到96孔酶標(biāo)板中，每孔100μl，4℃包被過夜。用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3-4次，每次5min，以去除未結(jié)合的蛋白。用5%脫脂奶粉封閉酶標(biāo)板1-2h，以減少非特異性結(jié)合。將免疫血清從1:100開始進(jìn)行倍比稀釋，加入到酶標(biāo)板中，每孔100μl，37℃孵育1-2h。用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3-4次，每次5min。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1:5000），每孔100μl，37℃孵育1-2h。用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3-4次，每次5min。加入TMB底物顯色液，每孔100μl，37℃避光反應(yīng)15-20min。加入2MH?SO?終止液，每孔50μl，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測定OD???值。以O(shè)D???值大于陰性對照2.1倍的血清最高稀釋度為抗體的效價。結(jié)果顯示，制備的ISG15多克隆抗體效價達(dá)到1:12800以上，表明抗體具有較高的效價，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。4.4結(jié)果與分析在完成ISG15多克隆抗體的制備后，對抗體的質(zhì)量和性能進(jìn)行了全面的檢測與分析。通過ELISA法對免疫過程中家兔血清中ISG15抗體的效價進(jìn)行監(jiān)測，結(jié)果顯示，隨著免疫次數(shù)的增加，抗體效價呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。初次免疫后，抗體效價較低；在第一次加強(qiáng)免疫后，抗體效價開始顯著升高；經(jīng)過3次加強(qiáng)免疫后，抗體效價達(dá)到了1:12800以上，表明家兔的免疫系統(tǒng)對ISG15蛋白產(chǎn)生了強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，能夠產(chǎn)生高滴度的抗體，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對抗體效價的要求。采用ProteinA/G親和層析柱對免疫血清進(jìn)行純化后，通過SDS-PAGE分析檢測抗體的純度。結(jié)果顯示，在純化后的抗體樣品中，僅出現(xiàn)了一條清晰的條帶，與抗體的重鏈和輕鏈分子量相符，且無明顯的雜蛋白條帶，表明通過親和層析成功去除了免疫血清中的雜蛋白，獲得了高純度的ISG15多克隆抗體。運(yùn)用Westernblot技術(shù)檢測抗體的特異性。將純化后的ISG15蛋白和其他無關(guān)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用制備的ISG15多克隆抗體進(jìn)行孵育。結(jié)果顯示，在與ISG15蛋白相對應(yīng)的位置出現(xiàn)了明顯的條帶，而在無關(guān)蛋白位置無條帶，這表明制備的抗體能夠特異性地識別ISG15蛋白，與其他無關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。利用間接免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證抗體的特異性和敏感性。將PK15細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)至合適匯合度后進(jìn)行處理，加入制備的ISG15多克隆抗體孵育，再加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗。在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示，在細(xì)胞中觀察到綠色熒光，且主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，與ISG15蛋白的定位相符，而陰性對照組無熒光，這表明制備的抗體具有良好的特異性和敏感性，能夠在細(xì)胞水平特異性地識別ISG15蛋白。綜上所述，通過本實(shí)驗(yàn)成功制備了高純度、高效價、特異性和敏感性良好的ISG15多克隆抗體，為后續(xù)研究ISG15與豬瘟病毒之間的相互作用提供了可靠的實(shí)驗(yàn)工具。五、ISG15與豬瘟病毒相互作用研究5.1實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)材料：豬腎細(xì)胞系PK-15，購自[細(xì)胞庫名稱]，該細(xì)胞系對豬瘟病毒具有良好的易感性，常用于豬瘟病毒的體外感染研究。豬瘟病毒石門株（CSFVShimenstrain），由[病毒保存單位]提供，是豬瘟病毒的強(qiáng)毒株，具有典型的致病特征，能夠在PK-15細(xì)胞中高效復(fù)制。之前制備的ISG15多克隆抗體，經(jīng)過嚴(yán)格的純化和鑒定，具有高純度、高效價、特異性和敏感性良好的特點(diǎn)，能夠特異性地識別ISG15蛋白。HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)中檢測ISG15多克隆抗體與抗原的結(jié)合，其能夠與ISG15多克隆抗體的Fc段特異性結(jié)合，通過酶促反應(yīng)使底物顯色，從而檢測出目標(biāo)蛋白條帶。ProteinA/G磁珠，用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中富集抗體-抗原復(fù)合物。磁珠表面偶聯(lián)的ProteinA和ProteinG能夠特異性地結(jié)合抗體的Fc段，通過磁力分離，可將抗體-抗原復(fù)合物從細(xì)胞裂解液中分離出來，提高免疫沉淀的效率和純度。RIPA裂解液，用于裂解細(xì)胞，釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白，其含有多種去污劑和蛋白酶抑制劑，能夠有效裂解細(xì)胞，同時保護(hù)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。PMSF（苯甲基磺酰氟），一種蛋白酶抑制劑，在細(xì)胞裂解過程中加入，可抑制蛋白酶的活性，防止蛋白降解，確保細(xì)胞裂解液中蛋白的完整性。其他試劑，如Tris-HCl、NaCl、KCl、MgCl?、EDTA等，用于配制各種緩沖液，維持實(shí)驗(yàn)體系的酸堿度、離子強(qiáng)度等條件穩(wěn)定，保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)方法：將PK-15細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種[X]個細(xì)胞，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO?條件下培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到70%-80%。用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，以去除培養(yǎng)基中的血清成分。按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為1的比例，加入豬瘟病毒石門株感染PK-15細(xì)胞，在37℃條件下吸附1h，期間每隔15min輕輕搖晃培養(yǎng)板，使病毒與細(xì)胞充分接觸。吸附結(jié)束后，棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。分別在感染后0h、3h、6h、12h、24h、48h收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。收集感染不同時間點(diǎn)的PK-15細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。向每孔細(xì)胞中加入150μl含1mMPMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30min，期間每隔5min輕輕搖晃培養(yǎng)板，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15min，收集上清，即為細(xì)胞裂解液。取適量細(xì)胞裂解液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，以確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所需的蛋白量。在細(xì)胞裂解液中加入適量的ISG15多克隆抗體（抗體與細(xì)胞裂解液中蛋白的質(zhì)量比為1:50），輕輕混勻，4℃孵育過夜，使抗體與ISG15蛋白及其相互作用的豬瘟病毒蛋白充分結(jié)合。加入30μlProteinA/G磁珠，4℃繼續(xù)孵育2h，期間每隔15min輕輕搖晃離心管，使磁珠與抗體-抗原復(fù)合物充分結(jié)合。將離心管置于磁力架上，靜置2min，待磁珠吸附在管壁上后，小心吸去上清。用預(yù)冷的PBS洗滌磁珠5次，每次洗滌時，將磁珠重懸于500μlPBS中，4℃、3000rpm離心3min，棄去上清，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。向洗滌后的磁珠中加入50μl2×上樣緩沖液，充分混勻，100℃煮沸5min，使蛋白變性，從磁珠上洗脫下來。將洗脫后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，按照常規(guī)的SDS-PAGE電泳方法進(jìn)行操作，將蛋白Marker和蛋白樣品加入到凝膠的加樣孔中，在120V恒壓條件下進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用半干轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為15V、30min。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2h，以減少非特異性結(jié)合。加入ISG15多克隆抗體（稀釋度為1:1000），4℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-4次，每次10min，以去除未結(jié)合的抗體。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1:5000），室溫孵育1-2h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-4次，每次10min。最后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。如果在免疫沉淀樣品中檢測到豬瘟病毒蛋白條帶，則表明ISG15與豬瘟病毒之間存在相互作用。將PK-15細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種[X]個細(xì)胞，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO?條件下培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到70%-80%。用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，按照MOI為1的比例，加入豬瘟病毒石門株感染PK-15細(xì)胞，在37℃條件下吸附1h。吸附結(jié)束后，棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。分別在感染后0h、3h、6h、12h、24h、48h取出細(xì)胞培養(yǎng)板。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20min，再用PBS洗滌3次。用0.1%TritonX-100破膜5-10min，然后用PBS洗滌3次。用5%BSA封閉細(xì)胞1-2h，以減少非特異性結(jié)合。加入ISG15多克隆抗體（稀釋度為1:200），37℃孵育1-2h。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次10min。加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1:500），37℃避光孵育1-2h。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次10min。加入DAPI染液，室溫避光染色5-10min，染細(xì)胞核。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次10min。在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，觀察ISG15與豬瘟病毒在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，判斷兩者是否存在共定位現(xiàn)象，進(jìn)一步驗(yàn)證它們之間的相互作用。5.2免疫沉淀實(shí)驗(yàn)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)是研究蛋白質(zhì)相互作用的重要技術(shù)手段，本實(shí)驗(yàn)利用制備的ISG15多克隆抗體對豬瘟病毒感染的細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀，以探究ISG15與豬瘟病毒之間是否存在直接相互作用。將PK-15細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種[X]個細(xì)胞，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO?條件下培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到70%-80%。用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，以去除培養(yǎng)基中的血清成分。按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為1的比例，加入豬瘟病毒石門株感染PK-15細(xì)胞，在37℃條件下吸附1h，期間每隔15min輕輕搖晃培養(yǎng)板，使病毒與細(xì)胞充分接觸。吸附結(jié)束后，棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。分別在感染后0h、3h、6h、12h、24h、48h收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。收集感染不同時間點(diǎn)的PK-15細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。向每孔細(xì)胞中加入150μl含1mMPMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30min，期間每隔5min輕輕搖晃培養(yǎng)板，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15min，收集上清，即為細(xì)胞裂解液。取適量細(xì)胞裂解液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，以確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所需的蛋白量。在細(xì)胞裂解液中加入適量的ISG15多克隆抗體（抗體與細(xì)胞裂解液中蛋白的質(zhì)量比為1:50），輕輕混勻，4℃孵育過夜，使抗體與ISG15蛋白及其相互作用的豬瘟病毒蛋白充分結(jié)合。加入30μlProteinA/G磁珠，4℃繼續(xù)孵育2h，期間每隔15min輕輕搖晃離心管，使磁珠與抗體-抗原復(fù)合物充分結(jié)合。將離心管置于磁力架上，靜置2min，待磁珠吸附在管壁上后，小心吸去上清。用預(yù)冷的PBS洗滌磁珠5次，每次洗滌時，將磁珠重懸于500μlPBS中，4℃、3000rpm離心3min，棄去上清，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。向洗滌后的磁珠中加入50μl2×上樣緩沖液，充分混勻，100℃煮沸5min，使蛋白變性，從磁珠上洗脫下來。將洗脫后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，按照常規(guī)的SDS-PAGE電泳方法進(jìn)行操作，將蛋白Marker和蛋白樣品加入到凝膠的加樣孔中，在120V恒壓條件下進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用半干轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為15V、30min。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2h，以減少非特異性結(jié)合。加入ISG15多克隆抗體（稀釋度為1:1000），4℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-4次，每次10min，以去除未結(jié)合的抗體。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1:5000），室溫孵育1-2h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-4次，每次10min。最后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。如果在免疫沉淀樣品中檢測到豬瘟病毒蛋白條帶，則表明ISG15與豬瘟病毒之間存在相互作用。5.3檢測與分析在完成免疫沉淀實(shí)驗(yàn)后，對免疫沉淀物進(jìn)行了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臋z測與分析，以深入探究ISG15與豬瘟病毒之間的相互作用關(guān)系。采用Westernblot技術(shù)對免疫沉淀樣品進(jìn)行檢測，旨在確定免疫沉淀是否成功捕獲到與ISG15相互作用的豬瘟病毒蛋白。將免疫沉淀得到的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。經(jīng)過封閉、一抗孵育（使用ISG15多克隆抗體）、二抗孵育（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗）以及ECL化學(xué)發(fā)光等一系列操作后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。若在免疫沉淀樣品的泳道中，檢測到與豬瘟病毒蛋白分子量相對應(yīng)的條帶，且該條帶在未進(jìn)行免疫沉淀的對照組中未出現(xiàn)，那么這就有力地表明ISG15與豬瘟病毒之間存在直接的相互作用，ISG15多克隆抗體成功地捕獲到了與ISG15結(jié)合的豬瘟病毒蛋白。運(yùn)用免疫熒光技術(shù)，對豬瘟病毒感染的PK-15細(xì)胞進(jìn)行檢測，以直觀地觀察ISG15與豬瘟病毒在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，進(jìn)一步驗(yàn)證兩者的相互作用。將PK-15細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)至合適的匯合度后，用豬瘟病毒石門株進(jìn)行感染。在感染后的不同時間點(diǎn)，對細(xì)胞進(jìn)行固定、破膜、封閉等處理，然后依次加入ISG15多克隆抗體和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗進(jìn)行孵育，最后用DAPI染細(xì)胞核。在熒光顯微鏡下觀察，若發(fā)現(xiàn)綠色熒光（代表ISG15）與紅色熒光（可通過標(biāo)記豬瘟病毒蛋白實(shí)現(xiàn)）在細(xì)胞內(nèi)存在明顯的共定位區(qū)域，即兩種熒光信號在某些部位相互重疊，這就意味著ISG15與豬瘟病毒在細(xì)胞內(nèi)存在共定位現(xiàn)象，從而進(jìn)一步支持了兩者存在相互作用的結(jié)論。通過免疫熒光技術(shù)，不僅能夠驗(yàn)證ISG15與豬瘟病毒的相互作用，還能從細(xì)胞水平直觀地展示它們在細(xì)胞內(nèi)的分布和相互作用的位置關(guān)系，為深入理解兩者的相互作用機(jī)制提供了重要的可視化證據(jù)。對不同感染時間點(diǎn)的免疫沉淀結(jié)果進(jìn)行對比分析，以揭示ISG15與豬瘟病毒相互作用的動態(tài)變化規(guī)律。在豬瘟病毒感染PK-15細(xì)胞后的0h、3h、6h、12h、24h、48h等時間點(diǎn)分別進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，并對免疫沉淀物進(jìn)行Westernblot檢測。通過分析不同時間點(diǎn)檢測到的豬瘟病毒蛋白條帶的強(qiáng)度變化，可以了解到ISG15與豬瘟病毒相互作用的強(qiáng)弱隨時間的變化情況。若在感染初期（如3h、6h），豬瘟病毒蛋白條帶較弱，隨著感染時間的延長（如12h、24h），條帶強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，而后在48h時條帶強(qiáng)度又有所下降，這可能表明在感染初期，ISG15與豬瘟病毒的相互作用較弱，隨著病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和增殖，兩者的相互作用逐漸增強(qiáng)，但在感染后期，可能由于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化或其他因素的影響，相互作用又有所減弱。這種動態(tài)變化分析有助于深入了解豬瘟病毒感染過程